Summary

Eccitazione esterna dei neuroni Usando campi elettrici e magnetici in mono e culture bidimensionali

Published: May 07, 2017
doi:

Summary

colture neuronali sono un buon modello per lo studio delle tecniche di stimolazione cerebrale emergenti tramite il loro effetto sui singoli neuroni o di una popolazione di neuroni. Qui presentati sono diversi metodi per la stimolazione di colture neuronali modellate da un campo elettrico prodotto direttamente dalla elettrodi bagno o indotto da un campo magnetico variabile nel tempo.

Abstract

Un neurone spara un potenziale d'azione quando il suo potenziale di membrana supera una certa soglia. Nell'attività tipica del cervello, questo si verifica come risultato di ingressi chimici alle sue sinapsi. Tuttavia, i neuroni possono anche essere eccitati da un campo elettrico imposto. In particolare, le recenti applicazioni cliniche attivano i neuroni creando un campo elettrico esternamente. È quindi interessante studiare come il neurone risponda al campo esterno e ciò che provoca il potenziale d'azione. Fortunatamente, un'applicazione precisa e controllata di un campo elettrico esterno è possibile per le cellule neuronali embrionali che vengono escise, dissociate e coltivate in colture. Ciò consente di esaminare queste domande in un sistema altamente riproducibile.

In questo lavoro vengono esaminate alcune delle tecniche utilizzate per l'applicazione controllata del campo elettrico esterno sulle culture neuronali. Le reti possono essere unidimensionali, cioè modellate in linear forme o lasciate crescere su tutto il piano del substrato, e quindi bidimensionale. Inoltre, l'eccitazione può essere creata mediante l'applicazione diretta del campo elettrico tramite elettrodi immersi nel liquido (elettrodi bagno) o inducendo il campo elettrico mediante la creazione remota di impulsi magnetici.

Introduction

L'interazione tra i neuroni e campi elettrici esterni ha implicazioni fondamentali, nonché quelli pratici. Mentre è noto fin dai tempi di Volta che un campo elettrico applicato esternamente può eccitare il tessuto, i meccanismi responsabili per la produzione di un potenziale d'azione risultante in neuroni sono solo di recente iniziando da dipanare 1, 2, 3, 4. Ciò include trovare le risposte alle domande per quanto riguarda il meccanismo che provoca la depolarizzazione del potenziale di membrana, il ruolo di proprietà di membrana e dei canali ionici, e anche la regione nel neurone che risponde al campo elettrico 2, 5. Terapeutico neurostimolazione 6, 7, 8, 9, <supclass = "xref"> 10 metodologie sono particolarmente dipendenti da queste informazioni, che può essere cruciale per il targeting aree colpite e per comprendere l'esito della terapia. Tale comprensione può anche aiutare a sviluppare protocolli di trattamento e nuovi approcci per la stimolazione delle diverse aree del cervello.

Misurare l'interazione all'interno del cervello in vivo aggiunge una componente importante per questa comprensione, ma è ostacolato dalla imprecisione e bassa la controllabilità delle misure all'interno del cranio. Al contrario, le misurazioni in culture possono essere facilmente eseguite in alto volume con alta precisione, eccellente rapporto segnale rumore prestazioni e un elevato grado di riproducibilità e di controllo. Utilizzando colture una grande varietà di proprietà neuronali del comportamento della rete collettiva può essere chiarita 11, 12, 13, 14, </sup> 15, 16. Analogamente, questo sistema ben controllato è prevista essere altamente efficace nel chiarire il meccanismo che altri metodi di stimolazione di lavoro, ad esempio come apertura del canale durante la stimolazione ottico in neuroni optogenetically attive 17, 18, 19 è responsabile della creazione potenziale d'azione.

Qui l'attenzione è rivolta che descriva lo sviluppo e la comprensione di strumenti in grado di eccitare in modo efficiente il neurone tramite un campo elettrico esterno. In questo documento si descrive la preparazione di bidimensionale e unidimensionale colture ippocampali fantasia, stimolazione con diverse configurazioni e l'orientamento di un campo elettrico applicato direttamente dagli elettrodi bagno, e infine stimolazione bidimensionale e modellata culture unidimensionali di un variabili nel tempo del campo magnetico, che induce un campo elettrico5, 20, 21.

