Summary

Externe Anregung von Neuronen mittels elektrische und magnetische Felder in One- und Zweidimensionale Kulturen

Published: May 07, 2017
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Summary

Neuronale Kulturen sind ein gutes Modell für die Untersuchung Schwellen Hirnstimulation Techniken über ihre Wirkung auf die einzelnen Neuronen oder einer Population von Neuronen. Dargestellt hier sind verschiedene Verfahren zur Stimulation von gemusterten neuronalen Kulturen durch ein elektrisches Feld erzeugt wird direkt durch Badelektroden oder induziert durch ein zeitlich veränderliches Magnetfeld.

Abstract

Ein Neuron wird ein Aktionspotential ausgelöst, wenn dessen Membranpotential einen bestimmten Schwellenwert überschreitet. In typischer Aktivität des Gehirns, tritt dies als Ergebnis chemischer Eingänge seine Synapsen. Allerdings Neuronen können auch durch ein auferlegtes elektrisches Feld angeregt werden. Insbesondere aktivieren bisherige klinische Anwendungen Neuronen, die durch ein elektrisches Feld von außen zu schaffen. Es ist daher von Interesse, zu untersuchen, wie das Neuron zum äußeren Feld reagiert und was bewirkt, dass das Aktionspotential. Glücklicherweise ist eine präzise und kontrollierte Anwendung eines externen elektrischen Feldes möglich ist, für die embryonale neuronale Zellen, die herausgeschnitten werden, dissoziiert und in Kulturen gezüchtet. Dies ermöglicht die Untersuchung dieser Fragen in hochreproduzierbarer System.

In diesem Papier einige der Techniken für die kontrollierte Anwendung von externem elektrischem Feld auf neuronalen Kulturen verwendet werden, überprüft. Die Netzwerke können entweder eindimensional sein, dh in linea gemustertr Formen oder auf der gesamten Ebene des Substrats wachsen gelassen, und somit zweidimensional. Darüber hinaus kann die Anregung durch das direkte Anlegen des elektrischen Feldes über die Elektroden in dem Fluid (Badelektroden) oder durch Induzieren des elektrischen Felds unter Verwendung der Fern Schaffung magnetischer Impulse erzeugt wird eingetaucht.

Introduction

Die Wechselwirkung zwischen Neuronen und externen elektrischen Feldern hat sowohl grundlegende Implikationen als auch praktische. Während es seit den Zeiten von Volta bekannt ist, dass ein extern angelegtes elektrisches Feld Gewebe anregen kann, sind die Mechanismen, die für die Produktion eines resultierenden Aktionspotentials in Neuronen verantwortlich sind, erst vor kurzem aufgefangen 1 , 2 , 3 , 4 . Hierbei handelt es sich um Antworten auf Fragen, die den Mechanismus betreffen, der die Depolarisation des Membranpotentials, die Rolle der Membraneigenschaften und der Ionenkanäle und sogar die Region im Neuron, die auf das elektrische Feld 2 , 5 reagiert, verursacht. Therapeutische Neurostimulation 6 , 7 , 8 , 9 , <supclass = „xref“> 10 Methoden sind besonders abhängig von diesen Informationen, die für die Ausrichtung der betroffenen Gebiete von entscheidenden Bedeutung sein kann und das Ergebnis der Therapie für das Verständnis. Ein solches Verständnis kann auch helfen, Behandlungsprotokolle und neue Ansätze zur Stimulation verschiedenen Bereiche im Gehirn zu entwickeln.

Messen der Wechselwirkung innerhalb des invivo – Gehirns fügt eine wichtige Komponente dieses Verständnisses, sondern wird durch die Ungenauigkeit und niedrige Steuerbarkeit der Messungen innerhalb des Schädels behindert. Im Gegensatz dazu können die Messungen in den Kulturen mit hohen Präzision leicht, exzellenten Signal-Rausch-Leistung und einem hohen Grad an Reproduzierbarkeit und der Kontrolle in hohem Volumen durchgeführt werden. Mit Kulturen eine große Vielfalt von neuronalen Eigenschaften des kollektiven Verhalten des Netzwerks können 11 aufgeklärt werden, 12, 13, 14, </sup> 15, 16. In ähnlicher Weise ist dies gut kontrolliert werden , um hocheffiziente System erwartet , dass der Mechanismus in Aufklären , durch die anderen Stimulationsverfahren arbeiten, wie zum Beispiel Kanalöffnung während der optischen Stimulation in optogenetically aktiven Neuronen 17, 18, 19 ist verantwortlich für die Erstellung von Aktionspotential.

