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Developmental Biology

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten

Published: November 11, 2016 doi: 10.3791/54375
Automatic Translation
1,2, 3, 4,5, 3,6
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Biochemistry II, Kanazawa Medical University, 3Center for Immunotherapy, Roswell Park Cancer Institute, 4DNAVEC Corporation, 5Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 6Department of Surgical Oncology, Roswell Park Cancer Institute

Abstract

Der adoptive Transfer von ex vivo expandierte autologe Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) können dauerhafte und vollständige Antworten in signifikanten Untergruppen von Patienten mit metastasierendem Melanom vermitteln. Haupthindernisse dieses Ansatzes sind die reduzierte Lebensfähigkeit der übertragenen T-Zellen, durch Verkürzung der Telomere verursacht wird, und die begrenzte Anzahl von TILs von Patienten erhalten. Weniger differenzierte T-Zellen mit langen Telomeren wäre eine ideale T-Zell-Untergruppe für Adoptiv T-Zell-Therapie sein, aber die Erzeugung einer großen Anzahl von diesen weniger differenzierten T-Zellen problematisch ist. Diese Beschränkung der adoptiven T-Zelltherapie kann theoretisch durch Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen), die selbst zu erneuern, halten Pluripotenz, haben verlängert die Telomere, und bieten eine unbegrenzte Quelle autologer T-Zellen für die Immuntherapie überwunden werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll iPSCs zu erzeugen unter Verwendung von Sendai-Virus-Vektoren für die Transduktion von Reprogrammierungsfaktoren in TIL. Dieses Protokoll generierens vollständig neu programmiert, vektorfreie Klone. Diese TIL stamm iPSCs könnte in der Lage sein, zu erzeugen weniger differenzierten Patienten- und tumorspezifische T-Zellen für die adoptive T-Zell-Therapie.

Introduction

Reprogrammierung Technologie , die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS - Zellen) über die Überexpression eines definierten Satz von Transkriptionsfaktoren erlaubt ist sehr vielversprechend im Bereich der zellbasierten Therapien 1,2. Diese iPS - Zellen zeigen Transkriptions und epigenetische Merkmale und haben die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Pluripotenz, ähnlich wie embryonale Stammzellen ( ES- Zellen) 3-5. Bemerkenswerte Fortschritte bei der Reprogrammierung Technologie im letzten Jahrzehnt gemacht hat uns menschliche iPS - Zellen auch aus ausdifferenzierten Zellen, wie T - Zellen 6-8 zu erzeugen , erlaubt. T - Zellen abgeleiteten iPSCs (TiPSCs) die gleiche Konfiguration neu angeordnet T - Zell - Rezeptor (TCR) Kettengene wie die ursprünglichen T - Zellen behalten, die Regeneration von antigen-spezifischen T - Zellen aus TiPSCs 9-11 ermöglicht.

Fast 80% der Melanom-infiltrierenden Lymphozyten (TILs), erhalten von einem Patienten Tumor speziell tumorassoziierten Antigenen erkennen and halten Zytotoxizität gegen den ursprünglichen Krebszellen 12. Bemerkenswerterweise wurde die Expression des programmierten Zelltods protein-1 (PD-1) auf TILs fand die autologe Tumor-reaktiven Repertoire, einschließlich mutierter Neoantigen-spezifischen CD8 + Lymphozyten identifiziert 13. Der adoptive Transfer von Ex-vivo expandierte autologe TIL in Kombination mit präparativen lymphodepleting Regimen und systemische Verabreichung von Interleukin-2 (IL-2) kann in Untergruppen von Patienten 14 erhebliche Regression von metastatischem Melanom verursachen. Trotz Ergebnisse in präklinischen Modellen zu fördern und bei Patienten, schlechte Überleben infundiert T-Zellen und die Existenz von immunsuppressiven Wege erscheinen, das volle Potenzial von Adoptiv T-Zell-Therapie nicht zu gefährden. Aktuelle klinische Protokolle erfordern umfangreiche ex vivo Manipulation von autologe T - Zellen, um eine große Zahl zu erhalten. Dies resultiert in der Erzeugung von terminal differenzierten T-Zellen, die eine schlechte Überleben haben, reduziert proliferative Kapazität und ein hohes Maß an PD-1 15.

