Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

עיצוב מכשירי microfluidic ללימוד ותגובות ניידות תחת בית או להתאבדות כימית / חשמל / שאר מתח גירויים

Published: August 13, 2016 doi: 10.3791/54397
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 3, 1
1Department of Agricultural Chemistry, National Taiwan University, 2Department of Physics, Fu-Jen Catholic University, 3Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica

Abstract

מכשירי microfluidic מסוגלים ליצור א-סביבת מייקרו הסלולר מדויקת לשליטה של ​​pH, טמפרטורה, ריכוז מלח, וגירויים פיסיים או כימיים אחרים. הם שימשו בדרך כלל ללימודי תאים במבחנה על ידי מתן in vivo כמו הסביבה. במיוחד, כיצד תאים בתגובה הדרגתית כימי, שדות חשמליים, מדגיש גזירת משך אינטרסים רבים מאז התופעות האלה חשובות להבנת תכונות ופונקציות הסלולר. שבבי microfluidic אלה יכולים להיות עשויים זכוכית מצעים, פרוסות סיליקון, polydimethylsiloxane (PDMS) פולימרים, polymethylmethacrylate (PMMA) מצעים, או פוליאתילן טרפתאלט מצעים (PET). מתוך החומרים הללו, מצעים PMMA הם זולים ניתן לעבד בקלות באמצעות אבלציה לייזר וכתיבה. למרות כמה מכשירים microfluidic עוצבו מפוברק להפקה מרובה, המתקיימות זו בצד זו כימית גירויים חשמליים, אף אחד מהם לא נחשביעיל מספיק בהפחתת חזרות ניסוי, בפרט למטרות הקרנה. בדו"ח זה, אנו מתארים תכנון הייצור שלנו של שני שבבים microfluidic מבוסס PMMA לחקירת תגובות הסלולר, בייצור של מיני חמצן תגובתי ואת הגירה, תחת גירויי מתח יחידים או להתאבדות כימית / חשמל / גזירה. השבב הראשון מייצר חמישה ריכוזים יחסיים של 0, 1/8, 1/2, 7/8 ו -1 באזורי התרבות, יחד עם שיפוע לחץ גזירה מיוצר בתוך כל אחד מהתחומים האלה. השבב השני מייצר אותו הריכוזים יחסיים, אך עם חמש עוצמות שדה חשמלי שונות שנוצרו בתוך כל אזור תרבות. התקנים אלה לא מספקים תאים רק עם תפוקה מדויק, מיקרו-סביבה לשליטה אלא גם להגדיל את ניסיוני מאוד.

Introduction

בתאי vivo מוקפים במגוון ביומולקולות כולל תאי מטריקס (ECM), פחמימות, שומנים, ותאים אחרים. הם functionalize ידי להגיב לגירויים מיקרו-סביבתיים כגון אינטראקציות עם ECM ותגובות הדרגתיים הכימי של גורמי גדילה שונים. באופן מסורתי, מחקרים תא במבחנה נערכים במנות התא בתרבות שבה הצריכה של תאים ריאגנטים גדול ותאי לגדול סטטי (לא מחזורי) בסביבה. לאחרונה, מכשירים מפוברקי מייקרו משולב עם רכיבים נוזליים ספקו פלטפורמה חלופית מחקרי תא בצורה לשליטה יותר. מכשירים כאלה מסוגלים ליצור מייקרו-סביבה מדויקת של גירויים כימיים ופיסיים תוך מזעור צריכת תאים ריאגנטים. שבבי microfluidic אלה יכולים להיות עשויים זכוכית מצעים, פרוסות סיליקון, polydimethylsiloxane (PDMS) פולימרים, polymethylmethacrylate מצעים (PMMA), או polyethylenetereפתלטים (PET) מצעים 1-3. מכשירים מבוססי PDMS הם שקופים, ביולוגית, ו חדיר לגזים, מה שהופך אותם מתאימים תרבות מחקרים תא לטווח ארוך. מצעים PMMA ו PET הם זולים וקלים להיות מעובד באמצעות אבלציה לייזר וכתיבה.

מכשירי microfluidic אמורים לספק תאים עם סביבת מייקרו יציבה לשליטה שבו תאים כפופים כימי שונה וגירויים פיסיים. לדוגמה, שבבי microfluidic משמשים ללמוד chemotaxis של התאים. במקום שיטות מסורתיות המעסיקות בוידן קאמרית נימי 4,5 התקני fluidic מיניאטורי אלה יכולים ליצור הדרגתיים כימיים מדויקים ללימוד 1,6,7 ההתנהגויות של התאים. דוגמא נוספת היא ללמוד הגירה כיוונית של התאים תחת שדות חשמליים (EFS) חברת electrotaxis בשם תופעה. התנהגויות Electrotactic של תאים דווחו להיות קשורות עצב התחדשות 8, התפתחות עוברית 9,ו ריפוי פצעים 10,11. מחקרים רבים בוצעו כדי לחקור את electrotaxis של סוגי תאים שונים, כולל תאים סרטניים 12,13, לימפוציטים 14,15, תאי לוקמיה 11, ותאי גזע 16. כמקובל, צלחות פטרי וכוסות כיסוי המשמשים לבניית תאי electrotactic להפקת מקדמי הפליטה 17. Setups פשוט כזה מציב בעיות של אידוי בינוני וב- EFS המדויקת, אבל אפשר להתגבר עליהם על ידי מכשירי microfluidic של סגורה, ערוצי fluidic מוגדרים היטב 12,18,19.

