Abstract
Adoptiv overførsel af ex vivo ekspanderede autologe tumor-infiltrerende lymfocytter (tils) kan formidle holdbare og komplette responser i betydelige delmængder af patienter med metastatisk melanom. Største hindringer ved denne tilgang er nedsat levedygtighed af overførte T-celler, forårsaget af telomer afkortning, og det begrænsede antal TIL'er opnået fra patienter. Mindre-differentierede T-celler med lange telomerer ville være en ideel T-celle delmængde til adoptiv T-celle terapi, men at generere mange disse ugunstigt differentierede T-celler er problematisk. Denne begrænsning af adoptiv T-celle terapi kan teoretisk overvindes ved hjælp af inducerede pluripotente stamceller (iPSCs), der selv-forny, vedligeholde pluripotens, har aflange telomerer, og giver en ubegrænset kilde til autologe T-celler til immunterapi. Her præsenterer vi en protokol til at generere iPSCs bruger Sendaivirusvektorer for transduktion af omprogrammering faktorer i TIL'er. Denne protokol genererers fuldt omprogrammeres, vektor-fri kloner. Disse TIL-afledte iPSCs kan være i stand til at generere mindre differentierede patientår og tumor-specifikke T-celler til adoptiv T-celle terapi.
Introduction
Cellular omprogrammering teknologi, der tillader generering af inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) via overekspression af et defineret sæt af transkriptionsfaktorer lover godt inden for cellebaserede behandlingsformer 1,2. Disse iPSCs udviser transkriptionelle og epigenetiske egenskaber og har kapacitet til selv-fornyelse og pluripotens lighed med embryonale stamceller (EKSF) 3-5. Bemærkelsesværdig fremskridt i omprogrammering teknologi i det seneste årti har givet os mulighed for at generere menneskelige iPSCs selv fra terminalt differentierede celler, såsom T-celler 6-8. T-celle-afledte iPSCs (TiPSCs) bevarer den samme omlejrede konfiguration af T-cellereceptor (TCR) kædegener som de oprindelige T-celler, som tillader regenerering af antigenspecifikke T-celler fra TiPSCs 9-11.
Næsten 80% af melanom-infiltrerende lymfocytter (TIL'er) opnået fra en patients tumor specifikt genkender tumor-associerede antigener and opretholde cytotoksicitet over de oprindelige cancerceller 12. Især blev ekspressionen af programmeret celledød protein-1 (PD-1) på TIL'er fundet at identificere den autologe tumor-reaktive repertoire, herunder muteret neoantigen-specifikke CD8 + lymfocytter 13. Adoptiv overførsel af ex vivo ekspanderede autologe TIL'er i kombination med præparative lymphodepleting regimer og systemisk indgivelse af interleukin-2 (IL-2) kan forårsage væsentlig regression af metastatisk melanom i undergrupper af patienter 14. Trods opmuntrende resultater i prækliniske modeller og hos patienter, dårlig overlevelse infunderes T-celler og eksistensen af immunsuppressive veje synes at kompromittere det fulde potentiale af adoptiv T-celle terapi. Aktuelle kliniske protokoller kræver omfattende ex vivo manipulation af autologe T-celler for at opnå store tal. Dette resulterer i genereringen af terminalt differentierede T-celler, der har ringe overlevelse, reduceret Proliferative kapacitet, og høje niveauer af PD-1 15.