Diese Beschränkung der adoptiven T-Zelltherapie kann theoretisch durch Verwendung von iPS-Zellen überwunden werden, die eine unbegrenzte Quelle autologer T-Zellen für die Immuntherapie zur Verfügung stellen kann. Wir haben vor kurzem berichtet , die Umprogrammierung von Melanomen TIL, die hohe Niveaus von PD-1 von Sendai - Virus (SeV) vermittelter Transduktion der vier Transkriptionsfaktoren, OCT3 / 4, SOX2, KLF4 und c-MYC 16. Während Retrovirusvektoren Integration in Wirtschromosomen erfordern Umprogrammierung Gene, SeV Vektoren sind zum Ausdruck bringen nicht-integrierenden und werden schließlich aus dem Zytoplasma eliminiert. Umprogrammieren Effizienz ist viel höher mit einem SeV - System im Vergleich mit Lentiviren oder Retrovirusvektoren 6-8. Weiterhin kann SeV spezifisch T - Zellen in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) umprogrammieren, während einige iPSC Klone durch Lentivirus oder Retrovirus - Vektoren erzeugt aus nichtlymphoiden Linien 6-8 sein kann. Hier stellen wir Detaildie Verfahren zur Isolierung und Aktivierung von menschlichen Melanom TILs und zur Erzeugung von TIL stamm iPSCs unter Verwendung eines SeV Umprogrammierung System implementiert.

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Protocol

HINWEIS: Die Patienten sollten informierte Zustimmung geben in den pluripotenten Institutional Review Board und Menschliche Zelle Ausschuss Stem Studie genehmigt teilzunehmen.

1. Isolierung und Kultur von TIL

  1. Erhalten Tumormaterial, das für die histopathologische Diagnose aus der Pathologie Service / Gewebebeschaffung Kern nicht erforderlich ist. Platzieren 20-100 g Tumorproben in einer 50-ml - Röhrchen mit 30 ml Tumorsammelmedium (Tabelle 1).
  2. Präparieren Sie fest, fest, normales Gewebe der Tumorprobe von zerbrechlichen und / oder blutiger Nekrosen mit einer Schere. Nach dem nekrotischen Gewebes zu entfernen, verwenden Sie die Schere, um die Probe so klein wie möglich zu Hackfleisch.
  3. Dissoziieren Das zerkleinerte Probe in eine Einzelzellsuspension ein Dissociator und Tumor Dissoziation Kit (human) nach den Anweisungen des Herstellers. Filtern Sie die Suspension mit einer 70 & mgr; m Zellsieb, die auf einem 50-ml-Röhrchen gesetzt und waschen Sie das Sieb 2 mal mit2 ml RPMI 1640.
  4. Zentrifuge bei 200 × g bei Raumtemperatur für 5 min. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 10 ml T - Zell - Medium (Tabelle 1).
  5. Vorbereiten eines zweistufigen Gradienten Lösung wie Ficoll (Gradient Lösung) in einem 50-ml-Röhrchen, mit einer unteren Stufe von 10 ml 100% -Gradienten-Lösung und einer mittleren Stufe aus 30 ml 75% Gradienten-Lösung mit Dulbeccos phosphatgepufferter verdünnt gepufferte Salzlösung, kein Kalzium, kein Magnesium (D-PBS (-)).
  6. Schicht, die die Zellsuspension (aus Schritt 1.4) auf dem Gradienten-Lösung (aus Schritt 1.5). Zentrifuge bei 400 × g bei 20 ° C für 45 min.
  7. Sammeln Sie die Schicht der angereicherten TILs an der Grenzfläche zwischen dem 100% Gradienten-Lösung und 75% Gradienten-Lösung in einem 50 ml Röhrchen mit. Verdünne die Schicht der Lösung mit den angereicherten TILs durch Zugabe von 20-30 ml D-PBS (-).
  8. Zentrifuge bei 200 × g bei Raumtemperatur für 5 min. Überstand verwerfen und resuspendieren TIL angereicherte Fraktion in 10 mlder T-Zellmedium.
  9. Kultur die Fraktion (aus Schritt 1.8) mit 2 ml der T - Zellmedien und 6000 IU / ml rekombinantes menschliches (rh) IL-2 in einer 6-Well - Platte bei 37 ° C, 5% CO 2.
  10. Ändern Sie die Hälfte der Medien am Tag 5 nach Kulturbeginn und alle 2-3 Tage danach.
  11. Aufgeteilt, die Zellen in einem Verhältnis von 1: 2 ohne Trypsinisierung nach sanft Suspendieren Verdoppelung der Anzahl der Vertiefungen, wenn 80-90% Konfluenz erreichen. Fügen Sie eine halbe Volumen (1 ml) von frischen T-Zell-Medien und rhIL-2 bei 6.000 IU / ml.