כדי ללמוד תגובות הסלולר באופן שיטתי תחת גירויים כימיים וחשמליים מדויקים, לשליטה, זה יהיה תועלת רבה לפתח מכשירי microfluidic מסוגלים לספק תאים עם גירויים מרובים בו זמנית. לדוגמה, Li et al. דיווחתי על מכשיר microfluidic מבוסס PDMS ליצירת יחיד או להתאבדות הדרגתית כימי וב- EFS 20. קאו et al. devברח שבב microfluidic דומה לווסת את chemotaxis של תאי סרטן הריאות על ידי מקדמי פליטה 6. יתר על כן, להגדיל את התפוקה, ואח הואו. מעוצב מפוברק שבב PMMA מבוסס רב-כפול-חשמל-שדה לספק תאים עם 8 גירויים משולבים שונים, להיות (2 עוצמות EF x 4 ריכוזים כימיים) 21. כדי להגביר עוד יותר את לאורך ולהוסיף גירוי מאמץ הגזירה, פתחנו שני מכשירים microfluidic מבוסס PMMA ללימוד תגובות הסלולר תחת גירויי מתח יחיד או להתאבדות כימית / חשמל / גזירה.

דווח ע"י Lo et al. 22,23, מכשירים אלה מכילים חמישה ערוצי תרבית תאים עצמאיים בכפוף זורם fluidic רציף, מחקו את מערכת דם in vivo. בשנת השבב הראשון (שבב לחץ הכימי-גזירה או שבב CSS), חמישה ריכוזים יחסיים של 0, 1/8, 1/2, 7/8 ו -1 נוצרים באזורי התרבות, ואת שיפוע לחץ גזירה הוא produCED בתוך כל אחד מחמשת תחומי התרבות. השבב השני (השבב בתחום הכימי-חשמלי או שבב CEF), באמצעות סט אחד של אלקטרודות ו -2 משאבות מזרק, חמש עוצמות EF נוצרות בנוסף לחמישה ריכוזים כימיים שונים בתוך אזורי התרבות אלה. חישובים וסימולציות נומריות מבוצעים לעיצוב טוב יותר ולהפעיל את השבבים הללו, ותאי סרטן הריאות בתרבית בתוך מכשירים אלה כפופים גירויים יחידים או coexisting לצפיית תגובותיהם ביחס לייצור (reactive oxygen species ROS), שיעור ההגירה, ואת כיוון הגירה. שבבים אלה הם הפגינו להיות חוסכים זמן, תפוקה גבוהה והתקנים אמינים עבור חוקרת כיצד תאים מגיבים לגירויים שונים מיקרו-סביבתיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שבב עיצוב ו ייצור

  1. צייר דפוסים להיות ablated על מצעי PMMA וקלטות פעמים בצד באמצעות תוכנה מסחרית 24.
    1. כדי לחקור את ההשפעות של ריכוזים כימיים מדגיש גזירה, לצייר צורה "עץ חג המולד" עם רוחב משתנה בסופה בכל אחד מחמשת אזורי התרבות (איור 1A ו -1 B).
    2. כדי לחקור את ההשפעות של ריכוזים כימיים לשדות חשמליים, לצייר צורה "עץ חג המולד" עם שני ערוצי fluidic יותר לגשרי מלח (איור 2 א ו -2).
  2. סופר דפוס בודד על גיליון PMMA או דבק דו-הצד על ידי טעינת הקבצים המתאימים לתוך חרט ליזר CO 2.
    1. הפעל את הלייזר חרט, ולבדוק את החיבור שלה אל המחשב. פתח את התבנית כדי להיות ablated באמצעות תוכנה מסחרית.
    2. הנח גיליון PMMA או o דבק דו-צדדיהעליון n השלב של חרט. התאם את המיקוד של הלייזר CO 2 במידת הצורך באמצעות סרגל כיול הלייזר הוא Ne-גלוי.
    3. טען את התבנית לתוך החרט עבור אבלציה על סדין PMMA או את הקלטת.
    4. תרים את הסדין או קלטת בדוגמת, להסיר חתיכות רצויות, לנקות את השטח עם נושבת חנקן.
      הערה: העובי של גיליון PMMA הוא 1 מ"מ, וכי של הסרט דו צדדי הוא 0.07 מ"מ או 0.22 מ"מ.