Denne begrænsning af adoptiv T-celle terapi kan teoretisk overvindes ved hjælp iPSCs, der kan give en ubegrænset kilde til autologe T-celler til immunterapi. Vi har for nylig rapporteret omprogrammering af melanom TIL'er udtrykker høje niveauer af PD-1 af Sendai-virus (SeV) -medieret transduktion af de fire transkriptionsfaktorer, OCT3 / 4, SOX2, KLF4, og c-MYC 16. Mens retrovirus vektorer kræver integration i værten kromosomer til at udtrykke omprogrammering gener, SeV vektorer er ikke-integrere og til sidst slået ud cytoplasmaet. Omprogrammering effektivitet er langt større med et SeV-system sammenlignet med lentivirus eller retrovirusvektorer 6-8. Endvidere kan SeV specifikt omprogrammere T-celler i mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er), mens nogle IPSC kloner dannet af lentivirus eller retrovirusvektorer kan være fra ikke-lymfoide cellelinier 6-8. Her har vi detaljeprocedurerne gennemført til isolering og aktivering af human melanoma TIL'er og til generering af TIL-afledte iPSCs bruger SeV omprogrammering system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Patienter skal give informeret samtykke til at deltage i Institutional Review Board og menneskelige Pluripotente Stem Cell Udvalget godkendte undersøgelse.
1. Isolering og dyrkning af TIL'er
- Opnå tumor materiale, der kræves ikke for histopatologisk diagnose fra patologi tjeneste / væv kerne indkøb. Placer 20-100 g tumorprøver i et 50 ml rør med 30 ml tumor indsamling medier (tabel 1).
- Dissekere fast, fast, normale væv af tumor prøven fra skrøbelige og / eller blodig nekrotiske områder ved hjælp af en saks. Efter fjernelse af nekrotisk væv, bruge en saks til at hakke prøven så små som muligt.
- Dissociere hakket prøve i et enkelt-cellesuspension under anvendelse af en dissociator og tumor dissociation kit (human) ifølge producentens instruktioner. Filtreres suspensionen med en 70 um cellefilter, der er indstillet på en 50 ml rør og vask sien 2 gange med2 ml RPMI 1640.
- Centrifuger ved 200 xg ved stuetemperatur i 5 min. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 10 ml T-celle medium (tabel 1).
- Der fremstilles en to-trins-gradient opløsning såsom Ficoll (gradient opløsning) i en 50-ml rør, med et lavere trin med 10 ml 100% gradient-opløsning og en midterste trin med 30 ml 75% gradient-opløsning fortyndet med Dulbeccos phosphat- saltvand, ingen calcium, ingen magnesium (D-PBS (-)).
- Lag cellesuspensionen (fra trin 1.4) på gradient-opløsning (fra trin 1.5). Der centrifugeres ved 400 xg ved 20 ° C i 45 minutter.
- Opsaml lag indeholdende de berigede TIL'er ved grænsefladen mellem gradienten opløsning 100%, og gradienten opløsning i et 50 ml rør 75%. Fortynd lag af opløsningen med de berigede TIL'er ved tilsætning 20-30 ml D-PBS (-).
- Centrifuger ved 200 xg ved stuetemperatur i 5 min. Supernatanten fjernes, og resuspender TIL fraktion i 10 mlaf T-celle medier.
- Kultur fraktionen (fra trin 1.8) med 2 ml af T-celle medier og 6.000 IU / ml rekombinant human (rh) IL-2 i en 6-brønds plade ved 37 ° C, 5% CO2.
- Skift halvdelen af medier på dag 5 efter kultur initiering og hver 2-3 dage herefter.
- Split cellerne i forholdet 1: 2, uden trypsinisering efter sagte suspension, en fordobling af antallet af brønde, når nå 80-90% sammenflydning. Tilføj et halvt volumen (1 ml) af friske T-celle medier og rhIL-2 ved 6000 IU / ml.
2. Fremstilling af mitomycin-C-behandlede SNL Feeder Cell Plate
- Kultur SNL feederceller i 10 ml SNL feeder cellemedier (tabel 1) på en 0,1% gelatine-coatede 10 cm skål, indtil 80-90% sammenløb (3-4 x 10 6 celler) nås.
- Tilføj 310 pi 0,4 mg / ml mitomycin C opløsningen direkte i SNL feeder celledyrkningsskål og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 2 timer og 15 min. Aspirer medierne ennd vaske cellerne to gange med 5 ml D-PBS (-).