2. Herstellung von Mitomycin-C-behandelten SNL Feeder Zellen-Platte

  1. Kultur SNL feeder - Zellen in 10 ml von SNL feeder Zellmedien (Tabelle 1) auf einem 0,1% Gelatine beschichteten 10 - cm - Schale , bis 80-90% Konfluenz (3-4 x 10 6 Zellen) erreicht ist .
  2. In 310 ul von 0,4 mg / ml Mitomycin C - Lösung direkt in die SNL Feeder - Zellkulturschale und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2 für 2 Stunden und 15 Minuten. Saugen Sie das Medium einnd die Zellen werden zweimal mit 5 ml D-PBS (-).
  3. 0,5 ml von 0,25% Trypsin / 1 mM EDTA und Inkubation für 1 min bei Raumtemperatur, um die Zellen dissoziiert. In 4,5 ml SNL Feeder-Zellmedien zu neutralisieren und resuspendieren die Zellen in einer einzigen Suspension.
  4. Übertragen Sie die Zellen in eine 15-ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 200 g für 5 min. Aspirieren die Medien und Zählen der Zellen mit einem Hämozytometer nach Resuspendieren in 10 ml SNL Feeder-Zellmedien.
  5. Platte 1,5 x 10 6 Zellen pro Vertiefung der SNL - Feeder - Zellen auf einer 10 cm Schüssel und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2. Verwenden Sie die SNL-Feeder-Zellen innerhalb von 3 Tagen.