2. צ 'יפ אסיפה

  1. עם דבק סופר, לצרף מתאמים אקריליק (= גובה x רוחב x אורך 10 מ"מ x 10 מ"מ x 5 מ"מ, בעלת תבריג באמצע) לשכבה העליונה ביותר של השבב על ידי יישור ההברגה ואת ריקים בחלק העליון שכבת -most. מתאמים אלה לשמש בינוני צריכת אוויר / שקעים ומחברי גשר מלח.
  2. הרכב את שבב microfluidic בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית.
  3. הרכב את שבב microfluidic לחץ כימי-גזירה (שבב CSS).
    1. אttach 3 גיליונות של גליונות PMMA scribed באמצעות 2 חתיכות של נייר דו-צדדי scribed. (איור 1A ו -1 B).
    2. להוסיף חתיכה אחת יותר של הקלטת 0.07 מ"מ עובי דו צדדי לתחתית של השבב ולצרף השבב כדי בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ.
    3. שים את שבב הרכבה בתא ואקום למשך לילה.
  4. כדי להרכיב את שבב שדה חשמלי-הכימי (שבב CEF), לצרף את גיליון PMMA לקלטת דו צדדית של עובי = 0.22 מ"מ (איור 2 א ו -2).
    1. צרף בגיליון PMMA scribed קלטת דו צדדית כדי בצלחת 10 ס"מ קוטר פטרי באמצעות פיסת אותו סרט.
  5. השאר את השבב התאסף בתוך מכסה המנוע ולחשוף אותו UV למשך 30 דקות עבור עיקור.
  6. חבר את פתחי הכניסה לשני מזרקים 3 מ"ל באמצעות צינורות פלסטיק ואגוזים חזק האצבע. חבר היציאה לצינור פסולת באמצעות צינור פלסטיק אגוז אצבע חזקה.
    הערה: חיטויכל הצינורות והאגוזים ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לפני השימוש.
  7. לאט לוחץ על המתג על מזרק ממשלת ערוצי fluidic עם PBS. Push מזרקים קדימה ואחורה כדי להסיר בועות.
  8. שים את השבבים בתוך אינקובטור הלילה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2.
    הערה: שני שלבים אלה נועדו לשטוף את השבב ולהסיר כל בועות שנותרו בתוך השבב.
  9. קח את השבב מתוך האינקובטור.
  10. כן גשרי מלח אגרו להפקת שדות חשמליים בשבב CEF.
    1. ממיסים 3% נקודת התכה נמוכה agarose ב בופר פוספט 1x חיץ (PBS) באמצעות מיקרוגל.
    2. להזריק agarose-שלבית פתרון לתוך תעלה גשר מלח להכניס את האלקטרודות לפני הפתרון מבצר.
    3. מניחים אלקטרודות כלוריד-כסף כסף / לתוך אגוזים צינורי.
  11. חבר את המזרקים על משאבות המזרק, וזרימת מדיום התרבות ברציפות (EagleR Modified של Dulbecco17; s בינוני, DMEM) לתוך התעלה fluidic במשך 10 דקות בקצב זרימה של 20 μl / min להחליף PBS.

3. תא הכנה והגדרה ניסיון

הערה: טרום חמים 1x PBS, בינוני תרבות (DMEM בתוספת FBS), טריפסין באמבט מים 37 ° C לפני השימוש.

  1. פלייט 2 x 10 5 סרטן ריאות תאים CL1-5 25,26 בצלחת 10 ס"מ פטרי מסופק עם DMEM בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS). דגירה התאים בתוך אינקובטור מתחת לגיל 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס עד מפגש 90%.
  2. לשאוב בינוני לשטוף את התאים פעם עם PBS 1x מחומם מראש. הוסף 2 מ"ל של חיץ טריפסין 0.05% אל התאים לחכות ל -2 עד 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את התאים.
  3. מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ"ל ולהוסיף 6 מ"ל של מדיום תרבות לתוך הצינור. בעדינות להפוך את הצינור לערבוב ולהוציא 5 μl של המדיום המכיל תאים עבור לספור את מספר הסלולרי בתוך hemocytometer.
  4. צנטריפוגה הצינור ב 300 x גרם במשך 5 דקות. להשעות 10 6 תאים ב 1 מ"ל של מדיום תרבות ומקום המדיום המכיל תאים בתוך מזרק 1 מ"ל.
  5. להשרות מדיום התא המכיל לתוך שבב microfluidic משקע ולוודא שהפתרון מפיץ כל דרך החמישה תחומי התרבות. דגירת השבב בתוך אינקובטור מתחת לגיל 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.

4. התקנה ניסיונית

  1. קח את השבב מתוך האינקובטור ולמקם אותו על גבי פח תחמוצת אינדיום שקוף דוד זכוכית (איטו).
    הערה: זכוכית איטו מחוברת בקר פרופורציונלי-נפרד נגזרים (מח"ש) לשמירה על הטמפרטורה ב 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס באמצעות משוב מצמד תרמי הידק בחוזקה בין דוד איטו ואת השבב.
  2. שים את הרכבת שבב-דוד על גבי במת XY ממונעת של מיקרוסקופ הפוכה למעקב אחר נדידת תאים או בשלב XY קבוע שלמיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך למדידת הייצור של ROS.
  3. כדי ליצור ריכוזים כימיים שונים, למלא שני מזרקים עם 5 מיליליטר של תמיסות כימיות של ריכוזים יחסיים 0 ו -1 (מומס מדיום תרבות) ולשאוב אותם לתוך השבב ברמות ספיקה רצויה: בשבב CSS, בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר / min עבור שעה 1; שבב CEF, בקצב זרימה של 20 μl / min שיעור 20 דקות ו זרימה הראשונה של 20 μl / hr לעוד 120 דקות (סה"כ זמן = 2 hr).
  4. בשנת שבב CEF, למעקב אחר נדידת תאים, תכנית במת XY של המיקרוסקופ לחזור לצלם, באמצעות רפלקס דיגיטלית עדשה אחת (DSLR) מצלמה, של שדה מסוים של נוף (FOVs) בתוך אזורי תרבות כל 15 דקות עבור 2 hr.
  5. למדידת הייצור של ROS, השתמש אינדיקטור הקרינה מבוססי diacetate 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce (2'-7'-DCFDA).
    1. הכן את המניות של 2'-7'-DCFDA ב -10 מ"מ di כיתה וביולוגיה מולקולריתsulfoxide מתיל (DMSO). לדלל DCFDA ב DMEM רק ללא בסרום (5 מיקרומטר DMEM). Deacetylase הפוטנציאל יכול להגדיל את אותות רקע ולהפחית את אותות בתאים.
    2. אחרי שעה 1 של גירוי מאמץ הגזירה בשבב CSS או אחרי שעה 2 של גירוי EF בשבב CEF, לשאוב 2'-7'-DCFDA (5 מיקרומטר DMEM) לתוך שבב בקצב זרימה של 20 μl / min 20 דק 'הראשון בקצב זרימה של 20 μl / שעה למשך 20 דקות אחרות. לשטיפה, לשאוב DMEM לתוך השבב בקצב זרימה של 20 μl / שעה למשך 20 דקות.
    3. קח תמונות, באמצעות מצלמה תשלום מצמידים מכשיר (CCD), של FOVs מסוימים בתוך תחומי תרבות לניתוח בעוצמות פלורסנט.

