Abstract
Les dispositifs microfluidiques sont capables de créer un micro-environnement précis et contrôlable cellulaire du pH, température, concentration de sel, et d'autres stimuli physiques ou chimiques. Ils ont été couramment utilisés pour les études in vitro de cellules en fournissant in vivo comme un cadre. Surtout, comment les cellules réponse aux gradients chimiques, les champs électriques et les contraintes de cisaillement a attiré beaucoup d'intérêts étant donné que ces phénomènes sont importants dans la compréhension des propriétés et des fonctions cellulaires. Ces puces microfluidiques peuvent être constitués de substrats de verre, des plaquettes de silicium, les huiles polydiméthylsiloxanes (PDMS), les polymères polyméthacrylate de méthyle (PMMA), ou des substrats polyéthylènetéréphtalate (PET) substrats. Parmi ces matériaux, les substrats PMMA sont pas cher et peuvent être facilement traitées par ablation laser et l'écriture. Bien que quelques dispositifs microfluidiques ont été conçus et fabriqués pour générer multiple, coexistant stimuli chimiques et électriques, aucun d'entre eux a été considéréassez efficace dans la réduction des répétitions expérimentales, notamment à des fins de dépistage. Dans ce rapport, nous décrivons notre conception et la fabrication de deux puces microfluidiques à base de PMMA-pour étudier les réponses cellulaires, dans la production d'espèces réactives de l'oxygène et de la migration, sous chimiques / électriques / cisaillement stimuli de stress simples ou coexistant. La première puce génère cinq concentrations relatives de 0, 1/8, 1/2, 8/7 et 1 dans les zones de culture, conjointement avec un gradient de contrainte de cisaillement produite à l'intérieur de chacun de ces domaines. La seconde puce génère les mêmes concentrations relatives, mais avec cinq différentes forces de champ électrique créé dans chaque zone de culture. Ces dispositifs fournissent non seulement des cellules avec un micro-environnement contrôlable précise, mais aussi augmenter considérablement le débit expérimental.
Introduction
In vivo dans les cellules sont entourées par une variété de biomolécules , y compris la matrice extracellulaire (ECM), des glucides, des lipides et d' autres cellules. Ils fonctionnaliser en réagissant aux micro-environnement stimuli tels que les interactions avec l'ECM et les réponses aux gradients chimiques de divers facteurs de croissance. Traditionnellement, les études in vitro de cellules sont réalisées dans des boîtes de culture cellulaire dans lesquels la consommation de cellules et les réactifs est grande et les cellules se développent dans un statique (sans circulation) l' environnement. Récemment, des dispositifs micro-fabriqué avec des composants fluidiques intégrés ont fourni une plate-forme alternative pour les études sur les cellules d'une manière plus contrôlable. De tels dispositifs sont capables de créer un micro-environnement précis des stimuli physiques et chimiques, tout en minimisant la consommation des cellules et des réactifs. Ces puces microfluidiques peuvent être constitués de substrats de verre, des plaquettes de silicium, des polydiméthylsiloxanes (PDMS), les polymères de polyméthacrylate de méthyle (PMMA), des substrats ou polyethyleneterephtalate (PET) substrats 1-3. dispositifs à base de PDMS sont transparents, biocompatible et perméable aux gaz, les rendant aptes à la culture et les études cellulaire à long terme. PMMA et PET substrats doivent être traitées par ablation laser et l'écriture pas cher et facile.
Les dispositifs microfluidiques devraient fournir des cellules avec un micro-environnement stable et contrôlable, où les cellules sont soumises à des stimuli chimiques et physiques différentes. Par exemple, les puces microfluidiques sont utilisées pour étudier la chimiotaxie des cellules. Au lieu des méthodes traditionnelles qui emploient chambre de Boyden et capillaire 4,5 ces dispositifs fluidiques miniaturisés peuvent générer des gradients chimiques précis pour étudier le comportement des cellules 1,6,7. Un autre exemple est d'étudier la migration directionnelle de cellules dans des champs électriques (SFE), un phénomène nommé électrotaxie. Comportements Electrotactic de cellules ont été signalés à être liés à la régénération nerveuse 8, le développement embryonnaire 9,et la cicatrisation des plaies 10,11. Et de nombreuses études ont été réalisées pour étudier la électrotaxie de divers types de cellules , y compris les cellules cancéreuses 12,13, 14,15 lymphocytes, des cellules de leucémie 11, et les cellules souches 16. Classiquement, des boîtes de Pétri et les verres de couverture sont utilisés pour construire des chambres electrotactic pour générer 17 FE. Ces configurations simples posent des problèmes d'évaporation moyen et FE imprécis, mais ils peuvent être surmontés par des dispositifs microfluidiques de canaux fluidiques clos, bien définies 12,18,19.