3. Erzeugung von iPS-Zellen Verwendung des Sendai-Virus (SeV) Vector

  1. Ernten Sie die TIL (aus Schritt 1.11) und aktivieren 5 x 10 5 Zellen von TIL mit plattengebundenen Maus anti-human CD3 (1 ug / ml) und löslichen Maus - Anti-Human - CD28 (5 ug / ml), mit rhIL-2 (6000 IU / ml) in 2 ml T-Zell-Medium in einer Platte mit 6 Vertiefungen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 5 Tage.
  2. Ernten Sie die TIL (aus Schritt 3.1) in einem 15-ml-Röhrchen mit einer Pipette und die Zellzahl mit einem Hämozytometer zählen.
  3. Reaktivieren 1 x 10 5 Zellen von TILs mit Platte-gebundenen Maus - anti-human CD3 (1 & mgr; g / ml) und löslichem Maus anti-human CD28 (5 & mgr; g / ml), mit rhIL-2 (60 IU / ml) in 500 ul der Reprogrammierung Medien (Tabelle 1) pro Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 24 Std. Bereiten Sie 3 Brunnen für SeV Infektion: OCT3 / 4, SOX2, KLF4 und c-MYC (1 gut); SeV-Infektion (GFP: grün fluoreszierendes Protein) (1 gut); und Zellzahl (1 gut).
  4. Nach 24 Stunden (aus Schritt 3.3), die Zellzahl mit einem Hämozytometer zählen und das Volumen jedes Virus für verschiedene (3-20) Multiplizitäten der Infektion (MOI) bestimmen. Entfernen Sie eine Reihe von Vektor-Rohre Sendai-Virus von -80 ° C-Lagerung. Auftauen SeV Vektoren schnell in einem Wasserbad (37 ° C) und legen Sie sie auf Eis.
    Volumen-Virus (ul)= MOI (CIU / Zelle) x Anzahl der Zellen / Titer des Virus (CIU / ml) × 10-3 (ul / ml)
  5. Die berechnete Volumina jeder der vier Sendai-Virus-Vektor Rohre, die einzeln durch OCT3 / 4, SOX2, KLF4 und c-MYC, indem eine Mischung von SeV Vektoren bei 10-20 MOI in die Medien Zugabe einschließlich aktivierten TILs.
  6. Um die Transduktionseffizienz zu bestimmen müssen die berechneten Volumina von SeV-GFP in eine Vertiefung aktiviert TIL.
  7. Die Schale (aus Schritt 3.5 und Schritt 3.6) im Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 für 24 Stunden. Nach 24 Stunden Schätzung mit TIL infiziert mit SeV-GFP unter Fluoreszenzmikroskopie die Infektionseffizienz.
  8. Sammeln Sie die Zellen (aus Schritt 3.5) in einem 15-ml-Tube. Zentrifuge bei 200 × g bei Raumtemperatur für 5 min.
  9. Überstand verwerfen und das Pellet in 0,5 ml hESC Medien mit Primas ES Zellmedium und basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 4 ng / ml).
  10. Übertragen Sie die Suspension in eine 10 cm-Schale, die ContaIns SNL feeder-Zellen in 10 ml HES Medien Mitomycin-C-behandelten. Ändern Sie die hESC Medien jeden zweiten Tag, bis die Kolonien angebaut werden.
  11. Um Tag 18 bis 21, entfernen Sie die Feeder-Zellen SNL um die Kolonien unter dem Mikroskop eine 10-ul Spitze in der Sterilbank verwenden.
  12. Schaben die Kolonien eine 10-ul Spitze mit und übertragen sie mit Hilfe eines 200-ul Spitze in 100 ul iPSCs Medien pro Vertiefung einer 96-Well-Gewebekulturplatte. Pipettieren nach oben und unten auf 2-3 mal mit einer durchschnittlichen Größe von 50 bis 100 & mgr; m, die Kolonien in kleine Klumpen zu brechen.
  13. Übertragen, um die kleinen Klumpen in 6-Well-Gewebekulturplatten mit Mitomycin-C-behandelten SNL feeder-Zellen (aus Schritt 2) in 2 ml pro Vertiefung iPSCs Medium mit basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 4 ng / ml). Ändern Sie jeden Tag iPSCs Medien.
  14. Übertragen Sie die iPS-Zellen zu 6-Well-Gewebekulturplatten mit frischem Mitomycin-C-behandelten SNL-Feeder-Zellen mit 1 mg / ml Kollagenase IV alle 5-6 Tage. Bereiten Sie zwei Vertiefungen pro Platten jeder Klon für Immunostaining.
  15. Bestimmen Sie die vollständige Neuprogrammierung jedes Klons durch immunhistochemische Färbung von Pluripotenz Marker (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 und OCT3 / 4) 1.
    HINWEIS: Für die weitere Auswertung der Pluripotenz Potenzial, bestätigen , dass komplett neu programmiert iPSC Linien in drei Keimblätter durch eine Embryoidkörperbildung Bildung 16 und Differenzierungstest oder ein Teratom Bildungstest unterscheiden kann.
  16. Bestätigen Sie, dass komplett neu programmiert iPSC Linien einen normalen Karyotyp durch zytogenetische Analyse zeigen.
  17. Für Teratom Bildung eine undifferenzierte TIL stamm iPSC (1 x 10 6) Suspension in 100 ul DMEM , enthaltend 10% FCS in das subkutane Gewebe von 6-8 Wochen alten weiblichen NOD / SCID - Mäuse injiziert. Stain teratoma Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin.