- Tilsæt 0,5 ml 0,25% trypsin / 1 mM EDTA og inkuberes ved stuetemperatur i 1 min at dissociere cellerne. Tilsættes 4,5 ml SNL feeder cellemediet at neutralisere og resuspender cellerne i et enkelt suspension.
- Overfør cellerne i et 15 ml rør og centrifugeres ved 200 xg i 5 min. Aspireres medierne og tælle cellerne med et hæmocytometer efter fornyet suspendering i 10 ml SNL feeder cellemedier.
- Plade 1,5 x 10 6 celler pr brønd i SNL feeder celler på en 10 cm skål og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2. Brug SNL fødeceller inden for 3 dage.
3. Generation af iPSCs Brug af Sendai virus (SeV) Vector
- Harvest TIL'er (fra trin 1.11) og aktivere 5 x 10 5 celler af TIL'er med plade-bundet muse-anti-human CD3 (1 pg / ml) og opløselig muse-anti-humant CD28 (5 pg / ml), med rhIL-2 (6.000 IE / ml) i 2 ml T-celle medier i en plade med 6 brønde ved 37 ° C, 5% CO2 i 5 dage.
- Harvest TIL'er (fra trin 3.1) i en 15 ml rør med en pipette og tælle antallet af celler med en hæmocytometer.
- Genaktivere 1 x 10 5 celler af TIL'er med plade-bundet muse-anti-human CD3 (1 pg / ml) og opløselig muse-anti-humant CD28 (5 pg / ml) med rhIL-2 (60 IU / ml) i 500 pi af omprogrammering medier (tabel 1) pr brønd i en 24-brønds plade ved 37 ° C, 5% CO2 i 24 timer. Forbered 3 brønde for SeV-infektion: OCT3 / 4, SOX2, KLF4, og c-myc (1 brønd); SeV-infektion (GFP: grønt fluorescerende protein) (1 brønd); og celletal (1 godt).
- Efter 24 timer (fra trin 3.3), tælle celle nummer med et hæmocytometer og bestemme mængden af hver virus til forskellige (3-20) infektionsmultipliciteter (MOI). Fjern et sæt Sendai-virusvektor rør fra -80 ° C opbevaring. Optø SeV-vektorer hurtigt i et vandbad (37 ° C) og placere dem på is.
Volumen af virus (pi)= MOI (CIU / celle) x antal celler / titer af virus (CIU / ml) × 10-3 (ul / ml) - Tilsæt de beregnede mængder af hver af de fire Sendai-virusvektor rør, der individuelt gennemførte OCT3 / 4, SOX2, KLF4, og c-MYC ved tilsætning af en blanding af SeV-vektorer ved 10-20 MOI i medierne, herunder aktiveret TIL'er.
- For at bestemme transduktion effektivitet, tilføje de beregnede mængder af SeV-GFP i en brønd af aktiverede TIL'er.
- Sæt fadet (fra trin 3.5 og trin 3.6) i inkubatoren ved 37 ° C, 5% CO2 i 24 timer. Efter 24 timer estimere infektionseffektivitet hjælp TIL'er inficeret med SeV-GFP under fluorescensmikroskopi.
- Opsamle cellerne (fra trin 3.5) i en 15 ml rør. Centrifuger ved 200 xg ved stuetemperatur i 5 min.
- Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 0,5 ml hESC medier med Primate ES Cell Medium og basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF, 4 ng / ml).
- Suspensionen overføres en 10 cm skål, der contains mitomycin-C-behandlede SNL feederceller i 10 ml hESC medier. Skift hESC medier hver anden dag, indtil kolonierne dyrkes.
- Omkring dag 18 til 21, fjerne SNL fødeceller omkring kolonierne under et mikroskop under anvendelse af en 10-pi spids i ren bænk.
- Skrab kolonier under anvendelse af en 10-pi spids og overføre dem via et 200-ul spids i 100 pi iPSCs medier pr brønd af en 96-brønds vævskulturplade. Pipetter op og ned på 2-3 gange for at bryde kolonierne i små klumper med en gennemsnitlig størrelse på 50-100 um.