Pour étudier systématiquement les réponses cellulaires sous, des stimuli chimiques et électriques contrôlables précis, il serait d'une grande utilité pour développer des dispositifs microfluidiques capables de fournir des cellules avec de multiples stimuli en même temps. Par exemple, Li et al. fait état d' un dispositif microfluidique à base de PDMS pour la création simple ou coexistant gradients chimiques et FE 20. Kao et al. developed une puce microfluidique similaire à moduler le chimiotactisme des cellules de cancer du poumon par EF 6. Par ailleurs, pour augmenter le débit, Hou et al. conçu et fabriqué une puce multicanal à double champ électrique à base de PMMA pour fournir des cellules avec 8 stimuli combinés différents, (concentrations 2 points forts EF x 4 chimiques) étant 21. Pour augmenter encore la partout et ajouter la contrainte de cisaillement stimulus, nous avons développé deux dispositifs microfluidiques à base de PMMA-pour étudier les réponses cellulaires sous chimiques unique ou coexistant / électriques / cisaillement stimuli de stress.
Rapporté par Lo et al. 22,23, ces appareils contiennent cinq canaux de culture cellulaire indépendants , soumis à continu fluidiques fluide, imitant le système circulatoire in vivo. Dans la première puce (la puce chimique contrainte de cisaillement ou de la puce CSS), cinq concentrations relatives de 0, 1/8, 1/2, 7/8 et 1 sont générés dans les régions de culture, et un gradient de contrainte de cisaillement est produced l'intérieur de chacune des cinq zones de culture. Dans la seconde puce (la puce chimique-champ électrique ou la puce CEF), à l'aide d'un seul ensemble d'électrodes et de 2 pompes à seringue, cinq forces de EF sont générés en plus de cinq concentrations chimiques différentes dans ces zones de culture. les calculs et les simulations numériques sont réalisées pour mieux concevoir et exploiter ces puces, et les cellules de cancer du poumon en culture à l'intérieur de ces appareils sont soumis à des stimuli simples ou coexistants pour observer leurs réactions par rapport à la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), le taux de migration, et la direction de la migration. Ces puces sont mises en évidence pour être un gain de temps, à haut débit et des dispositifs fiables pour étudier comment les cellules répondent à divers stimuli micro-environnement.
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Protocol
1. Chip Conception et fabrication
- Dessiner des motifs à ablater sur des substrats en PMMA et bandes double-face en utilisant un logiciel commercial 24.
- Pour étudier les effets des concentrations chimiques et les contraintes de cisaillement, dessiner un motif "arbre de Noël" avec une largeur variable à son extrémité dans chacune des cinq zones de culture (Figure 1A et 1B).
- Pour étudier les effets des concentrations chimiques et les champs électriques, dessiner un motif "arbre de Noël" avec deux canaux plus fluidiques pour les ponts de sel (Figure 2A et 2B).
- Scribe un pattern individuel sur une feuille de PMMA ou d' un ruban adhésif double-face en chargeant le fichier correspondant dans le Traceur laser CO 2.
- Allumez le Traceur laser, et vérifier sa connexion à l'ordinateur. Ouvrir le modèle pour ablater à l'aide du logiciel commercial.
- Placez une feuille de PMMA ou d'un ruban adhésif double face on haut de la scène du scriber. Réglez la mise au point du laser CO 2 si nécessaire en utilisant la barre d'étalonnage et le visible laser He-Ne.
- Chargez le motif dans le scriber pour l'ablation sur la feuille de PMMA ou de la bande.
- Ramasser la feuille à motifs ou de ruban, retirez les morceaux non désirés, et nettoyer la surface avec insufflation d'azote.
NOTE: L'épaisseur de la feuille de PMMA est de 1 mm, et celle du ruban adhésif double face est de 0,07 mm ou 0,22 mm.
2. Assemblée Chip
- Avec la colle super, fixer des adaptateurs acryliques (longueur x largeur x hauteur = 10 mm x 10 mm x 5 mm, avec des filets de vis dans le milieu) vers le haut-couche la plus de la puce en alignant les filetages et les trous sur le dessus couche -la plupart. Ces adaptateurs servent de support entrées / sorties et des connecteurs de pont de sel.
- Assembler la puce microfluidique dans une hotte à flux laminaire.
- Assembler la puce microfluidique contrainte chimique cisaillement (puce CSS).
- UNEttach 3 feuilles de plaques de PMMA prescrites en utilisant 2 morceaux de ruban adhésif double face décrit. (Figure 1A et 1B).
- Ajouter un morceau de la bande double face 0,07 mm d'épaisseur plus au fond de la puce et fixer la puce à un diamètre boîte de Pétri de 10 cm.
- Mettre la puce d'assemblage dans la chambre à vide pour la nuit.