4. Immunfluoreszenzanfärbung von iPS-Zellen für SSEA3, SSEA4, TRA1-60 und TRA1-81

  1. Wash iPSCs mit 1 ml PBS und fixieren die iPS-Zellen mit 1 ml von 4% paraformaldehyde Lösung für 10 min. Entfernen Sie die 4% Paraformaldehydlösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit 1 ml 3 mal PBS.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Paraformaldehyd zu verwenden, da es giftig ist.
  2. Vorzubehandeln die iPSCs mit Blocking - Puffer (Tabelle 1) für 30 min. Inzwischen verdünnen die primären Antikörper (Ratte anti-human SSEA3, Maus anti-human SSEA4, Maus anti-human TRA1-60 und Maus anti-human TRA1-81) 01.50 in 1,5% Ziegenserum-Lösung verdünnt mit PBS und Triton X -100 (Gesamtvolumen: 1 ml).
  3. Entfernen des Blockierungspuffers (Tabelle 1). Fügen Sie den verdünnten primären Antikörperlösung und Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Inzwischen verdünnen dem sekundären Antikörper (anti-Maus IgG und IgM oder anti-Ratte-IgM) 01.50 in 1,5% Ziegenserum-Lösung.
  4. Entfernen Sie die verdünnten primären Antikörperlösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit 1 ml PBS 3 mal für je 5 min. In der verdünnten sekundären Antikörper-Lösung und Inkubation für 45 Minuten bei Raumtemperatur in einem dunklen Raum. Entfernen Sie die verdünnten sekundären Antikörper-Lösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit 1 ml PBS 3 mal für je 5 min. Beachten Sie die iPS-Zellen mit Immunfluoreszenzmikroskopie.

5. Immunfluoreszenzanfärbung von iPS-Zellen für Oct3 / 4

  1. Wash iPSCs mit 1 ml PBS und fixieren die iPS-Zellen mit 1 ml 4% Paraformaldehydlösung für 10 min. Entfernen Sie die 4% Paraformaldehydlösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit PBS 3 mal.
  2. Hinzufügen Permeabilisierung Puffer (Tabelle 1) und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Permeabilisierung Puffer und fügen Blocking - Puffer (Tabelle 1).
  3. für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Inzwischen verdünnen den primären Antikörper (Maus anti-human Oct3 / 4) 01.50 in Blocking-Puffer.
  4. Fügen Sie den verdünnten primären Antikörperlösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
  5. Entfernen Sie die verdünnten primären Antikörperlösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit 1 ml PBS 3 mal für je 5 min. Inzwischen diLaute der sekundäre Antikörper (Ziege-anti-Maus-IgG / IgM) 1: 100 in Blockierungspuffer.
  6. In der verdünnten sekundären Antikörper-Lösung und Inkubation bei Raumtemperatur in einem dunklen Raum für 45 min.
  7. Entfernen Sie die verdünnten sekundären Lösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit 1 ml PBS 3 mal für je 5 min. Beachten Sie die iPS-Zellen unter Immunfluoreszenzmikroskopie.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt die Übersicht über das Verfahren , das die anfängliche Expansion des Melanoms TILs mit rhIL-2, die durch Aktivierung mit anti-CD3 / CD28 und Gentransfer OCT3 / 4, KLF4, SOX2, und c-MYC zu TILs folgt beinhaltet zur Erzeugung von iPSCs. Normalerweise TIL auf Kultur mit rhIL-2 Start zu bilden Kugeln 21-28 Tage nach Beginn der Kultur. An diesem Punkt TIL bereit sind , mit anti-CD3 aktiviert werden / CD28. 2A zeigt TIL, auf Kultur mit rhIL-2 am Tag 21, die bereit sind , mit zu aktivierenden anti-CD3 / CD28. 2B zeigt GFP Einführung von Sendai - Virus (SeV) bei 20 transfiziert MOI. 2C zeigt einen typischen pluripotenten Klon auf Nährzellen SNL , die 18 bis 21 Tage nach der Infektion SeV erscheint. 2D zeigt , dass die erzeugten TIL-derived iPSCs haben einen normalen Karyotyp. Abbildung 3 zeigt Immunfluoreszenzanfärbung bestätigen pluripotency Marker - Expression auf iPSCs (SSEA3, SSEA4, TRA1-81, TRA1-60 und OCT3 / 4). Abbildung 4 zeigt , dass iPS - Zellen abgeleitet von Melanomen TIL können teratoma zu bilden , die eine Vielzahl von Zellen , die aus drei Keimblätter enthalten (neuronale Gewebe, respiratorischen Epithel und Knorpel). 5 zeigt Abbildung , die erzeugt TIL-derived iPSCs TCR Umlagerungen behalten.