- Overfør de små klumper i 6-brønds vævskulturplader med mitomycin-C-behandlede SNL feederceller (fra trin 2) i 2 ml pr brønd af iPSCs medier med basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF, 4 ng / ml). Skift iPSCs medier hver dag.
- Overfør iPSCs til 6-brønds vævskulturplader med friske mitomycin-C-behandlede SNL feederceller med 1 mg / ml collagenase IV hver 5-6 dage. Forbered 2 brønde pr plader af hver klon til Immunostaining.
- Bestem den fulde omprogrammering af hver klon ved immunhistokemisk farvning af pluripotens markører (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, og OCT3 / 4) 1.
BEMÆRK: For yderligere evaluering af pluripotens potentiale, bekræfter, at fuldt omprogrammerede IPSC linjer kan differentiere i tre kim lag af et embryoid krop dannelse og differentiering analyse eller en teratom formation assay 16. - Bekræft, at fuldt omprogrammerede IPSC linjer demonstrerer en normal karyotype ved cytogenetisk analyse.
- For teratom dannelse, injicere en udifferentieret TIL-afledte iPSC (1 x 10 6) suspension i 100 pi DMEM indeholdende 10% FCS i det subkutane væv på 6-8 uger gamle NOD / SCID-mus. Stain teratoma sektioner med hæmatoxylin og eosin.
4. Immunofluorescens Farvning af iPSCs for SSEA3, SSEA4, TRA1-60 og TRA1-81
- Vask iPSCs med 1 ml PBS og fastsætte iPSCs med 1 ml 4% paraformaldehyde opløsningen i 10 minutter. Fjern de 4% paraformaldehyd-opløsning og vaske iPSCs med 1 ml PBS 3 gange.
BEMÆRK: Vær forsigtig, når du bruger paraformaldehyd, fordi det er giftigt. - Forbehandle iPSCs med blokerende buffer (tabel 1) i 30 minutter. I mellemtiden fortyndes de primære antistoffer (rotte-anti-humant SSEA3, muse-anti-humant SSEA4, muse-anti-humant TRA1-60, og muse-anti-humant TRA1-81) 1:50 i 1,5% gedeserum opløsning fortyndet med PBS og Triton X -100 (samlet volumen: 1 ml).
- Fjern blokeringsbufferen (tabel 1). Tilsæt fortyndede primære antistof-opløsning og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. I mellemtiden fortyndes det sekundære antistof (anti-muse IgG og IgM eller anti-rotte IgM) 1:50 i 1,5% gedeserum opløsning.
- Fjern den fortyndede primære antistof-opløsning og vaske iPSCs med 1 ml PBS 3 gange, hver i 5 minutter. Tilsæt fortyndede sekundære antistof opløsning og inkuberes i 45 minutter ved stuetemperatur i et mørkt rum. Fjern den fortyndede sekundære antistof opløsning og vask iPSCs med 1 ml PBS 3 gange, hver i 5 minutter. Overhold iPSCs med immunfluorescensmikroskopi.
5. Immunofluorescens Farvning af iPSCs for Oct3 / 4
- Vask iPSCs med 1 ml PBS og fastsætte iPSCs med 1 ml 4% paraformaldehydopløsning for 10 min. Fjern de 4% paraformaldehyd-opløsning og vaske iPSCs med PBS 3 gange.
- Tilføj permeabilisering puffer (tabel 1) og inkuber ved stuetemperatur i 10 min. Fjern permeabilisering buffer og tilføje blokerende buffer (tabel 1).
- Der inkuberes ved stuetemperatur i 30 min. I mellemtiden fortyndes det primære antistof (muse-anti-humant Oct3 / 4) 1:50 i blokerende buffer.
- Tilsæt fortyndede primære antistofopløsning og inkuber ved 4 ° C natten over.
- Fjern den fortyndede primære antistof-opløsning og vaske iPSCs med 1 ml PBS 3 gange, hver i 5 minutter. I mellemtiden, dilut det sekundære antistof (gede-anti-muse-IgG / IgM) 1: 100 i blokeringspuffer.