- Pour assembler la puce de domaine chimique-électrique (puce CEF), fixer la feuille de PMMA à un ruban adhésif double face d'épaisseur = 0,22 mm (figure 2A et 2B).
- Fixer la feuille de PMMA décrit et ruban adhésif double face à un diamètre boîte de Pétri de 10 cm en utilisant ce même morceau de ruban adhésif.
- Laissez la puce assemblé à l'intérieur du capot et l'exposer aux UV pendant 30 min pour la stérilisation.
- Connecter les entrées à deux seringues de 3 ml par des tubes en plastique et les écrous des doigts serrés. Connectez la sortie à un tuyau d'évacuation par l'intermédiaire d'un tube en plastique et un écrou serré à la main.
NOTE: Autoclavetous les tubes et les écrous à 121 ° C pendant 15 minutes avant utilisation. - Appuyez doucement sur le piston de la seringue pour les premiers canaux fluidiques avec PBS. Poussez les seringues avant et en arrière pour éliminer les bulles.
- Placer les puces à l' intérieur d' un incubateur pendant une nuit à 37 ° C sous 5% de CO 2.
NOTE: Ces deux étapes ont pour but de se laver la puce et éliminer les bulles restant dans la puce. - Prenez la puce de l'incubateur.
- Préparer des ponts de sel d'agar pour générer des champs électriques dans la puce CEF.
- Dissoudre 3% bas point de fusion d'agarose dans un tampon phosphate salin (PBS) 1 x tampon en utilisant un micro-ondes.
- Injecter solution progressive d'agarose dans le canal de pont de sel et d'insérer les électrodes avant solution se solidifie.
- Placez des électrodes en argent / chlorure d'argent dans les écrous tubulaires.
- Connecter les seringues aux pompes à seringue, et l'écoulement continu du milieu de culture (Modifié eagler Dulbecco17; s milieu DMEM) dans le canal fluidique pendant 10 min à un débit de 20 ul / min pour remplacer le PBS.
3. Préparation des cellules et configuration expérimentale
NOTE: Pré-chaud 1x PBS, milieu de culture (DMEM plus FBS), et de la trypsine dans un bain de 37 ° C de l'eau avant utilisation.
- Plaque cellules CL1-5 2 x 10 5 cancer du poumon 25,26 dans une boîte de Petri de 10 cm fourni avec du DMEM plus 10% de sérum de fœtus bovin (FBS). Incuber les cellules dans un incubateur sous 5% de CO2 à 37 ° C jusqu'à 90% de confluence.
- Aspirer le milieu et laver les cellules une fois avec préchauffé 1x PBS. Ajouter 2 ml de tampon de trypsine à 0,05% dans les cellules et attendre pendant 2 à 3 min à 37 ° C pour détacher les cellules.
- Transférer les cellules dans un tube de centrifugation stérile de 15 ml et on ajoute 6 ml de milieu de culture dans le tube. Retourner doucement le tube pour mélanger et retirer 5 ul du milieu contenant des cellules pour compter le nombre de cellules dans un hemocytometer.
- Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min. Suspendre 10 6 cellules dans 1 ml de milieu de culture et placer le milieu contenant des cellules dans une seringue de 1 ml.
- Infuser le milieu contenant des cellules dans la puce microfluidique de la prise et assurez-vous que la solution distribue tout au long des cinq zones de culture. Incuber la puce à l' intérieur d' un incubateur sous 5% de CO 2 à 37 ° C pendant 2 heures.
4. Configuration expérimentale
- Prenez la puce de l'incubateur et le placer sur le dessus d'un transparent d'oxyde d'indium-étain (ITO) de chauffage de verre.
NOTE: Le verre d'ITO est relié à un régulateur (PID) proportionnel-intégral-dérivé pour maintenir la température à 37 ± 0,5 ° C par l'intermédiaire de la rétroaction d'un coupleur thermique pincé hermétiquement entre le chauffe-ITO et la puce. - Mettez l'ensemble puce chauffe sur une platine motorisée XY d'un microscope inversé pour le suivi de la migration cellulaire ou à un stade fixe XYun microscope à fluorescence inversé pour mesurer la production de ROS.
- Pour générer différentes concentrations de produits chimiques, remplir deux seringues avec 5 ml de solutions chimiques de concentrations relatives 0 et 1 (dissous dans un milieu de culture) et pomper les dans la puce à des débits souhaités: dans la puce CSS, à un débit de 0,3 ml de débit / min pendant 1 heure; dans la puce de CEF, à un débit de 20 ul / min pour les 20 premières minutes et un débit de 20 ul / h pendant 120 min (temps total = 2 heures).