5. חישובים של ריכוזים כימיים, מאמצי גזירה, ואת שדות חשמליים

  1. בשני שבב CSS ו- שבב CEF, לחשב את הריכוזים הכימיים בחמשת תחומי התרבות. לדוגמה, על ידי הזרקת H 2 O 2 של concentrations 0 ו -200 מיקרומטר מן שני פתחי הכניסה, ריכוזי 0, 25, 100, 175, ו -200 מיקרומטר נוצרים.
    הערה: אם תניח כי כל הנוזלים לפצל זרימה חלקה באופן שווה סביב המזלג, הריכוזים היחסיים בחמשת תחומי התרבות הם 0, 1/8, 1/2, 7/8 ו -1, בהתאמה.
  2. בשנת שבב CSS, לחשב את מאמץ הגזירה (τ) בתוך כל אחד מאזורי התרבות באמצעות משוואה 1 27, שם Q הוא קצב זרימת נפח, η היא צמיגות fluidic, h הוא גובה של הערוץ, W הוא רוחב של הערוץ.
    הערה: על ידי הגדרת Q = 0.3 מ"ל / דקה בכל מפרצון (Q = 0.12 מ"ל / דקה בכל אזור התרבות), η = 0.0008 Pa · s עבור המדיום תרבות, h = 1 מ"מ, ו W = 1 ~ 4 מ"מ, מאמץ גזירה מחושב יותר והוא נע בין 0.0048 Pa (אזור רחב 4 מ"מ) כדי 0.0192 Pa (אזור רחב 1 מ"מ).
  3. בשבב CEF, לחשב את כוח EF בתוך כל אחד מאזורי התרבות באמצעות E = I / (EFF σA) (חוק אוהם), כאשר I הוא הזרם החשמלי זורם מעבר לתעלת fluidic, σ היא מוליכות החשמלית של מדיום התרבות, ו- A EFF הוא שטח החתך האפקטיבי של הערוץ.
    הערה: σ שימוש = 1.38 Ω -1 מ -1 עבור המדיום תרבות ו- A EFF = 0.22 מ"מ 2 (width = 1 מ"מ וגובה = 0.22 מ"מ), את הכוח EF מחושב כ- E (mV / מ"מ) = אני ( א) × 3.3 × 10 6.
    1. כפי שניתן לראות בתרשים 2 ד, לטפל המעגל השווה חמישה מעגלים בניתוח קיסרי עם ארבעה (8 + 35 + 8) מגזרים ואחד (5 + 35 + 5) קטע.
      הערה: על ידי ניתוח מעגל מקביל זה על פי חוק מתח קירכהוף ואת חוק אוהם, זרמים הזורמים על פני חמש תרבות הםכמו, אני 1 עד 5 I מלמטה למעלה, מחושבים להיות סביב 0.49 אני (אזור 1), 0.25 אני (אזור 2), 0.13 אני (אזור 3), 0.08 אני (אזור 4), ו 0.05 אני (אזור 5), בהתאמה, כאשר I הוא (DC זרם ישר בסך הכל). עם dc היישומית של 0.157 mA, מקדמי פליטת 254, 130, 67, 41, ו -26 mV / מ"מ נוצרים בתוך החמישה אזורי התרבות.
      הערה: לניתוח חשמל פשוט של רשת microfluidic, בכל מגזרי fluidic נחשבים נגדים עם התנגדות יחסי האורכים שלהם.

6. ניתוח נתונים

הערה: ניתוח הנתונים מתבצע באמצעות תוכנת ImageJ.