Abbildung 1
Abb . 1: Schematische Darstellung der Erzeugung von iPS - Zellen von Melanomen TIL Das Protokoll umfasst drei Stufen: Isolierung und Kultivierung von TIL mit IL-2, T - Zell - Aktivierung mit anti-CD3 / CD28 und Reprogrammierung mit dem Sendai - Virus (SeV) Vektor - Codierung OCT3 / 4, SOX2, KLF4 und c-MYC. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figur 2
Fig . 2: Erzeugung von iPSCs von Melanomen TILs (A) Ein Bild , die die Morphologie der TILs in rhIL-2 , wenn sie gestartet 2-3 Wochen nach Beginn der Kultur zu erweitern. (B) Bilder , die Morphologie und die GFP - Expression von TIL einen Tag nach der SeV - Infektion. (C) Ein typischer ESC-like iPSC Kolonie am Tag 21 nach der SeV - Infektion. Die Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. (D) zytogenetische Analyse auf zwanzig G-gebändert Metaphase - Zellen aus einer der von Melanomen TIL abgeleitet iPSCs. Abbildung (D) von Saito et al angepasst ist 16. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abb . 3: Immunfluoreszenzfärbung mit Stammzellen pluripotent Marker Der Immunfluoreszenztest zeigt , dass die TIL-derived iPSCs von zwei Patienten positiv sind für SSEA3, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60 und OCT3 / 4. Die Maßstabsbalken = 100 μm.The Figur wird von Saito et al 16 angepasst. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4:. Die Bestätigung der Pluripotenz für iPS - Zellen mit Teratom Bildung Hematoxylin- und Eosin-gefärbte Vertreter teratoma Abschnitte abgeleitet von der TIL-derived iPSCs Klon (6 Wochen nach der Injektion in NOD / SCID - Mäuse) gezeigt. Abbildung von Saito et al angepasst 16..com / files / ftp_upload / 54375 / 54375fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Fig . 5: Eine Vielzahl von TCR-β - Gen Anordnungsmuster in TIL-iPSCs TCR-β - Gen - Umlagerungen in TIL-iPSCs werden durch Kapillarelektrophorese identifiziert. Die grüne Linie wird von der Band für das Gen Jβ1 abgeleitet, und die blaue Linie wird von der Band für das Jβ2 Gen abgeleitet. Die Abbildung von Saito et al angepasst ist 16. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1
Tabelle 1: Zusammensetzung für die T - Zell - Reprogrammierung, tumor Sammeln, SNL feeder - Zelle, und iPSC Medien und die Permeabilisierung und Blockierungspuffer. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

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Discussion

Hier haben wir gezeigt, ein Protokoll für die Umprogrammierung Melanom TIL zu iPS-Zellen von SeV-vermittelte Transduktion der vier Transkriptionsfaktoren OCT3 / 4, SOX2, KLF4 und c-MYC. Dieser Ansatz, der eine SeV - System unter Verwendung von T - Zellen umprogrammieren, bietet den Vorteil einer nicht-integrierenden Verfahren 7.

Eine frühere Studie zeigte , dass ein SeV Umprogrammierung System war sehr effizient und zuverlässig nicht nur Fibroblasten neu zu programmieren , sondern auch dem peripheren Blut - T - Zellen 7,17. Darüber hinaus haben wir das Melanom TILs kürzlich gezeigt , dass differenzierteres und exprimieren höhere inhibitorische Rezeptoren wie PD-1 als periphere Blut - T - Zellen SeV 16 Vektoren können auch neu programmiert werden. Zeitpunkt der Stimulation mit anti-CD3 / CD28 und Infektion mit SeV-Vektor war kritisch in Umprogrammierung TIL. Periphere Blut - T - Zellen mit anti-CD3 und IL-2 zur Umprogrammierung unmittelbar nach der Ernte aus dem Subjekt 7, stimuliert werden while TIL müssen für 3-4 Wochen mit IL-2 vor der Stimulation kultiviert werden.

Obwohl mehr als 99% der TIL CD8 - T - Zellen wurden nach 3-4 Wochen der Kultur mit IL-2 und Aktivierung mit anti-CD3 / 16 CD28, wir empfehlen Analyse der TCR - Umlagerung in iPS - Zellen zu bestätigen , dass erzeugte iPSCs von TIL sind (Abbildung 5). Zu beachten ist , angegeben unsere früheren Studien einschließlich , dass alle iPSCs erzeugt SeV aus einkernigen peripheren Blutzellen unter Verwendung oder TIL hatte TCR Umlagerung 7,16.