- Dans la puce CEF, pour le suivi de la migration des cellules, programme la phase XY du microscope pour répéter la prise de photos, via un reflex mono-objectif numérique (DSLR) appareil photo, de certains champs de vision (FOV) dans les zones de culture toutes les 15 min pour 2 heure.
- Pour la mesure de la production de ROS, utiliser l'indicateur basé sur la fluorescence-2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacétate (2'-7'-DCFDA).
- Préparer le stock de 2'-7'-DCFDA à 10 mM dans qualité de biologie moléculaire diméthylsulfoxyde (DMSO). DCFDA diluer dans du DMEM sans sérum seul (5 uM dans du DMEM). Le déacétylase potentiel pourrait augmenter les signaux de fond et de diminuer les signaux dans les cellules.
- Après 1 h de cisaillement stimulus de stress dans la puce CSS ou après 2 h de EF stimulus dans la puce CEF, pompe 2'-7'-DCFDA (5 uM dans DMEM) dans la puce à un débit de 20 ul / min pour les 20 premières minutes et un débit de 20 ul / h pendant 20 min. Pour le lavage, la pompe DMEM dans la puce à un débit de 20 ul / h pendant 20 min.
- Prenez des photos, via une caméra dispositif à couplage de charge (CCD), de certains FOV dans les zones de culture pour analyser les intensités de fluorescence.
5. Calculs de concentrations chimiques, des contraintes de cisaillement, et les champs électriques
- Dans les deux la puce CSS et la puce de CEF, calculer les concentrations de produits chimiques dans les cinq domaines de la culture. Par exemple, par injection de H 2 O 2 de concentrations 0 et 200 pM des deux orifices d'entrée, des concentrations de 0, 25, 100, 175 et 200 um sont générés.
NOTE: En supposant que tous les liquides d'écoulement divisé en douceur et aussi autour de la fourchette, les concentrations relatives dans les cinq domaines de la culture sont 0, 1/8, 1/2, 7/8 et 1, respectivement. - Dans la puce CSS, calculer la contrainte de cisaillement (de τ) dans chacune des zones de culture en utilisant
27, où Q est le débit volumique, η est la viscosité fluidique, h est la hauteur du canal, et w est la largeur du canal.
NOTE: En réglant Q = 0,3 ml / min dans chaque entrée (Q = 0,12 ml / min dans chaque zone de culture), η = 0,0008 Pa · s pour un milieu de culture, h = 1 mm, et w = 1 ~ 4 mm, le contrainte de cisaillement est calculée à aller de 0,0048 Pa (4 mm de large région) à 0,0192 Pa (1 mm de large région). - Dansla puce CEF, calculer la force de EF dans chacune des zones de culture en utilisant E = I / (aA eff) (la loi d'Ohm), où I est le courant électrique circulant à travers le canal fluidique, σ est la conductivité électrique du milieu de culture, et A eff est la surface en coupe transversale effective du canal.
REMARQUE: L' utilisation σ = 1,38 Ω -1 m -1 pour le milieu de culture et A eff = 0,22 mm 2 (largeur = 1 mm et hauteur = 0,22 mm), la résistance EF est calculée pour être E (mV / mm) = I ( A) × 3,3 × 10 6.- Comme le montre la figure 2D, traiter le circuit équivalent de cinq circuits C-section avec quatre (8 + 35 + 8) segments et un (5 + 35 + 5) segment.
NOTE: En analysant ce circuit parallèle selon la loi de tension de Kirchhoff et la loi d'Ohm, les courants circulant à travers la culture sont cinqcomme, I 1 à I 5 de bas en haut, sont calculés pour être autour de 0,49 I (zone 1), 0,25 I (zone 2), 0,13 I (zone 3), 0,08 I (zone 4), et 0,05 I (zone 5), respectivement, où I est le total courant continu (cC). Avec un courant continu appliqué de 0,157 mA, FE de 254, 130, 67, 41, et 26 mV / mm sont générées dans les cinq domaines de la culture.
NOTE: Pour une analyse électrique simplifiée du réseau microfluidique, tous les segments fluidiques sont considérés comme des résistances avec une résistance proportionnelle à leur longueur.
- Comme le montre la figure 2D, traiter le circuit équivalent de cinq circuits C-section avec quatre (8 + 35 + 8) segments et un (5 + 35 + 5) segment.
27, où Q est le débit volumique, η est la viscosité fluidique, h est la hauteur du canal, et w est la largeur du canal. Analyse 6. Données
Remarque: L'analyse des données est effectuée à l'aide du logiciel ImageJ.
- Analyser la production de ROS.
- Exécutez le logiciel ImageJ. Allez dans "Fichier" → Ouvrir pour charger une image fluorescente à analyser.
- Aller à "Image" → "Type" → "16-bit" pour changer l'imâge à une échelle de gris.