Hier liegt der Schwerpunkt auf der Beschreibung der Entwicklung und das Verständnis von Werkzeugen, die effizient das Neuron über ein externes elektrisches Feld anregen kann. In diesem Papier beschreiben wir die Herstellung von zweidimensionaler und eindimensionalen gemusterten hippocampalen Kulturen, Stimulation verschiedene Konfigurationen und Orientierung eines direkt angelegten elektrischen Feld von Badelektroden verwenden und schließlich Stimulation von zweidimensionalen und bemustert eindimensionalen Kulturen nach a zeitlich veränderliches Magnetfeld, das ein elektrisches Feld induziert,5, 20, 21.

Protocol

Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierische Handhabung wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) des Weizmann Institute of Science und dem entsprechenden israelischen Rechts getan. Das Weizmann Institut wird von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) akkreditiert. Das Weiz Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt diese Studie mit Hippocampus-Neuronen durchgeführt. <p class="…

Representative Results

Das dargestellte Protokoll ermöglicht eine einfache Strukturierung von neuronalen Kulturen. Wenn es mit mehreren Methoden kombiniert wird, die wir für die Stimulation entwickelt haben, ermöglicht es, Messungen von einigen intrinsischen Neuroneigenschaften wie Chronaxie und Rheobase 5 durchzuführen, um die Eigenschaften von gesunden und kranken Neuronen zu vergleichen, um optimale Wege zu finden, um Kulturen als Funktion von zu stimulieren Ihre Struktur u…

Discussion

1D Musterung ist ein wichtiges Werkzeug, das für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden kann. Zum Beispiel haben wir 1D Musterung für die Erstellung von Logikgattern aus neuronalen Kulturen 29 und in jüngerer Zeit zu messen , die Chronaxie und die Rheobase von Ratten – Hippocampus – Neuronen 5, und die Verlangsamung der Signalausbreitungsgeschwindigkeit des Brennen Aktivität in Down – Syndrom – Hippocampus – Neuronen im Vergleich zu dem verwendeten Wildtyp (WT…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef und Eitan Reuveny für sehr hilfreiche Diskussionen. Die Autoren danken Ilan Breskin und Jordi Soriano für frühe Versionen der Technologie zu entwickeln. Die Autoren danken Tsvi Tlusty und Jean-Pierre Eckmann für die Hilfe bei den theoretischen Konzepten. Diese Forschung wurde von der Minerva-Stiftung, das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Israel, und Israel Science Foundation Grant 1320-1309 und die Bi-National Science Foundation Grant 2.008.331 unterstützt.

Materials

APV Sigma-Aldrich A8054 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp Gibco 17504-044 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline Sigma-Aldrich 14343 Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate) Sigma-Aldrich S9640 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid Frutarom LTD 5550710 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1M Fluka  21098 Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
CNQX Sigma-Aldrich C239 Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL COMSOL Inc Multiphysics 3.5 Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1M Sigma-Aldrich 65146 Plating medium, Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.1.1    1.5.2
D-PBS Sigma-Aldrich D8537 Cell Cultures. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
FCS(FBS) Gibco 12657-029 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4, AM Life technologies F14201 Imaging of spontaneous or evoked activity . Mentioned in Section 1.5.1    1.5.3    1.5.5
FUDR Sigma-Aldrich F0503 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100X Gibco 35050-038 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1M Sigma-Aldrich H0887 Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
HI HS  BI 04-124-1A Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1    1.4.1    1.4.2
KCl,  3M Merck 1049361000 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin  Sigma-Aldrich L2020 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1 Gibco 21090-022 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1M Sigma-Aldrich M1028 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4M Bio-Lab 19030591 Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol Sigma-Aldrich 01858 Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill BASF Corparation  50475278 Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution  Sigma-Aldrich  P47075 Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1M Sigma-Aldrich S1888 Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Thiol  Sigma-Aldrich 1858 Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE Sigma-Aldrich U3750 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine AJA International, Inc ATC Orion-5Series  coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter  Hewlett Packard  HP 7475A Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires  A-M Systems, Carlsborg WA 767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1    2.2    2.3   2.4.5
Signal generator BKPrecision 4079 Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier Homemade Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply Matrix  MPS-3005 LK-3  Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation Magstim, Spring Gardens, UK Rapid 2 Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.1   3.3   3.4
Epoxy Cognis Versamid 140 Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy Shell EPON 815  Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,   Carlsborg WA  767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil Homemade Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW B&K Precision  Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897 Andor Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4

References

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Cite This Article
Stern, S., Rotem, A., Burnishev, Y., Weinreb, E., Moses, E. External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (123), e54357, doi:10.3791/54357 (2017).

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