Förberedelse och tillämpningar av Organotypic Thymic Slice kulturer

Summary

Vi beskriver framställningen av tymiska segment som, i kombination med flödescytometri, kan användas för att modellera positiv och negativ selektion av att utveckla T-celler. Tymiska skivor kan även anpassas för in situ-analys av tymocyt migration, lokalisering, och signalering via immunofluorescens och två-foton mikroskopi.

Abstract

Tymus urval fortskrider i en unik och mycket organiserad tymus mikroresulterar i genereringen av en funktionell, själv tolerant T-cellrepertoar. In vitro-modeller för att studera T härstamning engagemang och utveckling har gett värdefulla insikter i denna process. Emellertid är dessa system saknar den fullständiga tredimensionella tymisk milieu nödvändig för T-cellsutveckling och, därför, är ofullständiga approximationer av in vivo tymus urval. Några av utmaningarna i samband med cellutveckling modellering T kan övervinnas genom att använda in situ-modeller som ger en intakt tymus mikro som fullt ut stöder tymus val att utveckla T-celler. Tymus skiva organotypic kulturer komplettera befintlig in situ tekniker. Tymiska skivor bevara integriteten av tymiska kortikala och medullära regioner och tillhandahålla en plattform för att studera utvecklingen av överlagrade tymocyter av en definierad utvecklingsstadiet eller av endogena T ^alnar inom en mogen tymus mikromiljö. Ges möjlighet att generera ~ 20 skivor per mus, tymiska skivor presentera en unik fördel när det gäller skalbarhet för hög genomströmning experiment. Vidare, den relativa lätthet att generera tymiska skivor och potential att överlagra olika tymiska grupper eller andra cellpopulationer från olika genetiska bakgrunder ökar mångsidigheten hos denna metod. Här beskriver vi ett protokoll för framställning av tymus skivor, isolering och överlagring av tymocyter och dissociation av tymiska skivor för flödescytometrisk analys. Detta system kan också anpassas för att studera icke-konventionella T-cellutveckling samt visualisera tymocyt migration, tymocyt-stromal cellinteraktioner, och TCR signaler som är associerade med tymus urval av två-foton mikroskopi.

Introduction

T-celler differentierar genom en serie av utvecklingsmässiga mellanprodukter i tymus under vilken tid de stöter på flera kontrollpunkter som säkerställer alstringen av en funktionell, självtoleranta T-cellrepertoar ^1-3. Positiv selektion gynnar överlevnaden av tymocyter med T-cellreceptorer (TCR) förmåga att känna igen, med låg till måttlig affinitet, peptid som presenteras av MHC molekyler (MHC) på kortikala tymiska epitelceller (CTEC) ^2,3. Negativ selektion och regulatoriska T (T _reg) cell utveckling bidra till upprättandet av självtolerans genom att undanröja eller avledning av tymocyter som svarar starkt själv peptid presenteras av MHC ^2,4. Omogna CD4 ⁺ CD8 ⁺ dubbel positiv (DP) tymocyter uttrycker TCR som passerar urvalsprocessen differentierar till mogna T-cellspopulationer, varav de flesta är MHC klass I-begränsade CD8 ⁺ cytotoxiskaeller MHC klass II-begränsade CD4 ⁺ hjälpar enstaka positiva (SP) T-celler, innan du lämnar tymus att utföra effektorfunktioner i sekundära lymfoida organ ^1-3.

Lägga till komplexiteten i T-cellutveckling är den dynamiska migration och cellulära möten att utveckla tymocyter hela stromaceller nätet ^5-9. Dessa stromaceller spelar olika roller i tymocyt utveckling och differentiellt fördelade mellan tymiska kortikala och medullära regioner där positiva och negativa urval förekommer ^10. Även positiv selektion sker främst i hjärnbarken finns ackumulerande bevis för att DP tymocyter migrera till märgen och fortsätta att kräva TCR signaler innan de differentierar till mogna T-celler tyder på att märgen kan ge ytterligare signaler som är nödvändiga för slutförandet av positiv selektion och härstamning differentiering ^11,12. Ytterligare,trots närvaron av specialiserade märg tymiska epitelceller (MTEC) som uttrycker och nuvarande vävnadsbegränsade antigener underlättar radering av autoreaktiva tymocyter ^13,14, sker en stor del av negativ selektion i hjärnbarken som svar på ubiquitously uttryckt själv peptid presenteras av dendritiska celler ^15,16. Således måste noggranna modeller av T-cellsutveckling ger en mycket organiserad tymus mikro, med intakt kortikala och medullära regioner, som underlättar samverkan mellan tymocyter och stromaceller och stöder tymocyt migration dessa celler genomgå positiv och negativ selektion.

Att komplettera ex vivo-analyser av tymocyter som ett sätt att studera positiva och negativ selektion, ett antal in vitro, in situ, och in vivo-modeller av T-cellutveckling har utvecklats ^17-22. Det har varit notoriskt svårt att sammanfattapositiv urvals in vitro, men samodling av stamcellspopulationer eller T-cellsföregångare med stromala celler som uttrycker Notch-ligand, särskilt OP9-DL1 / 4-celler, har förmågan att stödja T härstamning engagemang och begränsad positiv selektion gör det en ovärderlig in vitro modell studien T-cellutveckling ^23-25. Begränsningar i detta system omfattar dock det faktum att dessa celler saknar den unika peptidbearbetning maskiner som finns i tymus stromaceller och tredimensionella tymus mikromiljö.

