Summary

Förberedelse och tillämpningar av Organotypic Thymic Slice kulturer

Published: August 06, 2016
doi:

Summary

Vi beskriver framställningen av tymiska segment som, i kombination med flödescytometri, kan användas för att modellera positiv och negativ selektion av att utveckla T-celler. Tymiska skivor kan även anpassas för in situ-analys av tymocyt migration, lokalisering, och signalering via immunofluorescens och två-foton mikroskopi.

Abstract

Tymus urval fortskrider i en unik och mycket organiserad tymus mikroresulterar i genereringen av en funktionell, själv tolerant T-cellrepertoar. In vitro-modeller för att studera T härstamning engagemang och utveckling har gett värdefulla insikter i denna process. Emellertid är dessa system saknar den fullständiga tredimensionella tymisk milieu nödvändig för T-cellsutveckling och, därför, är ofullständiga approximationer av in vivo tymus urval. Några av utmaningarna i samband med cellutveckling modellering T kan övervinnas genom att använda in situ-modeller som ger en intakt tymus mikro som fullt ut stöder tymus val att utveckla T-celler. Tymus skiva organotypic kulturer komplettera befintlig in situ tekniker. Tymiska skivor bevara integriteten av tymiska kortikala och medullära regioner och tillhandahålla en plattform för att studera utvecklingen av överlagrade tymocyter av en definierad utvecklingsstadiet eller av endogena T ^alnar inom en mogen tymus mikromiljö. Ges möjlighet att generera ~ 20 skivor per mus, tymiska skivor presentera en unik fördel när det gäller skalbarhet för hög genomströmning experiment. Vidare, den relativa lätthet att generera tymiska skivor och potential att överlagra olika tymiska grupper eller andra cellpopulationer från olika genetiska bakgrunder ökar mångsidigheten hos denna metod. Här beskriver vi ett protokoll för framställning av tymus skivor, isolering och överlagring av tymocyter och dissociation av tymiska skivor för flödescytometrisk analys. Detta system kan också anpassas för att studera icke-konventionella T-cellutveckling samt visualisera tymocyt migration, tymocyt-stromal cellinteraktioner, och TCR signaler som är associerade med tymus urval av två-foton mikroskopi.

Introduction

T-celler differentierar genom en serie av utvecklingsmässiga mellanprodukter i tymus under vilken tid de stöter på flera kontrollpunkter som säkerställer alstringen av en funktionell, självtoleranta T-cellrepertoar 1-3. Positiv selektion gynnar överlevnaden av tymocyter med T-cellreceptorer (TCR) förmåga att känna igen, med låg till måttlig affinitet, peptid som presenteras av MHC molekyler (MHC) på kortikala tymiska epitelceller (CTEC) 2,3. Negativ selektion och regulatoriska T (T reg) cell utveckling bidra till upprättandet av självtolerans genom att undanröja eller avledning av tymocyter som svarar starkt själv peptid presenteras av MHC 2,4. Omogna CD4 + CD8 + dubbel positiv (DP) tymocyter uttrycker TCR som passerar urvalsprocessen differentierar till mogna T-cellspopulationer, varav de flesta är MHC klass I-begränsade CD8 + cytotoxiskaeller MHC klass II-begränsade CD4 + hjälpar enstaka positiva (SP) T-celler, innan du lämnar tymus att utföra effektorfunktioner i sekundära lymfoida organ 1-3.

Lägga till komplexiteten i T-cellutveckling är den dynamiska migration och cellulära möten att utveckla tymocyter hela stromaceller nätet 5-9. Dessa stromaceller spelar olika roller i tymocyt utveckling och differentiellt fördelade mellan tymiska kortikala och medullära regioner där positiva och negativa urval förekommer 10. Även positiv selektion sker främst i hjärnbarken finns ackumulerande bevis för att DP tymocyter migrera till märgen och fortsätta att kräva TCR signaler innan de differentierar till mogna T-celler tyder på att märgen kan ge ytterligare signaler som är nödvändiga för slutförandet av positiv selektion och härstamning differentiering 11,12. Ytterligare,trots närvaron av specialiserade märg tymiska epitelceller (MTEC) som uttrycker och nuvarande vävnadsbegränsade antigener underlättar radering av autoreaktiva tymocyter 13,14, sker en stor del av negativ selektion i hjärnbarken som svar på ubiquitously uttryckt själv peptid presenteras av dendritiska celler 15,16. Således måste noggranna modeller av T-cellsutveckling ger en mycket organiserad tymus mikro, med intakt kortikala och medullära regioner, som underlättar samverkan mellan tymocyter och stromaceller och stöder tymocyt migration dessa celler genomgå positiv och negativ selektion.