- Dessiner un polygone pour entourer une cellule. Allez sur "Analyser" → "Mesure" pour mesurer l'intensité de fluorescence moyenne de la cellule.
- Répétez 6.1.3 pour recueillir des intensités d'au moins 50 cellules de trois expériences indépendantes, et de calculer l'intensité moyenne avec l'erreur standard de la moyenne (SEM).
- Répétez 6.1.1-6.1.4 pour chaque condition expérimentale.
- Analyser la migration cellulaire.
- Exécutez le logiciel ImageJ. Allez dans "Fichier" → Ouvrir pour charger une image prise au temps = 0 à analyser.
- Dessiner un polygone pour entourer une cellule. Allez sur "Analyser" → "Mesure" pour mesurer le centre de masse de la cellule (x 1, y 1).
- Répéter 6.2.1- 6.2.2 pour mesurer le centre de masse de la même cellule que (x 2, y 2) d' une autre image prendre au temps = t.
- Calculer le taux de migration (en um / h) decette cellule
. - Répétez 6.2.1-6.2.4 pour recueillir les taux de migration à partir d'au moins 50 cellules de trois expériences indépendantes, et de calculer le taux de migration moyenne avec l'erreur standard de la moyenne (SEM).
- De 6.2.2 et 6.2.3, calculer la directedness de migration de cette cellule comme cosinus θ ou
Où θ est l'angle entre le vecteur de l'EF appliquée (du positif au négatif) et le vecteur du début à la position finale de la cellule (figure 2G). - Répétez 6.2.6 pour recueillir la migration directedness à partir d'au moins 50 cellules de trois expériences indépendantes, et de calculer le directedness de migration moyenne avec l'erreur standard de la moyenne (SEM).
- Calculer le taux de migration moyenne avec SEM et la directedness de migration moyenne avec SEM pour chaque condition expérimentale.
NOTE: Un directednessde 1 indique que toutes les cellules migrent vers la cathode, et une valeur -1 indique que toutes les cellules migrent vers l'anode. Le directedness d'un groupe de cellules se déplaçant au hasard est proche de 0.
- Analyser l'alignement des cellules.
- Exécutez le logiciel ImageJ. Allez dans "Fichier" → "Ouvrir" pour charger une image à analyser.
- Traiter la cellule comme une ellipse et tracer une ligne pour indiquer l'axe long d'une cellule. Allez sur "Analyser" → "Mesure" pour mesurer l'angle β entre la ligne et la direction de EF horizontale.
- Répétez 6.3.2 pour recueillir β à partir d' au moins 50 cellules de trois expériences indépendantes, et calculer moyenne cosinus β avec l' erreur standard de la moyenne (SEM).
- Répétez 6.3.1-6.3.3 pour chaque condition expérimentale.
REMARQUE: Un cos β de 1 indique que toutes les cellules alignées parallèlement à l'EF appliquée, et une valeur 0 indique que toutes les cellules alignées perpendicularly à l'EF appliquée.
. 
Où θ est l'angle entre le vecteur de l'EF appliquée (du positif au négatif) et le vecteur du début à la position finale de la cellule (figure 2G). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le stress chimique-cisaillement (CSS) Chip
La puce CSS est constituée de trois plaques de PMMA, chacune d' une épaisseur de 1 mm, fixés entre eux par deux rubans double face, chacun d'épaisseur 0,07 mm (figure 1A et 1B). La structure "arbre de Noël" génère cinq concentrations relatives de 0, 1/8, 1/2, 7/8, et 1 dans les cinq domaines de la culture. En concevant la zone de culture comme un triangle, un gradient de contrainte de cisaillement, avec une grandeur liée au taux de débit d'écoulement, la viscosité fluidique, et la dimension du canal fluidique, est créé au sein de chacune des zones. Cette puce est ensuite fixé, par l'intermédiaire d'un autre 0,07 mm d'épaisseur du ruban adhésif double-face, à une boîte de Pétri de culture de cellules CL1-5 de cancer du poumon et de la production de ROS a été observée en réponse à différentes concentrations de produits chimiques et des contraintes de cisaillement. La production de ROS dans les cellules de cancer du poumon est fortement liée à loung les métastases du cancer et le développement, et certains produits chimiques et le stress de cisaillement ont été démontrés être impliqués dans la génération de ROS 23.