  1. נתח את ייצור ROS.
    1. הפעל את תוכנת ImageJ. יש להקליק על "קובץ" → להרחיב לטעון תמונה ניאון כדי להיות מנותח.
    2. יש להקליק על "תמונה" → "סוג" → "16 סיביות" לשנות את imגיל סולם אפור.
    3. לצייר מצולע לצרף לתא. יש להקליק על "נתח" → "מדוד" כדי למדוד את עוצמת פלורסנט הממוצע של התא.
    4. חזור 6.1.3 לאסוף עוצמות מ -50 תאים לפחות של שלושה ניסויים בלתי תלויים, ולחשב את העוצמת הממוצעת עם סטיית התקן של ממוצע (SEM).
    5. חזור 6.1.1-6.1.4 עבור כל תנאי הניסוי.
  2. לנתח נדידת תאים.
    1. הפעל את תוכנת ImageJ. יש להקליק על "קובץ" → להרחיב לטעון תמונה נלקחה ב זמן = 0 להיות מנותח.
    2. לצייר מצולע לצרף לתא. יש להקליק על "נתח" → "מדוד" למדוד את מרכז המסה של התא (x 1, y 1).
    3. חזור 6.2.1- 6.2.2 למדוד את מרכז המסה של אותו תא כמו (x 2, y 2) מתמונה אחרת לקחת בשלב = t.
    4. חשב את שיעור ההגירה (ב מיקרומטר / hr) שלזה תא משוואה 2 .
    5. חזור 6.2.1-6.2.4 לאסוף שיעורי הגירה מ -50 תאים לפחות של שלושה ניסויים בלתי תלויים, ולחשב את שיעור הגירה ממוצע עם סטיית התקן של הממוצע (SEM).
    6. מ 6.2.2 ו 6.2.3, לחשב את הכוונה על נדידת תאים זה כמו קוסינוס θ או משוואה 3 , שבו θ היא הזווית בין הווקטור של EF יישומית (מחיובי לשלילי) ואת הווקטור מההתחלה לתפקיד סוף התא (2G איור).
    7. חזור 6.2.6 לאסוף הכוונת גירה מ -50 תאים לפחות של שלושה ניסויים בלתי תלויים, ולחשב את הכוונה על ההגירה הממוצעת עם סטיית התקן של ממוצע (SEM).
    8. חשב את שיעור ההגירה הממוצעת עם SEM ואת הכוונת הגירה הממוצעת עם SEM עבור כל תנאי ניסוי.
      הערה: כוונה עלשל +1 עולה כי כל התאים נודדים לעבר הקתודה, וערך -1 מציין כי כל התאים נודדים לעבר האנודה. ההכוונה של קבוצת תאים שנעה באקראי הוא קרוב ל -0.
  3. לנתח יישור נייד.
    1. הפעל את תוכנת ImageJ. יש להקליק על "קובץ" → "פתח" כדי לטעון תמונה להיות מנותח.
    2. פנק את התא כמו אליפסה למתוח קו כדי לציין את הציר הארוך של תא. יש להקליק על "נתח" → "מדוד" למדוד את הזווית β בין הקו בכיוון EF האופקי.
    3. חזור 6.3.2 לאסוף β מ -50 תאים לפחות של שלושה ניסויים בלתי תלויים, ולחשב ממוצע קוסינוס β עם סטיית התקן של הממוצע (SEM).
    4. חזור 6.3.1-6.3.3 עבור כל תנאי הניסוי.
      הערה: cos β של +1 עולה כי כל התאים ליישר במקביל השימושי EF, וערך 0 מציין כי כל התאים ליישר perpendicularly אל יישומי EF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

את הלחץ הכימי-הגזירה (CSS) צ'יפ

שבב CSS עשוי שלושה גיליונות PMMA, כל אחד מ"מ עובי 1, מצורפים יחד באמצעות שתי קלטות דו צדדיות, כל אחד בעובי 0.07 מ"מ (איור 1 א 'ו -1 B). המבנה "עץ חג המולד" מייצר חמישה ריכוזים יחסיים של 0, 1/8, 1/2, 7/8 ו -1 בחמשת תחומי התרבות. על ידי תכנון באזור התרבות כמשולש, שיפוע לחץ גזירה, בעצמה הקשורה קצב זרימת הנפח, צמיגות fluidic, והממד של ערוץ fluidic, נוצר בתוך בכל אחד מהתחומים. שבב זה מחובר אז, דרך אחר קלטת 0.07 מ"מ עובי דו צדדית, כדי בצלחת פטרי עבור תאי CL1-5 culturing סרטן הריאות ואת הייצור של ROS נצפה בתגובת ריכוזים כימיים שונים מדגיש גזירה. ההפקה של ROS בתאים סרטניים ריאות קשורה מאוד lung סרטן גרורות והתפתחות, וכימיקלים מסוימים מאמץ גזירה הודגמו להיות מעורבות ROS דור 23.

ראשית, כדי לחקור את ההשפעה של H 2 O 2, גירוי כימי, על הייצור של ROS, תאים הודגרו עם הרציפה זורמת של H 2 O 2 פתרונות ב 0, 25, 100, 175, ו -200 מיקרומטר. כפי שניתן לראות בתרשים 1 ג, עוצמת ניאון גדל ריכוז H 2 O 2 מוגברת, המציין כי H 2 O 2 מגורה ייצור של ROS. בשלב הבא, כדי לחקור את ההשפעה של לחץ גזירה על הייצור של ROS, תאים נחשפו שיפוע לחץ גזירה של 0.0048 Pa כדי 0.0192 Pa. 1D האיור מראה כי עוצמת הניאון גדלה ככל מאמץ הגזירה גדל (מדגיש הגזירה היו הגבוה ביותר והנמוך ביותר בתחומים מלפנים ומאחור, בהתאמה), מציעing כי מאמץ הגזירה גבוה המושרה יותר ייצור ROS. כמו כן, שבב CSS זה שמש כדי ללמוד את הייצור של ROS בתגובת ריכוזים שונים של טוקופרול α, נוגד חמצון של צורת תאי ויטמין E. היה מגורה על ידי מאמץ גזירה בתוספת α-טוקופרול של 0, 3.2, 12.5, 21.9 , ו -25 מיקרוגרם / מ"ל. כפי שניתן לראות בתרשים 1E, לריכוזי-טוקופרול α נמוך מ 21.9 מיקרוגרם / מ"ל, עוצמת ניאון ירד כמו ריכוז מוגבר, המציין את השפעת α-טוקופרול בהפחתת הייצור של ROS. עם זאת, כמו ריכוז מוגבר ל -25 מיקרוגרם / מ"ל, עוצמת מתכוון גדל גם, דבר המצביע על כך ריכוז גבוה זה של טוקופרול α לא לחסל ROS הרבה בהשוואה לריכוז נמוך.