Obwohl Erzeugung iPSCs von Melanomen TILs machbar war, fanden wir , dass die Umprogrammierung Effizienz von Melanomen TILs niedriger war (0,01-0,05%) 16 als die peripheren Blut - T - Zellen (0,1%) 7. Der Grund dafür ist unklar, aber es könnte mit der höheren Expression der inhibitorischen Rezeptoren oder die größere Anzahl von differenzierten T-Zell - Untergruppen in TILs 13,16 zugeordnet sein. Neue bedeutende Fortschrittefür eine Neuprogrammierung Technologie kann die Neuprogrammierung Effizienz zur Erzeugung von TIL-iPS-Zellen zu verbessern. Die zweite Generation des SeV - Vektor wurde TS12KOS, fand eine höhere Effizienz der iPS - Generation zu haben , als die herkömmliche SeV - Vektor in der früheren Studie 18,19 verwendet.

Obwohl die Gewinnung menschlicher iPSCs mit SeV Umprogrammierung System möglich ist, gibt es mehrere Einschränkungen in diesem Protokoll in Betracht gezogen werden. Wir verwenden fötalen Rinderserum bei SeV-Infektion in diesem Protokoll. Wir fanden heraus, dass die Umprogrammierung Effizienz von Melanomen TIL deutlich geringer war, wenn Medien mit menschlichem Serum bei SeV-Infektion im Vergleich zu einem mit fötalen Rinderserum, trotz ähnlicher Verbreitung von TIL verwenden. Wir verwenden auch eine Maus-Feeder-Schicht für iPSC Erzeugung und Wartung, sondern eine definierte Feeder frei und Xeno-freies System alternative Methoden in zukünftigen Studien sein kann.

Es dauert etwa zwei Monate ab dem Zeitpunkt der Tumor Ernte zu erzeugen iPSCsvon Melanom TIL. Darüber hinaus würde es weitere 1-2 Monate dauern, gentechnikfreien iPSCs zu erhalten. Dies könnte durch die Verwendung des neuen Typs von SeV Vektor verkürzt werden, TS12KOS, die eine effizientere Viruseliminationsrate 19 gezeigt hat.

Im Ergebnis ist die Erzeugung von menschlichen iPSCs von Melanomen TILs machbar. Das aktuelle Protokoll kann ein wichtiger Schritt zum Erzeugen einer unendlichen Zahl von tumorspezifischen T-Zellen für die adoptive T-Zell-Therapie sein.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
gentle MACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
gentle MACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Tumor Dissociation Kit, human Miltenyi Biotec 130-095-929
RPMI 1640 Life technologies 11875-093
Falcon 70 um Cell Strainer BD 352350
BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes BD 352070
IMDM Life technologies 12440053
human AB serum Life technologies 34005100
L-glutamine (200mM) Life technologies 25030-081
2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) Life technologies 21985-023
Penicillin-Streptomycin  Life technologies 15140-122
gentamicin Life technologies 15750-060
Ficoll-Paque PLUS GE 17-1440-02
D-PBS (-) Life technologies 14040-133
recombinant human (rh) IL-2 Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 BD 555329
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 BD 555725
X-VIVO 15 Lonza 04-418Q
FBS Gibco 26140-079
HEPES Life technologies 15630-080
N-Acetylcysteine Cumberland Pharmaceuticals Inc. NDC 66220-207-30
Falcon Tissue Culture Plates (6-well) Corning 353046
Falcon Tissue Culture Plates (24-well) Corning 353047
Sendai virus vector DNAVEC
SNL feeder cells Cell Biolabs, Inc CBA-316
mitomycin C SIGMA M4287 soluble in water (0.5 mg/ml)
gelatin SIGMA G1890
basic fibroblast growth factor (bFGF) Life technologies PHG0264

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References

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Entwicklungsbiologie Heft 117 Induzierte pluripotente Stammzellen Reprogramming Tumor-infiltrierenden Lymphozyten T-Zellen Melanom Sendai-Virus-Vektor Mensch CD3 CD28 IL-2
Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten
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Saito, H., Iwabuchi, K., Fusaki, N., … More

Saito, H., Iwabuchi, K., Fusaki, N., Ito, F. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes. J. Vis. Exp. (117), e54375, doi:10.3791/54375 (2016).

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