Att komplettera ex vivo-analyser av tymocyter som ett sätt att studera positiva och negativ selektion, ett antal in vitro, in situ, och in vivo-modeller av T-cellutveckling har utvecklats 17-22. Det har varit notoriskt svårt att sammanfattapositiv urvals in vitro, men samodling av stamcellspopulationer eller T-cellsföregångare med stromala celler som uttrycker Notch-ligand, särskilt OP9-DL1 / 4-celler, har förmågan att stödja T härstamning engagemang och begränsad positiv selektion gör det en ovärderlig in vitro modell studien T-cellutveckling 23-25. Begränsningar i detta system omfattar dock det faktum att dessa celler saknar den unika peptidbearbetning maskiner som finns i tymus stromaceller och tredimensionella tymus mikromiljö.

Även mer tekniskt besvärligt, in situ och in vivo-modeller av tymus val kan övervinna några av de hinder i samband med in vitro-system. Reaggregate tymiska organkulturer (RTOC) innehåller definierade blandningar av tymocyter och tymus stromaceller 18,26,27. Dessa tymiska epitelceller reaggregates upprätthålla MHC klass I och II uttryck och kan stödja development av både konventionella cellgrupper T, men ändå saknar definierade kortikala och medullära strukturer. Fetal tymus organkultur (FTOC) är en populär modell av T-cellutveckling som kan ympas med tymocyter via hängande-droppe kultur lymphodepleted tymiska lober eller via injektion av tymocyter i lymphoreplete thymic lober och stödja en effektiv utveckling av CD4 + och CD8 + T celler över tiden i kultur 18,28-31. Vid initiering av kulturen i foster tymiska lober finns en brist på mTECs, men definierade kortikala och medullära strukturer kan utvecklas över tiden beroende på förhållandena. En viktig faktor är att denna modell företrädesvis kan stödja foster kontra vuxen T-cellsutveckling. Slutligen är intratymisk injektion av definierade thymic prekursorer i vuxna möss tekniskt utmanande men klart ger en miljö för att stödja T-cellutveckling in vivo. Dessa in situ och in vivo-modeller är utmärkta verktyg to studie T-cellutveckling och deras användning bör övervägas på ett experiment-by-försök tillämpa.

Tymiska skivor, men har nyligen dykt upp som en mångsidig, kompletterande modell för att studera tymus urval in situ med möjlighet att rymma unik, komplex och generellt högre genomströmning experiment. Tymiska skivor bibehålla integriteten av kortikala och medullära regioner och ger en ram för stromaceller som stöder tymocyt migration under utveckling samt effektiv positiv och negativ selektion 11,32-39. Tymocyt grupper läggs ovanpå tymiska skivor vandrar in i vävnaden och deras lämplig microenvironmental nisch 34,37. De överlagrade tymocyter kan skiljas från tymus skiva endogena celler via kongena markörer eller fluorescerande märkningar och kan upprätthållas i odling under flera dagar. Tymisk slice organotypiska kulturer kan användas för att studera olika aspekterav T-cellutveckling inklusive tymus urval, tymocyt beteende (migration och cellulära interaktioner) och tymocyt lokalisering, bland andra. Ges möjlighet att generera ~ 20 tymiska skivor per mus, är skalbarheten experiment i allmänhet större än andra in situ modeller av tymus val. Även om framställningen av tymiska skivor kräver specialiserad utrustning, såsom vibratome, och livslängden hos tymiska skivor i kultur är begränsad på grund av förlust av celler över tiden via celldöd och avsaknaden av ett inkapslingsmembran, tymiska skivor ger en utmärkt modell för analys av tymus urval av synkroniserade populationer av tymocyter inom en mogen tymus mikromiljö. Här beskriver vi framställningen av tymiska skivor (inklusive skörd tymus, agaros inbäddning av tymus lober och vibratome sektionering av den inbäddade vävnaden), isolering och överdrogos tymocyter, och dissociation av tymiska skivor för flödescytometrisk analys.

Protocol

Protokoll för alla djurstudier godkändes av Animal Care kommittén vid Centre de recherche – Hôpital Maisonneuve-Rosemont. 1. Skörd Mouse Thymus för framställning av tymus skivor och enkelcellsuspensioner Avliva musen med CO2 följt av cervikal dislokation. I en huv med laminärt flöde, stift musen ventrala sidan upp till en dissektion kortet. Spraya musen med 70% etanol. Ta bort överflödigt alkohol genom att badda med gasväv för att förhindra etanol från att komma in…

Representative Results

Tymus skivor stöd analys av olika aspekter av T-cellsutveckling som positiv och negativ selektion. För lyckade experiment, är kvaliteten på den tymus-skiva av största vikt. Därför bör tymiska skivor granskas för att säkerställa integriteten för tymusvävnad och att agarosen omger tymus skiva är intakt (Figur 1A). Ytspänning kan äventyras när agarosen skadas vilket orsakar en signifikant minskning av antalet tymocyter som migrerar in i v…

Discussion

Här beskriver vi ett protokoll för beredning av tymiska skivor och representativa resultat av effektiv positiv och negativ selektion av överlagrade urvals MHC klass I-begränsad TCR transgena tymocyter med flödescytometri. Detta system har använts med liknande framgång för att stödja positiv selektion av MHC klass II-begränsade CD4 + T-celler från förvals DP tymocyter 32, och, i närvaro av agonist-antigen, negativ selektion och tymisk T reg utveckling 11,12, 36,38,39,43,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Josée Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1<tmMom> #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) and Hôpital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.

Materials

Vibratome Leica Biosystems VT1000S 
NuSieve GTG Agarose Lonza 50080 Low melting temperature agarose
Embedding Mold (Truncated – T12) Polyciences 18986 22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm
Double Edge Prep Blades Personna 74-0002
Tissue Adhesive 3M  1469SB
0.4 µm Cell Culture Inserts  BD Falcon 353090 Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher 21600-010
RPMI-1640 with L-glutamine Wisent 350-000-CL
Fetal Bovine Serum Wisent 080-110 Heat inactivated
L-Glutamine, 200mM Wisent 609-065-EL
Penicillin/Streptomycin, 100X Wisent 450-201-EL
2-Mercaptoethanol Alfa Aesar A15890
15 ml Tenbroeck Tissue Grinders Wheaton 357426
Nylon Mesh Filter Component Supply U-CMN-255
Microcentrifuge Tube Sample Pestle Bel-Art F19922-0000
40 µm Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340
Forceps Inox Tip Dumont  RS-5047 Fine tip curved forceps, size .17 X .10mm 
Micro Forceps Dumont  RS-5090 

References

  1. Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).
  2. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
  3. Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen. Immunity. 41, 181-190 (2014).
  4. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).
  5. Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
  6. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
  7. Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. Tracking migration during human T cell development. Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).
  8. Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns. Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).
  9. Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
  10. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).
  11. Ross, J. O., et al. Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).
  12. Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance. J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).
  13. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
  14. Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163, 975-987 (2015).
  15. McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).
  16. Stritesky, G. L., et al. Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).
  17. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development. Immunology. 100, 405-410 (2000).
  18. Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. In vitro models of T cell development. Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).
  19. de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach. Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).
  20. Lian, Z., et al. Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells. Stem Cells. 15, 430-436 (1997).
  21. Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).
  22. Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors. J Exp Med. 163, 1-17 (1986).
  23. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  24. de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).
  25. Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells. J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).
  26. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. J Vis Exp. (18), (2008).
  27. Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro. J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).
  28. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
  29. Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus. J Exp Med. 173, 539-547 (1991).
  30. Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments. J Exp Med. 155, 617-622 (1982).
  31. Fairchild, P. J., Austyn, J. M. Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells. Immunology. 85, 292-298 (1995).
  32. Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).
  33. Le Borgne, M., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).
  34. Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
  35. Ueda, Y., et al. Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus. Nat Commun. 3, 1098 (2012).
  36. Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection. PLoS Biol. 11, e1001566 (2013).
  37. Halkias, J., et al. Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ. J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).
  38. Au-Yeung, B. B., et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).
  39. Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ. Sci Signal. 6, (2013).
  40. Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry. J Vis Exp. (68), e4269 (2012).
  41. Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68, 869-877 (1992).
  42. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  43. Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition. Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).
  44. Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection. J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).
  45. Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
  46. Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo. Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).

Play Video

Cite This Article
Sood, A., Dong, M., Melichar, H. J. Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (114), e54355, doi:10.3791/54355 (2016).

View Video