- Tilsæt fortyndede sekundære antistof opløsning og inkuber ved stuetemperatur i et mørkt rum i 45 min.
- Fjern den fortyndede sekundære opløsning og vask iPSCs med 1 ml PBS 3 gange, hver i 5 minutter. Overhold iPSCs under immunfluorescensmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en oversigt over den proces, der omfatter den oprindelige udvidelse af melanom TIL'er med rhIL-2, som er efterfulgt af aktivering med anti-CD3 / CD28 og genoverførsel af OCT3 / 4, KLF4, SOX2, og c-MYC til TIL'er til generering af iPSCs. Normalt TIL'er på kultur med rhIL-2 start til at danne kugler 21-28 dage efter initiering af kulturen. På dette tidspunkt TIL'er er klar til at blive aktiveret med anti-CD3 / CD28. Figur 2A viser TIL'er, om kultur med rhIL-2 på dag 21, der er klar til at blive aktiveret med anti-CD3 / CD28. Figur 2B viser GFP introduktion af Sendai-virus (SeV) transfekteret ved 20 MOI. Figur 2C viser et typisk pluripotent klon på SNL feederceller, der vises 18-21 dage efter SeV-infektion. Figur 2D viser, at de genererede tIL-afledte iPSCs har en normal karyotype. Figur 3 viser immunfluorescensfarvning at bekræfte pluripotency markør-ekspression på iPSCs (SSEA3, SSEA4, TRA1-81, TRA1-60, og OCT3 / 4). Figur 4 viser, at iPSCs afledt af melanom TIL'er kan danne teratom, der indeholder en række celler fra tre kimlag (neurale væv, respiratorisk epitel, og brusk). Figur 5 viser, at genererede TIL-afledte iPSCs beholde TCR omlejringer.
Figur 1:. Skematisk oversigt over dannelsen af iPSCs fra melanom TIL'er Protokollen involverer tre trin: isolering og dyrkning af TIL'er med IL-2, T-celle aktivering med anti-CD3 / CD28, og celle omprogrammering med Sendai-virus (SeV) vektor kodning OCT3 / 4, SOX2, KLF4, og c-myc. klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Frembringelse af iPSCs fra melanom TIL'er (A) Et billede, der repræsenterer morfologi TIL'er i rhIL-2, når de begyndte at ekspandere 2-3 uger efter initiering af kulturen. (B) billeder repræsenterer morfologi og GFP-ekspression af TIL'er en dag efter SeV-infektion. (C) En typisk ESC-lignende iPSC koloni på dag 21 efter SeV-infektion. Skalaen barer = 200 um. (D) cytogenetisk analyse på tyve G-banded metafase-celler fra en af de iPSCs afledt af melanom TIL'er. Figur (D) er tilpasset fra Saito et al 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
ftp_upload / 54.375 / 54375fig3.jpg "/>
Figur 3:. Immunofluorescens farvning med stamcelle pluripotente markører Den immunofluorescensbestemmelse viser, at TIL-afledte iPSCs fra to patienter er positive for SSEA3, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, og OCT3 / 4. Skalaen barer = 100 μm.The tal er tilpasset fra Saito et al 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Bekræftelse af pluripotens for iPSCs med teratom dannelse Hematoxylin- og eosin-farvede repræsentative teratoma sektioner afledt fra TIL-afledte iPSCs klon (6 uger efter injektion i NOD / SCID-mus) er vist. Figur tilpasset fra Saito et al 16..com / filer / ftp_upload / 54.375 / 54375fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. En lang række TCR-p-gen arrangement mønstre i TIL-iPSCs TCR-p gen omlejringer i TIL-iPSCs identificeres ved kapillarelektroforese. Den grønne linje er afledt fra bandet for Jβ1 genet, og den blå linje stammer fra bandet for Jβ2 genet. Figuren er tilpasset fra Saito et al 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Sammensætning til T-cellen, omprogrammering, tumor indsamling, SNL feeder celle, og IPSC medier og permeabilisering og blokering buffere. Klik her for at se en større version af denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her demonstrerede vi en protokol for omprogrammering melanom TIL'er til iPSCs af SeV-medieret transduktion af de fire transkriptionsfaktorer OCT3 / 4, SOX2, KLF4, og c-myc. Denne fremgangsmåde, ved anvendelse af et SeV-system at omprogrammere T-celler, har den fordel, en ikke-integrerende fremgangsmåde 7.
En tidligere undersøgelse viste, at en SeV omprogrammering systemet var meget effektiv og pålidelig at omprogrammere ikke kun fibroblaster men også perifert blod T-celler 7,17. Desuden har vi for nylig vist, at melanom TIL'er, der er mere differentieret og udtrykker højere niveauer af inhibitoriske receptorer, såsom PD-1 end perifere blod-T-celler kan også omprogrammeres ved hjælp SeV vectors 16. Timingen af stimulering med anti-CD3 / CD28 og infektion med SeV-vektor var kritisk i omprogrammering TIL'er. Perifert blod-T-celler kan stimuleres med anti-CD3 og IL-2 for omprogrammering umiddelbart efter høstningen fra individet 7, while TIL'er skal være dyrket i 3-4 uger med IL-2 før stimulering.
Selv om mere end 99% af TIL'er var CD8 T-celler efter 3-4 ugers dyrkning med IL-2 og aktivering med anti-CD3 / CD28 16, anbefaler vi analyse af TCR-omlejring i iPSCs at bekræfte, at genererede iPSCs er fra TIL'er (figur 5). Notatet tidligere undersøgelser herunder vores viste, at hver iPSCs genereres ved hjælp af SeV fra perifert blod mononukleære celler eller TIL'er havde TCR omlejring 7,16.
Selv generation af iPSCs fra melanom TIL'er var muligt, fandt vi, at omprogrammering effektivitet melanom TIL'er var lavere (0,01-0,05%) 16 end for perifere blod-T-celler (0,1%) 7. Årsagen til dette er fortsat uklart, men det kan være forbundet med den højere ekspression af inhiberende receptorer eller det større antal af differentierede T-celle-undergrupper i TIL'er 13,16. Seneste betydelige fremskridtfor omprogrammering teknologi kan forbedre omprogrammering effektivitet for generering af TIL-iPSCs. Den anden generation SeV-vektor, TS12KOS, viste sig at have højere effektivitet af iPSC generation end den konventionelle SeV-vektor, der anvendes i den tidligere undersøgelse 18,19.
Selv om afledning af humane iPSCs med et SeV omprogrammering system er muligt, er der flere begrænsninger, der skal overvejes i denne protokol. Vi bruger føtalt bovint serum under SeV infektion i denne protokol. Vi fandt, at omprogrammering effektivitet melanom TIL'er var signifikant lavere, hvis brug af medier med human serum under SeV-infektion sammenlignet med en med føtalt bovint serum, trods lignende proliferation af TIL'er. Vi bruger også en mus feeder lag for iPSC generering og vedligeholdelse, men en defineret feeder-fri og xeno-fri-system kan være alternative metoder i fremtidige studier.
Det tager omkring to måneder fra tidspunktet for tumor høst til at generere iPSCsfra melanom TIL'er. Desuden ville det tage yderligere 1-2 måneder for at opnå transgene-fri iPSCs. Dette kan afkortes ved anvendelse af den nye type SeV-vektor, TS12KOS, som har vist en mere effektiv virus eliminationshastighed 19.
Afslutningsvis frembringelsen af humane iPSCs fra melanom TIL'er er gennemførlig. Den nuværende protokol kunne være et vigtigt skridt til at frembringe et uendeligt antal tumorspecifikke T-celler til adoptiv T-celle terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Wakao, H., et al. Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).
- Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother. 26, 332-342 (2003).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11 (2016).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
- Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052 (2014).