השדה הכימי-החשמלי (CEF) צ'יפ

שבב CEF הוא עשוי PMMA 1 מ"מ בעובי ו 0.22 מ"מ סרט דו צדדי עם ערוצי fluidic בדוגמת על זה (איור 2 א ו -2). בדומה לכך, המבנה "עץ חג המולד" יוצר חמישה ריכוזים יחסיים של 0, 1/8, 1/2, 7/8 ו -1 בחמשת תחומי התרבות. בנוסף, חמישה אזורים אלו מקבילים מחוברים בניצב כדי ליצור נתיב fluidic מקביל מעגל חשמלי. השדה החשמלי שנוצר בתוך אזור תרבות קשור המוליכות של הנוזל, שטח החתך של הערוץ, ואת הזרם החשמלי הקבוע (DC) עובר דרך השטח. על פי חוק מתח קירכהוף ואת חוק אוהם, הזרמים בחמשת תחומי התרבות הם 0.49 אני, 0.25 אני, 0.13 אני, 0.08 אני, ו 0.05 אני, בהתאמה, כאשר I הוא dc מיושם (איור 2 ג). שבב זה מצורף, באמצעות קלטת 0.22 מ"מ עובי דו צדדית, כדי בצלחת פטרי עבור תאים culturing CL1-5 סרטן ריאות להתבונן נדידת תאים ואת production של ROS בתגובה ריכוזים כימיים שונים שדות חשמליים.

ראשית, השבב הזה שימש ללמוד את הייצור של ROS בתגובה ריכוזים שונים של honokiol, עוצמות שונות של מקדמי הפליטה, וטיפולים בשילוב של שניהם. Honokiol, פוליפנול מולקולות קטנות המבודד מן הסוג מגנוליה, נמצא כבעלת תכונות antiangiogenic, אנטי-דלקתיות, אנטי-סרטניות במחקרים פרה 28. כפי שניתן לראות בתרשים 2 ד, את ROS מיוצר כמעט היה זהה עבור כל מקדמי פליטה נמוך מ -67 mV / מ"מ, אך הוגדל עם הגדלת מקדמי הפליטה מעל ערך זה. איור 2E מראה כי תחת טיפולים משולבים של שדות חשמליים honokiol, רמת ROS נשאר כמעט אותו דבר, המציין כי honokiol עיכב את הייצור של אקסוגניים ROS (כלומר., ROS הקשורים לגירוי EF), במיוחד תחת מקדמי הפליטה גבוה. הגירת התא תחת כימי יחיד או דו-קיום/ גירויים חשמליים גם נחקר באמצעות שבב CEF זה. כפי שניתן לראות באיור 2F, ללא תוספת של honokiol, שיעור הגירה מוגברת ככל שעוצמת EF גדל. לאחר הוספת honokiol של ריכוזים שונים, שיעור ההגירה ירד בכלל, דבר המצביע על כך נדידת תאים מופחת honokiol ואולי באמצעות דיכוי ייצור של ROS. הכוונת ההגירה מוצגת באיור 2G. בנוכחות EF רק, תאי סרטן ריאות הראו הגירה כיוונית בולט לעבר האנודה (עם ערכים שליליים). לאחר הוספת honokiol של ריכוזים שונים, חלה ירידה קלה הכוונת הגירה לכל תחומי מגורה EF.

איור 1
איור 1: המתח הכימי-גזירה (CSS) צ'יפ לשמש כדי לחקור את ההשפעות של כימיקלים שאר לחצים על תאי סרטן הריאות 2.3
(א) שלוש שכבות של מצעים PMMA כרוכים יחד באמצעות שתי קלטות דו צדדית כדי ליצור את שבב CSS. (ב) השבב המשולב CSS. (ג) למעלה: פלורסנט ותמונות בהיר שדה של CL 1-5 תאים לאחר שטופלו בריכוזים שונים של H 2 O 2. בר סולם = 50 מיקרומטר. תחתון: עוצמת פלורסנט Mean עם SEM זממה בריכוזים שונים של H 2 O 2. (ד) למעלה: תמונות פלורסנט של CL 1-5 תאים תחת מאמצי גזירה שונים. בר סולם = 50 מיקרומטר. תחתון: עוצמת פלורסנט Mean עם SEM זממה ב מדגיש גזירה שונה. (ה) למעלה: פלורסנט ותמונות בהיר שדה של CL 1-5 תאים לאחר מגורה עם מאמץ הגזירה עם ריכוזים שונים של טוקופרול α. בר סולם = 50 מיקרומטר. תחתון: עוצמת פלורסנט Mean עם SEM זממה בריכוזים שונים של טוקופרול α. הנתונים המוצגים כאן wכפי שפורסם לראשונה ב- התייחסות 23. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: השדה הכימי-חשמלי (CEF) צ'יפ לשמש כדי לחקור את ההשפעות של כימיקלים חשמליים שדות על תאי סרטן הריאות 22.
(א) שכבה אחת של PMMA הוא כבול על צלחת תרבות באמצעות דבק דו-צדדי כדי ליצור את שבב CEF. (ב) דפוס fluidic של השבב CSS. (ג) המעגל החשמלי המקביל של שבב microfluidic. (ד) שמאל: פלורסנט ותמונות בהיר שדה של CL 1-5 תאים לאחר שטופלו עוצמות שונות של מקדמי פליטה. בר סולם = 50 מיקרומטר. מימין: Mean ניאוןעצמת SEM זממה בעוצמות שונות של מקדמי פליטה. (E) שמאל: פלורסנט ותמונות בהיר שדה של CL 1-5 תאים לאחר שטופלו honokiol וב- EFS בשילוב. בר סולם = 50 מיקרומטר. מימין: ממוצע עוצמת פלורסנט עם SEM זממו ב honokiol וב- EFS בשילוב. (F) שיעורי ההגירה של תאי CL1-5 לאחר שטופל מקדמי פליטה בלבד (מסומן ביקורת) honokiol בשילוב וב- EFS (הם מסומנים כ honokiol). (ז) הכוונה על נדידת תאים CL1-5 לאחר שטופלו מקדמי הפליטה בלבד (מסומן הביקורת) honokiol בשילוב וב- EFS (הם מסומנים כ honokiol). הנתונים המוצגים כאן פורסם במקור בהתייחס 22. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שבביים מבוסס PMMA מיוצרים באמצעות אבלציה ליזר וכתיבה שהן זולות ושיטות קלות בהשוואה לשבבים מבוססים PDMS הדורשים ליתוגרפיה רך יותר מסובך. לאחר תכנון שבב microfluidic, הייצור וההרכבה ניתן לעשות זאת בתוך רק 5 דקות. ישנם כמה צעדים קריטיים כי יש לשים לב כדי בביצוע הניסוי. הראשון הוא סוגיית "רכבת". המתאמים צריכים להיות מודבקים כראוי לשכבה העליונה ביותר של השבב. דבק יכול לדלוף לתוך ערוצי fluidic אם יותר מדי מוחל, ונוזל יכול לדלוף החוצה של שבב אם דבק מעט מדי נעשה שימוש. כמו כן, בהרכבת מצעי PMMA ואת הקלטות דו צדדיות, חשוב להפעיל לחץ ללחוץ על השבב כולו בחוזקה כדי למנוע דליפת נוזלים. השני הוא הנושא "הבועה". כדי להסיר בועות, 1x PBS מוזרם באופן רציף לתוך התעלה fluidic עבור דק '1 או 2 בקצב זרימה של 20 μl / דקה ואז השבב הוא pרכוסה באינקובטור הלילה מתחת לגיל 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. אם יש בועות הנותרות בתוך הערוצים fluidic, הזרימה תהיה לא אחיד, מה שגרם ריכוז כימי הומוגניות והפצת EF. השלישי הוא הנושא "טעינת תא". מספר התאים נטענים לתוך אזורי התרבות צריך להיות מבוקר היטב. אם את המספר הסלולרי הוא נמוך מדי, רבי ריצות ניסיון צריכות להתנהל לאסוף מספיק נתונים לצורכים סטטיסטי. אם את המספר הסלולרי הוא גבוה מדי, זה יהיה קשה להבחין בין תאים בודדים ולכמת ההגירה שלהם.