Tout d' abord, pour étudier l'effet de H 2 O 2, un stimulus chimique, sur la production de ROS, les cellules ont été incubées avec circulant en continu de H 2 O 2 solutions à 0, 25, 100, 175 et 200 uM. Comme cela est représenté sur la figure 1C, l'intensité de fluorescence augmente lorsque la concentration en H 2 O 2 a augmenté, ce qui indique que H 2 O 2 a stimulé la production de ROS. Ensuite, pour étudier l'effet de la contrainte de cisaillement sur la production de ROS, les cellules ont été exposées à un gradient de contrainte de cisaillement de 0,0048 Pa à 0,0192 Pa. La figure 1D montre que l'intensité de fluorescence augmente lorsque la contrainte de cisaillement accrue (les contraintes de cisaillement sont les plus élevés et respectivement le plus bas dans les zones avant et arrière,), suggérerment que plus la contrainte de cisaillement induite plus la production de ROS. Par ailleurs, cette puce CSS a été utilisé pour étudier la production de ROS en réponse à différentes concentrations d'α-tocophérol, un antioxydant d'une forme de vitamine E. Les cellules ont été stimulées par une contrainte de cisaillement, plus α-tocophérol, de 0, 3.2, 12.5, 21.9 et 25 pg / ml. Comme cela est représenté sur la figure 1E, pour des concentrations α-tocophérol inférieur à 21,9 pg / ml, l'intensité de fluorescence diminue lorsque la concentration accrue, ce qui indique l'effet de l' α-tocophérol dans la réduction de la production de ROS. Cependant, lorsque la concentration a augmenté à 25 ng / ml, l'intensité moyenne a également augmenté, ce qui suggère que cette forte concentration d'α-tocophérol n'a pas éliminé beaucoup ERO par rapport à des concentrations plus faibles.
Le domaine de la chimie-électrique (CEF) Chip
La puce CEF est constitué d'un PMMA de 1 mm d'épaisseur et de 0,22 mm ruban adhésif double face avec des canaux fluidiques à motifs sur elle (figure 2A et 2B). De même, la structure "arbre de Noël" crée cinq concentrations relatives de 0, 1/8, 1/2, 7/8, et 1 dans les cinq domaines de la culture. En outre, ces cinq axes parallèles sont reliées perpendiculairement pour former un trajet de fluide analogue à un circuit électrique. Le champ électrique généré dans une zone de culture est liée à la conductivité du fluide, la surface de section transversale du canal, et le courant continu (courant continu) passant à travers la région. Selon la loi de tension de Kirchhoff et la loi d'Ohm, les courants dans les cinq zones de culture sont 0,49 I, 0,25 I, 0,13 I, 0,08 I, et 0,05 I, respectivement, où I est le courant continu appliquée (figure 2C). Cette puce est fixée, par l'intermédiaire du ruban adhésif double face de 0,22 mm d'épaisseur, à une boîte de Pétri de culture de cellules CL1-5 de cancer du poumon pour observer la migration cellulaire et la production de ROS en réponse à différentes concentrations chimiques et les champs électriques.
Tout d'abord, cette puce a été utilisée pour étudier la production de ROS en réponse à différentes concentrations de honokiol, différentes forces de FE, et les traitements combinés des deux. Honokiol, un polyphénol petite molécule isolée du genre Magnolia, a été constaté que antiangiogéniques, anti-inflammatoires et des propriétés antitumorales dans les études précliniques 28. Comme le montre la figure 2D, le ROS produit était presque le même pour les FE inférieurs à 67 mV / mm, mais a été augmentée avec l' augmentation de FE supérieure à cette valeur. Figure 2F montre que dans les traitements combinés des champs électriques et honokiol, le niveau ROS est resté presque le même, ce qui indique que honokiol a inhibé la production de ROS exogène (ie., ROS lié à EF stimulus), en particulier sous les FE plus élevés. La migration cellulaire dans chimique unique ou coexistant/ stimuli électriques a également été étudiée en utilisant cette puce CEF. Comme on le voit sur la figure 2F, sans l'addition de l' honokiol, le taux de migration augmente lorsque la résistance EF augmente. Après l'ajout de différentes concentrations honokiol, le taux de migration a diminué en général, ce qui suggère que l'honokiol réduit la migration des cellules éventuellement via l'inhibition de la production de ROS. Le directedness de migration est représenté sur la figure 2G. En présence d'EF seulement, des cellules de cancer du poumon a montré la migration directionnelle proéminent vers l'anode (avec des valeurs négatives). Après avoir ajouté honokiol de différentes concentrations, il y avait une légère diminution de la migration directedness pour tous les domaines EF-stimulés.
Figure 1: Les Chemical cisaillement Stress (CSS) Chip utilisé pour étudier les effets des produits chimiques et des contraintes de cisaillement sur les cellules du cancer du poumon 2.3
(A) Trois couches de substrats en PMMA sont liés entre eux par deux rubans double face pour former la puce CSS. (B) La puce CSS intégré. (C) Top: Fluorescent et images lumineuses champ de CL 1-5 cellules après avoir été traitées avec différentes concentrations de H 2 O 2. Barre d'échelle = 50 pm. Bottom: intensité de fluorescence moyenne avec SEM tracée à différentes concentrations de H 2 O 2. (D) Top: les images fluorescentes de CL 1-5 cellules sous différentes contraintes de cisaillement. Barre d'échelle = 50 pm. Bottom: intensité de fluorescence moyenne avec SEM tracée à différentes contraintes de cisaillement. (E) Top: images fluorescentes et lumineux champ de CL 1-5 cellules après avoir été stimulées par la contrainte de cisaillement avec différentes concentrations de α-tocophérol. Barre d'échelle = 50 pm. Bottom: intensité de fluorescence moyenne avec SEM tracée à différentes concentrations d'α-tocophérol. Les données présentées ici wcomme initialement publié en référence 23. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Le champ chimique-électrique (CEF) Chip utilisé pour étudier les effets des produits chimiques et des champs électriques sur les cellules du cancer du poumon 22.
(A) Une couche de PMMA est lié sur une boîte de culture par un ruban adhésif double face pour former la puce CEF. (B) Le motif fluidiques de la puce CSS. (C) Le circuit électrique équivalent de la puce microfluidique. (D) Gauche: Fluorescent et lumineux champ des images de CL 1-5 cellules après avoir été traitées avec différentes forces de FE. Barre d'échelle = 50 pm. A droite: fluorescente moyenneintensité avec SEM tracée à différents points forts de FE. (E) Gauche: Fluorescent et images champ clair de CL 1-5 cellules après avoir été traités avec honokiol et FE combiné. Barre d'échelle = 50 pm. A droite: l'intensité de fluorescence moyenne avec SEM tracée à honokiol et FE combiné. (F) Les taux de migration des cellules CL1-5 après avoir été traités avec EF seulement (marqués comme contrôle) et honokiol combinés et FE (marqués comme honokiol). (G) Le directedness de migration des cellules CL1-5 après avoir été traités avec EF seulement (marqués comme contrôle) et honokiol combiné et FE (marqué comme honokiol). Les données présentées ici a été initialement publié en référence 22. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
puces à base de PMMA-sont fabriqués en utilisant l'ablation laser et l'écriture qui sont des méthodes moins coûteuses et plus faciles par rapport aux puces à base de PDMS qui nécessitent la lithographie douce plus compliquée. Après la conception d'une puce microfluidique, la fabrication et l'assemblage peut être fait en seulement 5 min. Il y a quelques étapes critiques que l'attention devrait être accordée à l'exécution de l'expérience. Le premier est la question "assemblage". Les adaptateurs doivent être collées correctement vers le haut-couche la plus de la puce. Glue pourrait couler dans les canaux fluidiques si trop est appliqué, et le liquide pourrait couler sur la puce si trop peu de colle est utilisé. En outre, dans l'assemblage des substrats PMMA et les rubans double face, il est important d'appliquer une pression pour presser l'ensemble puce hermétiquement pour empêcher toute fuite de liquide. La seconde est la question de la «bulle». Pour éliminer les bulles, 1x PBS est continuellement coulé dans le canal fluidique pendant 1 ou 2 min à un débit de 20 ul / min débit, puis la puce est placé à l' intérieur d' un incubateur pendant une nuit sous 5% de CO 2 à 37 ° C. Si des bulles restant dans les canaux fluidiques, le débit sera non uniforme, ce qui provoque la concentration chimique et la distribution inhomogène EF. Le troisième est la question "cellule de chargement". Le nombre de cellules chargées dans les zones de culture doit être bien contrôlée. Si le nombre de cellules est trop faible, de nombreux essais expérimentaux devraient être menées afin de recueillir suffisamment de données à des fins statistiques. Si le nombre de cellules est trop élevé, il sera difficile de distinguer les cellules individuelles et de quantifier leur migration.
Dans la puce CSS, une structure "arbre de Noël" combiné avec une zone de culture triangulaire génère différentes concentrations de produits chimiques dans cinq zones, chacune ayant un gradient de contrainte de cisaillement. les contraintes de cisaillement fluidiques sont connus pour affecter l'attachement, la morphologie, la migration et l'activité des cellules. Les contraintes de cisaillement aussi faibles que 0,25 à 0,6 Pa pourrait interfacer la fixation des cellules, Les valeurs et encore plus de contraintes (0,5 -10 Pa) ont été signalés pour éliminer les cellules adhérentes 29. Les contraintes de cisaillement laminaires allant de 0,8 à 1,5 alignement cellulaire induite Pa dans la direction d'écoulement 30 et des valeurs encore plus basses (de 0,1 à 1 Pa) sont connus pour affecter la morphologie cellulaire et la perméabilité 29. De plus, les cellules musculaires lisses soumis à des contraintes de cisaillement de 2-120 Pa ont connu une baisse du nombre de cellules 31. Lu et al. rapporté la conception et la construction de dispositifs de cisaillement microfluidiques pour l' analyse quantitative de l' adhérence cellulaire 27. La contrainte de cisaillement dans le canal de fluide a été modifié en changeant les dimensions du canal. Chin et al. décrit un système hémodynamique Lab-on-a-chip pour commander le débit du milieu de culture de l' écoulement dans le micro-canal pour mimer le profil d'écoulement du sang dans le récipient 32. La contrainte de cisaillement dans le canal de fluide a été modifié en changeant le débit du fluide d'écoulement. dans lesoi deux appareils, même si une contrainte de cisaillement de toutes les valeurs pourrait être généré, une seule valeur unique était disponible au sein d'une zone de culture à un moment donné. Par comparaison, la puce CSS présente l'avantage de fournir un gradient de contrainte de cisaillement dans une zone triangulaire, en augmentant le débit expérimental en particulier à des fins de dépistage.
Dans la puce CEF, les zones de culture de la structure "arbre de Noël" sont perpendiculaires reliés pour former un chemin fluidique analogue à un circuit électrique. À appliquer une courant continu, cinq concentrations EF sont générées à l'intérieur des zones de culture ayant chacun un flux d'une concentration chimique spécifique. Classiquement, des expériences electrotactic ont été effectuées sur des boîtes de Petri où les problèmes de FE imprécises, évaporation moyenne, grande cellules / consommation de réactif, et une augmentation de chauffage Joule pourraient se produire. Clos, dispositifs microfluidiques miniatures surmonter efficacement ces inconvénients. Par exemple, pour étudier le électrotaxie of cellules T mémoire du sang humain, Lin et al. fait état d' un dispositif microfluidique plastique contenant deux, côte à côte des micro-canaux identiques, deux embouts de pipette modifiés servaient de réservoirs moyennes, et deux électrodes de platine pour l' application EF 15. Pour augmenter le débit, les puces electrotactic à base de PMMA ont été fabriqués pour fournir de multiples points forts EF en un seul appareil 12,33. En outre, des dispositifs microfluidiques capables de générer des produits chimiques contrôlables et des stimuli électriques sont simultanément d'un grand intérêt. Li et al. fabriqué un dispositif microfluidique à base de PDMS pour générer des gradients chimiques / FE simples ou coexistant pour étudier la chimiotactique ou la migration electrotactic des cellules T 14. Kao et al. , Utilise un dispositif microfluidique similaire à moduler le chimiotactisme des cellules de cancer du poumon en utilisant des coefficients d' émission 12. Dans ces deux dispositifs, une structure en forme de Y a été appliquée pour créer un gradient de concentration stable dans une seule EF appliquée. Hou et al. rapporté une puce multicanal à double champ électrique pour étudier l'effet simultané de produits chimiques et les FE sur les cellules cancéreuses du poumon 21. Ce dispositif a été en mesure de fournir 8 combinaisons de stimuli électriques / chimiques (2 électrique x 4 chimiques) dans une expérience. Bien que le débit augmente, la capacité de cette puce est limitée à (1) une seule résistance EF (plus un zéro en tant que contrôle) et (2), quatre pompes à seringue sont nécessaires pour pomper des produits chimiques dans quatre canaux indépendants. Par comparaison, la puce CEF présente a l'avantage de générer cinq points forts EF avec cinq concentrations de produits chimiques par l'intermédiaire d'un seul ensemble d'électrodes et de 2 pompes à seringue.
Même si ces puces sont faciles à fabriquer, ils ont quelques limitations. Tout d'abord, seuls cinq concentrations "spécifiques" et cinq points forts "spécifiques" EF peuvent être générés. D'autre part, la largeur du canal fluidique ne peut pas être inférieure à 1 mm en raison de la focalisation duCO 2 faisceau laser. Cependant, en contrôlant précisément la concentration chimique dans l'entrée et le courant électrique passant à travers le canal fluidique, toutes les concentrations et les forces EF peuvent être atteints dans les domaines de la culture. En conclusion, la présente CSS et puces CEF sont capables de fournir des cellules avec des stimuli chimiques contrôlables unique ou coexistant / électrique contrainte / cisaillement. Dans une puce CSS unique, cinq concentrations chimiques différentes en combinaison avec un gradient de contrainte de cisaillement peuvent être générés. En outre, dans une seule puce de CEF unique, cinq concentrations chimiques différentes en combinaison avec cinq points forts EF peuvent être créés. En augmentant les branches de la structure en "arbre de Noël", le débit de ces puces peut être encore augmentée. Ces puces sont démontrées être un, gain de temps facile, fiable, et la plate-forme à haut débit pour les études de comportement cellulaire sous stimuli chimiques / électriques de stress / cisaillement.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10 cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImageJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
References
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