Protocol

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono la movimentazione degli animali sono stati fatti in accordo con le linee guida del Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso (IACUC) del Weizmann Institute of Science, e la legge israeliana appropriata. Il Weizmann Institute è accreditato dalla Associazione per la valutazione e l'accreditamento del Laboratorio di Animal Care International (AAALAC). Il Comitato Istituzionale Cura ed uso degli animali Weizmann approvato questo studio, condotto con neuroni dell&#39…

Representative Results

Il protocollo presentato permette una facile patterning di colture neuronali. Quando è combinato con vari metodi che abbiamo sviluppato per la stimolazione, permette di effettuare misurazioni di alcune proprietà neuroni intrinseci quali chronaxie e reobase 5, per confrontare le proprietà di neuroni sani e malati 27, per trovare il modo ottimale per stimolare culture come funzione di la loro struttura e molti altri nuovi approcci. A…

Discussion

Il pattern di 1D è uno strumento importante che può essere utilizzato per una varietà di applicazioni. Per esempio, abbiamo utilizzato il modello 1D per la creazione di gate logici da culture neuronali 29 e più recentemente per misurare la Chronaxie e la Rheobase dei neuroni ippocampali 5 del ratto e il rallentamento della velocità di propagazione del segnale di attività di cottura nei neuroni ippocampali della sindrome di Down rispetto al Neuroni ippocampali di tipo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef e Eitan Reuveny per molto utili discussioni. Gli autori ringraziano Ilan Breskin e Jordi Soriano per sviluppare le prime versioni della tecnologia. Gli autori ringraziano Tsvi Tlusty e Jean-Pierre Eckmann per aiutare con i concetti teorici. Questa ricerca è stata sostenuta dalla Fondazione Minerva, il Ministero della Scienza e della Tecnologia, Israele, e da parte di Israele Science Foundation grant 1320-1309 e la sovvenzione della Fondazione Bi-National Science 2.008.331.

Materials

APV Sigma-Aldrich A8054 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp Gibco 17504-044 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline Sigma-Aldrich 14343 Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate) Sigma-Aldrich S9640 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid Frutarom LTD 5550710 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1M Fluka  21098 Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
CNQX Sigma-Aldrich C239 Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL COMSOL Inc Multiphysics 3.5 Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1M Sigma-Aldrich 65146 Plating medium, Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.1.1    1.5.2
D-PBS Sigma-Aldrich D8537 Cell Cultures. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
FCS(FBS) Gibco 12657-029 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4, AM Life technologies F14201 Imaging of spontaneous or evoked activity . Mentioned in Section 1.5.1    1.5.3    1.5.5
FUDR Sigma-Aldrich F0503 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100X Gibco 35050-038 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1M Sigma-Aldrich H0887 Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
HI HS  BI 04-124-1A Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1    1.4.1    1.4.2
KCl,  3M Merck 1049361000 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin  Sigma-Aldrich L2020 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1 Gibco 21090-022 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1M Sigma-Aldrich M1028 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4M Bio-Lab 19030591 Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol Sigma-Aldrich 01858 Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill BASF Corparation  50475278 Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution  Sigma-Aldrich  P47075 Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1M Sigma-Aldrich S1888 Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Thiol  Sigma-Aldrich 1858 Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE Sigma-Aldrich U3750 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine AJA International, Inc ATC Orion-5Series  coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter  Hewlett Packard  HP 7475A Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires  A-M Systems, Carlsborg WA 767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1    2.2    2.3   2.4.5
Signal generator BKPrecision 4079 Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier Homemade Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply Matrix  MPS-3005 LK-3  Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation Magstim, Spring Gardens, UK Rapid 2 Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.1   3.3   3.4
Epoxy Cognis Versamid 140 Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy Shell EPON 815  Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,   Carlsborg WA  767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil Homemade Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW B&K Precision  Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897 Andor Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4

References

  1. Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
  2. Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
  3. Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
  4. Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
  5. Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577 (2015).
  6. Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
  7. Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
  8. Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, S44-S53 (2009).
  9. Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
  10. Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
  11. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
  12. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
  13. Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
  14. Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
  15. Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
  16. Soriano, J., Rodriguez Martinez, ., Tlusty, M., T, E., Moses, Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
  17. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  18. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  19. Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287 (2013).
  20. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
  21. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
  22. Feinerman, O., Moses, E. A picoliter ‘fountain-pen’ using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
  23. Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
  24. Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
  25. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
  26. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
  27. Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
  28. Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794 (2014).
  29. Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
  30. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  31. Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
  32. Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
  33. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  34. Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680 (2015).
  35. Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).

Play Video

Cite This Article
Stern, S., Rotem, A., Burnishev, Y., Weinreb, E., Moses, E. External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (123), e54357, doi:10.3791/54357 (2017).

View Video