בשנת שבב CSS, מבנה "עץ חג המולד" בשילוב עם פינת תרבות משולשת יוצר ריכוזים כימיים שונים בחמישה תחומים, שלכל אחד מהם שיפוע מאמץ גזירה. מדגיש גזירה fluidic היו ידועים בהשפעתם על הקובץ המצורף, מורפולוגיה, ההגירה, ואת הפעילות של תאים. מאמצי גזירה של נמוכים החל 0.25-0.6 Pa תוכל להשתלב מצורף תאערכים גבוהים יותר, ואף מדגיש (0.5 -10 Pa) דווחו להסיר תאים חסידים 29. מדגיש גזירה למינרית החל 0.8 ל 1.5 יישור תא מושרה אבא לכיוון הזרימה 30, ואפילו ערכים נמוכים יותר (0.1-1 אבא) היו ידועים להשפיע מורפולוגיה תאית וחדירות 29. יתר על כן, לתאי שריר חלק נתון גזירת לחצים של 2-120 Pa חווה ירידה במספר תאי 31. Lu et al. דיווח על התכנון וההקמה של מכשירי גזירת microfluidic על ניתוח כמותי של הידבקות תא 27. מאמץ הגזירה בתוך הערוץ fluidic שונה על ידי שינוי הממדים של הערוץ. צ'ין et al. תאר המודינמי מעבדה-על-שבב מערכת לשליטה על קצב הזרימה של מדיום תרבות ערוצי מייקרו לחקות את פרופיל זרימת הדם בתוך הכלי 32. מאמץ הגזירה בתוך הערוץ fluidic שונה על ידי שינוי קצב הזרימה של המדיום. בse שני מכשירים, למרות מאמץ הגזירה של ערכי כל יכול להיווצר, רק אחד ערך יחיד היה זמין בתוך אזור תרבות אחת בבת אחת. לשם השוואה, שבב CSS הנוכחי יש את היתרון של מתן שיפוע מאמץ גזירה בתחום אחד משולש, הגדלת התפוקה הניסיונית במיוחד למטרת הקרנה.

בשנת שבב CEF, בתחומי התרבות של המבנה "עץ חג המולד" הוא בניצב מחוברים כדי ליצור נתיב fluidic מקביל מעגל חשמלי. באחת להחיל זרם חשמלי קבוע, חמש עוצמות EF נוצרות בתוך תחומי התרבות עם כל בעל זרימת ריכוז כימי ספציפי. כמקובל, ניסויי electrotactic בוצעו על צלחות פטרי שם בעיות של מקדמי פליטה מדויקים, אידוי בינוני, תא גדול / צריכה מגיב, וחימום ג'אול גדל יכולות להתרחש. מצ"ב, מכשירים microfluidic מיניאטורי ביעילות להתגבר החסרונות הללו. לדוגמה, כדי ללמוד את electrotaxis oבתאים אנושיים דם זיכרון T f, לין et al. דיווח על מכשיר microfluidic פלסטיק המכיל שני 15 זהים, Side-by-side מיקרו-ערוצים, שני טיפי פיפטה שונים שמשו מאגרים בינוניים, ושתי אלקטרודות פלטינה עבור יישום EF. כדי להגדיל את התפוקה, שבבי electrotactic מבוססים PMMA היו מפוברקים לספק עוצמות EF מרובות במכשיר אחד יחיד 12,33. כמו כן, מכשירי microfluidic מסוגלים לייצר כימי לשליטה בגירויים חשמליים בו זמנית הם בעלי העניין גבוה. Li et al. מפוברק מכשיר microfluidic מבוסס PDMS לייצר הדרגתיים כימיים יחיד או דו-קיום / מקדם פליטה חוקר את chemotactic או גירת electrotactic של תאי T 14. קאו et al. מועסקים מכשיר microfluidic דומה לווסת את chemotaxis של תאי סרטן הריאות באמצעות EFS 12. בשני המכשירים האלה, מבנה Y-צורה יושם כדי ליצור שיפוע ריכוז יציב אחד EF השימושית. הו et al. דיווח על שבב רב-כפולה-חשמל-שדה כדי לחקור את ההשפעה המיידית של כימיקלים מקדמים פליטה על תאי סרטן ריאות 21. התקן זה היה מסוגל לספק 8 שילובים של גירויים חשמליים / כימיים (2 כימי חשמל x 4) בניסוי אחד. למרות התפוקה מוגברת, הקיבולת של שבב זה הוגבלה (1) רק כוח EF אחד (ועוד אחד אפס כביקורת), ו- (2) ארבע משאבות מזרק נדרשות לשאיבת כימיקלים לארבעה ערוצים עצמאיים. לשם השוואה, שבב CEF הנוכחי יש את היתרון של יצירת חמש עוצמות EF יחד עם חמישה ריכוזים כימיים באמצעות סט אחד של אלקטרודות ו -2 משאבות מזרק.