Även mer tekniskt besvärligt, in situ och in vivo-modeller av tymus val kan övervinna några av de hinder i samband med in vitro-system. Reaggregate tymiska organkulturer (RTOC) innehåller definierade blandningar av tymocyter och tymus stromaceller ^18,26,27. Dessa tymiska epitelceller reaggregates upprätthålla MHC klass I och II uttryck och kan stödja development av både konventionella cellgrupper T, men ändå saknar definierade kortikala och medullära strukturer. Fetal tymus organkultur (FTOC) är en populär modell av T-cellutveckling som kan ympas med tymocyter via hängande-droppe kultur lymphodepleted tymiska lober eller via injektion av tymocyter i lymphoreplete thymic lober och stödja en effektiv utveckling av CD4 ⁺ och CD8 ⁺ T celler över tiden i kultur ^18,28-31. Vid initiering av kulturen i foster tymiska lober finns en brist på mTECs, men definierade kortikala och medullära strukturer kan utvecklas över tiden beroende på förhållandena. En viktig faktor är att denna modell företrädesvis kan stödja foster kontra vuxen T-cellsutveckling. Slutligen är intratymisk injektion av definierade thymic prekursorer i vuxna möss tekniskt utmanande men klart ger en miljö för att stödja T-cellutveckling in vivo. Dessa in situ och in vivo-modeller är utmärkta verktyg to studie T-cellutveckling och deras användning bör övervägas på ett experiment-by-försök tillämpa.

Tymiska skivor, men har nyligen dykt upp som en mångsidig, kompletterande modell för att studera tymus urval in situ med möjlighet att rymma unik, komplex och generellt högre genomströmning experiment. Tymiska skivor bibehålla integriteten av kortikala och medullära regioner och ger en ram för stromaceller som stöder tymocyt migration under utveckling samt effektiv positiv och negativ selektion ^11,32-39. Tymocyt grupper läggs ovanpå tymiska skivor vandrar in i vävnaden och deras lämplig microenvironmental nisch ^34,37. De överlagrade tymocyter kan skiljas från tymus skiva endogena celler via kongena markörer eller fluorescerande märkningar och kan upprätthållas i odling under flera dagar. Tymisk slice organotypiska kulturer kan användas för att studera olika aspekterav T-cellutveckling inklusive tymus urval, tymocyt beteende (migration och cellulära interaktioner) och tymocyt lokalisering, bland andra. Ges möjlighet att generera ~ 20 tymiska skivor per mus, är skalbarheten experiment i allmänhet större än andra in situ modeller av tymus val. Även om framställningen av tymiska skivor kräver specialiserad utrustning, såsom vibratome, och livslängden hos tymiska skivor i kultur är begränsad på grund av förlust av celler över tiden via celldöd och avsaknaden av ett inkapslingsmembran, tymiska skivor ger en utmärkt modell för analys av tymus urval av synkroniserade populationer av tymocyter inom en mogen tymus mikromiljö. Här beskriver vi framställningen av tymiska skivor (inklusive skörd tymus, agaros inbäddning av tymus lober och vibratome sektionering av den inbäddade vävnaden), isolering och överdrogos tymocyter, och dissociation av tymiska skivor för flödescytometrisk analys.

Protocol

Protokoll för alla djurstudier godkändes av Animal Care kommittén vid Centre de recherche – Hôpital Maisonneuve-Rosemont. 1. Skörd Mouse Thymus för framställning av tymus skivor och enkelcellsuspensioner Avliva musen med CO2 följt av cervikal dislokation. I en huv med laminärt flöde, stift musen ventrala sidan upp till en dissektion kortet. Spraya musen med 70% etanol. Ta bort överflödigt alkohol genom att badda med gasväv för att förhindra etanol från att komma in…

Representative Results

Tymus skivor stöd analys av olika aspekter av T-cellsutveckling som positiv och negativ selektion. För lyckade experiment, är kvaliteten på den tymus-skiva av största vikt. Därför bör tymiska skivor granskas för att säkerställa integriteten för tymusvävnad och att agarosen omger tymus skiva är intakt (Figur 1A). Ytspänning kan äventyras när agarosen skadas vilket orsakar en signifikant minskning av antalet tymocyter som migrerar in i v…

Discussion

Här beskriver vi ett protokoll för beredning av tymiska skivor och representativa resultat av effektiv positiv och negativ selektion av överlagrade urvals MHC klass I-begränsad TCR transgena tymocyter med flödescytometri. Detta system har använts med liknande framgång för att stödja positiv selektion av MHC klass II-begränsade CD4 ⁺ T-celler från förvals DP tymocyter ^32, och, i närvaro av agonist-antigen, negativ selektion och tymisk T _reg utveckling ^{11,12, 36,38,39,43,…}

Materials

Vibratome	Leica Biosystems	VT1000S
NuSieve GTG Agarose	Lonza	50080	Low melting temperature agarose
Embedding Mold (Truncated – T12)	Polyciences	18986	22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm
Double Edge Prep Blades	Personna	74-0002
Tissue Adhesive	3M	1469SB
0.4 µm Cell Culture Inserts	BD Falcon	353090	Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher	21600-010
RPMI-1640 with L-glutamine	Wisent	350-000-CL
Fetal Bovine Serum	Wisent	080-110	Heat inactivated
L-Glutamine, 200mM	Wisent	609-065-EL
Penicillin/Streptomycin, 100X	Wisent	450-201-EL
2-Mercaptoethanol	Alfa Aesar	A15890
15 ml Tenbroeck Tissue Grinders	Wheaton	357426
Nylon Mesh Filter	Component Supply	U-CMN-255
Microcentrifuge Tube Sample Pestle	Bel-Art	F19922-0000
40 µm Nylon Cell Strainer	BD Falcon	352340
Forceps Inox Tip	Dumont	RS-5047	Fine tip curved forceps, size .17 X .10mm
Micro Forceps	Dumont	RS-5090