למרות שבבים אלה קלים להיות מפוברקים, יש להם מספר מגבלות. ראשית, רק חמש "ספציפי" ריכוזי וחמש "ספציפי" חוזק EF יכולים להיוצר. שנית, הרוחב של ערוץ fluidic לא יכול להיות פחות מ -1 מ"מ בשל ההתמקדות שלקרן לייזר CO 2. עם זאת, על ידי שליטה על כימיים ריכוז דווקא כניסת הזרם החשמלי העובר במסלול fluidic, כל ריכוזי ועוצמות EF ניתן להשיג בתחומי התרבות. לסיכום, CSS הנוכחי וצ'יפס CEF מסוגל לספק תאים עם גירויי מתח יחיד או להתאבדות לשליטה כימית / חשמל / גזירה. בשנת שבב CSS אחת, חמישה ריכוזים כימיים שונים בשילוב עם שיפוע הלחץ גזירה יכול להיווצר. בנוסף, שבב אחד בודד CEF, חמישה ריכוזים כימיים שונים בשילוב עם חמש נקודות החוזק EF יכול להיווצר. על ידי הגדלת הסניפים של המבנה "עץ חג המולד", התפוקה של שבבים אלה ניתן להגדיל עוד יותר. שבבים אלה הם הפגינו כדי להיות פלטפורמה קלה, חוסך זמן, אמין, ו תפוקה גבוהה ללימודים של התנהגות הסלולר תחת גירויי לחץ כימי / חשמל / גזירה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Cell culture medium
Trypsin Gibco 25300-054 detach cell from the dish
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10082147 Cell culture medium
10 cm cell culture Petri dish Nunc 150350 Cell culture
Bright-Line Hemacytometer Sigma Z359629 Cell Counting Equipment
PMMA Customized Customized Microfluidic chip
Adaptor Customized Customized Microfluidic chip
0.07/0.22 mm double-sided tape  3M 8018/9088 Microfluidic chip
Low melting point agarose Sigma A9414 Salt bridge
2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate Sigma D6883 Intracellular ROS measurement
Indium tin oxide (ITO) glass Merck 300739 Heater
Proportional-integral-derivative controller  JETEC Electronics Co. TTM-J4-R-AB Temperature controller
Thermal coupler TECPEL TPK-02A Temperature controller
CO2 laser scriber Laser Tools & Technics Corp. ILS2 Microfluidic chip fabrication
Syringe pumps New Era NE-300 Pumping medium and chemicals into the chip
Power supply Major Science  MP-300V Supplying direct currents
Inverted microscope Olympus CKX41 Monitoring cell migration
Inverted fluorescent microscope Nikon TS-100 Monitoring cell migartion and fluorescencent signals
DSLR camera Canon 60D Recording bright-field images 
CCD camera Nikon DS-Qi1 Recording fluorescent images 
super glue 3M Scotch 7004 Attaching adaptors to PMMA substrates
AutoCAD Autodesk Inc. Designing microfluidic chips
DMSO Sigma D8418 Dissolving DCFDA
ImageJ National Institutes of Health Quantifying fluorescent intensities and cell migration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
  2. Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
  3. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
  4. Adler, J. Chemoreceptors in bacteria. Science. 166, 1588-1597 (1969).
  5. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
  6. Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107 (2014).
  7. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
  8. Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
  9. Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
  10. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
  11. Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
  12. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
  13. Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
  14. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
  15. Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
  16. Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
  17. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
  18. Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117 (2012).
  19. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
  20. Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
  21. Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007 (2014).
  22. Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15 (2016).
  23. Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108 (2013).
  24. Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
  25. Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
  26. Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
  27. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
  28. Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
  29. Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
  30. Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
  31. Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
  32. Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
  33. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).

Tags

Bioengineering גיליון 114 שבב microfluidic נדידת תאים מיני חמצן תגובתי שדה חשמלי electrotaxis מאמץ גזירה
עיצוב מכשירי microfluidic ללימוד ותגובות ניידות תחת בית או להתאבדות כימית / חשמל / שאר מתח גירויים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chou, T. Y., Sun, Y. S., Hou, H. S., … More

Chou, T. Y., Sun, Y. S., Hou, H. S., Wu, S. Y., Zhu, Y., Cheng, J. Y., Lo, K. Y. Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli. J. Vis. Exp. (114), e54397, doi:10.3791/54397 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter