Abstract
microcanais são capazes de criar um micro-ambiente celular preciso e controlável do pH, temperatura, concentração de sal, e outros estímulos físicos ou químicos. Eles têm sido comumente utilizado para estudos in vitro de células, fornecendo in vivo como arredores. Especialmente, como as células resposta a gradientes químicos, campos elétricos e tensões de cisalhamento tem atraído muitos interesses uma vez que estes fenómenos são importantes para compreender as propriedades e funções celulares. Estes chips de microfluidos pode ser feita de substratos de vidro, pastilhas de silício, polímeros de polidimetilsiloxano (PDMS), polimetilmetacrilato (PMMA), substratos ou substratos de tereftalato de polietileno (PET). Fora destes materiais, substratos de PMMA são baratos e podem ser facilmente tratados com ablação a laser e escrita. Embora alguns dispositivos microfluídicos foram projetados e fabricados para gerar múltiplos, coexistindo estímulos químicos e elétricos, nenhum deles foi consideradosuficientemente eficaz na redução repetições experimentais, em particular para fins de triagem. Neste relatório, nós descrevemos nosso projeto e fabricação de dois chips microfluídicos à base de PMMA para investigar respostas celulares, na produção de espécies reativas de oxigênio e a migração, sob / elétricos estímulos de estresse / cisalhamento químicas únicas ou coexistentes. O primeiro chip gera cinco concentrações relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8, 1 e nas regiões de cultura, juntamente com um gradiente de tensão de corte produzida dentro de cada uma destas áreas. O segundo chip gera as mesmas concentrações relativas, mas com cinco diferentes intensidades de campo elétrico criado dentro de cada área de cultura. Estes dispositivos não só proporcionar células com um, controlável micro-ambiente precisa, mas também aumentar grandemente a taxa de transferência experimental.
Introduction
Em células in vivo estão rodeados por uma variedade de biomoléculas, incluindo matriz extracelular (ECM), hidratos de carbono, lípidos, e outras células. Eles funcionalizar por responder a estímulos micro-ambientais, tais como as interacções com o ECM e as respostas aos gradientes químicos de vários factores de crescimento. Tradicionalmente, os estudos in vitro de células são realizadas em pratos de cultura de células, onde o consumo de células e reagentes é grande e as células crescem num estática (não-circulantes) ambiente. Recentemente, os dispositivos micro fabricado com componentes integrados fluídicos forneceram uma plataforma alternativa para estudos de células de uma forma mais controlável. Tais dispositivos são capazes de criar um micro-ambiente precisa de estímulos químicos e físicos, enquanto minimizando o consumo de reagentes e células. Estes chips de microfluidos pode ser feita de substratos de vidro, pastilhas de silicone, polímeros de polidimetilsiloxano (PDMS), polimetilmetacrilato (PMMA) substratos, ou polyethylenetereftalato (PET) substratos 1-3. dispositivos baseados no PDMS é transparente, biocompatível, e permeável aos gases, tornando-os adequados para a cultura de células a longo prazo e estudos. substratos de PMMA e PET são baratos e fáceis de ser processados usando ablação a laser e escrita.
microcanais deve fornecer células com um micro-meio ambiente estável e controlável quando as células são sujeitas a diferentes estímulos químicos e físicos. Por exemplo, chips de microfluidos são usados para estudar a quimiotaxia de células. Em vez de métodos tradicionais que empregam câmara de Boyden e capilar 4,5 esses dispositivos fluídicos miniaturizados pode gerar gradientes químicos precisos para estudar comportamentos das células 1,6,7. Outro exemplo é o de estudar a migração direcional das células sob a campos elétricos (EFS), fenômeno chamado electrotaxis. Foram relatados comportamentos Electrotactic de células para ser relacionada com a regeneração do nervo 8, 9, o desenvolvimento embrionário,e cicatrização de feridas 10,11. E muitos estudos foram realizados para investigar a electrotaxis de vários tipos de células, incluindo células cancerosas 12,13, 14,15 linfócitos, células de leucemia 11, 16 e as células-tronco. Convencionalmente, placas de Petri e óculos de cobertura são usados para construir câmaras electrotactic para gerar FE 17. Tais configurações simples levantam problemas de evaporação média e FE imprecisos, mas eles podem ser superados por meio de dispositivos microfluídicos de canais fluídicos fechado, bem definidas 12,18,19.
Para estudar sistematicamente respostas celulares sob estímulos químicos e eléctricos precisas, controláveis, seria de grande utilidade para desenvolver dispositivos de microfluidos, capazes de produzir células com vários estímulos, ao mesmo tempo. Por exemplo, Li et al. relatado um dispositivo microfluídico baseado no PDMS para a criação de simples ou coexistindo gradientes químicos e EFS 20. Kao et al. devfugiu um chip microfluídico semelhante para modular a quimiotaxia de células de câncer de pulmão pelo EFS 6. Além disso, para aumentar o rendimento, Hou et al. projetou e fabricou um chip multicanal-dual-campo elétrico à base de PMMA para fornecer células com 8 diferentes estímulos combinados, (concentrações 2 pontos fortes EF x 4 químicos) sendo 21. Para aumentar ainda mais a todo e adicione o estímulo tensão de cisalhamento, foram desenvolvidos dois dispositivos microfluídicos à base de PMMA para estudar as respostas celulares em / elétricos estímulos de estresse / cisalhamento químicos simples ou coexistindo.
Relatado por Lo et al. 22,23, estes dispositivos contêm cinco canais de cultura de células independentes sujeitos a contínuo fluxo de fluidos, imitando o sistema circulatório in vivo. No primeiro chip (chip-química tensão de corte ou o chip CSS), cinco concentrações relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8, e 1 são gerados nas regiões de cultura, e um gradiente de tensão de corte é produced dentro de cada uma das cinco áreas de cultura. No segundo chip (chip químico-elétrico campo ou o chip CEF), usando um único conjunto de eletrodos e 2 bombas de seringa, cinco pontos fortes EF são gerados além de cinco concentrações químicas diferentes dentro dessas áreas de cultura. Cálculos numéricos e simulações são realizadas para uma melhor concepção e operar estes chips, e células cancerosas de pulmão cultivadas dentro destes dispositivos são sujeitos a estímulos simples ou coexistentes de observação das suas respostas com respeito à produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), a taxa de migração, e a direcção da migração. Esses chips são demonstrado ser, de alto rendimento e dispositivos confiáveis para investigar como as células respondem a vários estímulos micro-ambientais de poupança de tempo.
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Protocol
1. Chip projeto e fabricação
- Desenhar padrões a ser cauterizado em substratos de PMMA e fitas dupla face usando software comercial 24.
- Para estudar os efeitos de concentrações químicas e tensões de cisalhamento, desenhar um padrão de "árvore de Natal" com uma largura variando em sua extremidade em cada uma das cinco áreas de cultura (Figura 1A e 1B).
- Para estudar os efeitos de concentrações de produtos químicos e campos elétricos, desenhar um padrão de "árvore de Natal" com dois canais fluídicos mais para pontes de sal (Figura 2A e 2B).
- Scribe um padrão individual em uma folha de PMMA ou uma fita dupla face, carregando o arquivo correspondente para o riscador laser de CO 2.
- Ligue o riscador laser, e verifique sua conexão com o computador. Abra o padrão a ser excisada utilizando o software comercial.
- Coloque uma folha de PMMA ou de uma fita dupla face on topo da etapa do riscador. Ajustar o foco do laser de CO 2, se necessário, usando a barra de calibração e do visível do laser de He-Ne.
- Carregue o padrão para o riscador para ablação na folha de PMMA ou a fita.
- Pegue a folha padronizada ou fita, retire peças não desejadas, e limpar a superfície com sopro de azoto.
NOTA: A espessura da folha de PMMA é de 1 mm, e que a fita de dupla face é de 0,07 mm ou 0,22 mm.
2. Montagem Chip
- Com super cola, anexar os adaptadores de acrílico (comprimento x largura x altura = 10 mm x 10 mm x 5 mm, com roscas no meio) com a camada mais superior do chip, alinhando as roscas e os furos na parte superior camada -mais. Esses adaptadores servem como entradas / saídas e conectores de ponte de sal médio.
- Montar o chip microfluídico dentro de uma capela de fluxo laminar.
- Montar o chip microfluídico estresse químico-cisalhamento (chip CSS).
- UMAttach 3 folhas de chapas de PMMA scribed usando 2 pedaços de fita dupla face descrito. (Figura 1A e 1B).
- Adicionar mais um pedaço de fita de dupla face 0,07 milímetros de espessura para a parte inferior do chip e anexar o chip a um 10 cm de diâmetro numa caixa de Petri.
- Colocar o chip conjunto na câmara de vácuo durante a noite.
- Para montar o chip campo químico-elétrico (chip CEF), anexar a folha de PMMA a uma fita dupla face de espessura = 0,22 mm (Figura 2A e 2B).
- Anexar a folha de PMMA descrito e fita dupla face para a 10 cm de diâmetro placa de Petri usando esse mesmo pedaço de fita.
- Deixe o chip montado no interior do exaustor e expô-la aos raios UV por 30 min para a esterilização.
- Ligue as entradas para duas seringas de 3 ml através de tubos de plástico e porcas com os dedos. Ligue a saída a um tubo de resíduos através de um tubo de plástico e uma porca dedos.
NOTA: Autoclavetodos os tubos e as porcas a 121 ° C durante 15 min antes da utilização. - Lentamente pressionar o êmbolo da seringa para injetar a canais fluídicos com PBS. Empurrar seringas e para trás para remover as bolhas.
- Coloque as fichas dentro de uma incubadora durante a noite a 37 ° C sob 5% de CO 2.
NOTA: Estas duas etapas são destinadas para lavar o chip e retire as bolhas restantes dentro do chip. - Tome o chip fora da incubadora.
- Prepare pontes salinas de agar para gerar campos elétricos no chip CEF.
- Dissolve-se 3% de agarose de baixo ponto de fusão em tampão fosfato salino (PBS), tampão 1x usando um forno de microondas.
- Injectar agarose para o canal de ponte salina faseada-solução e inserir os eletrodos antes de solução solidifica.
- Coloque os eletrodos de prata / prata-cloreto nas porcas tubulares.
- Conectar as seringas para as bombas de seringa, e continuamente o fluxo de meio de cultura (Dulbecco Modificado Eagler17; s forma, de DMEM) no interior do canal de fluidos durante 10 min a um caudal de 20 ul / min para substituir PBS.
3. Preparação de células e Configuração Experimental
NOTA: Pré-aquecido 1x PBS, meio de cultura (DMEM mais FBS), e tripsina num banho de água a 37 ° C antes do uso.
- Placa de 2 x 10 células de cancro de pulmão 5 25,26 CL1-5 numa placa de Petri de 10 centímetros fornecido com DMEM mais soro fetal bovino a 10% (FBS). Incubar as células dentro de uma incubadora sob 5% de CO2 a 37 ° C até 90% de confluência.
- Aspirar o meio e lava-se as células uma vez com pré-aquecido PBS 1x. Adicionar 2 ml de tampão de tripsina a 0,05% para as células e esperar durante 2 a 3 min a 37 ° C para separar as células.
- Transferir as células para um tubo de centrifugação de 15 ml estéril e adicionar 6 mL de meio de cultura dentro do tubo. Inverter cuidadosamente o tubo para a mistura e retirar 5 ul do meio contendo células para contagem do número de células num hemocytometer.
- Centrifugar o tubo a 300 x g durante 5 min. Suspender 6 10 células em 1 ml de meio de cultura e colocar o meio contendo as células em uma seringa de 1 ml.
- Infundir o meio contendo células no chip microfluídico da tomada e certifique-se de que a solução distribui através de todas as cinco áreas de cultura. Incubar o chip dentro de uma incubadora sob 5% de CO2 a 37 ° C durante 2 h.
4. Configuração Experimental
- Tome o chip fora da incubadora e coloque-o em cima de um aquecedor de vidro de óxido de índio e estanho transparente (ITO).
NOTA: O vidro ITO é ligado a um controlador proporcional-integral-derivativo (PID) para manter a temperatura a 37 ± 0,5 ° C por meio de retorno a partir de um acoplador térmico apertadas entre o aquecedor e o chip de ITO. - Colocar o conjunto de chip-aquecedor por cima de uma plataforma XY motorizado de um microscópio invertido para o rastreamento de migração celular ou uma plataforma XY fixo deum microscópio de fluorescência invertido para medir a produção de ROS.
- Para gerar diferentes concentrações químicas, encher duas seringas com 5 ml de soluções químicas de concentrações relativas 0 e 1 (dissolvido em meio de cultura) e estimulá-los para o chip a taxas de fluxo desejadas: no chip CSS, a uma taxa de fluxo de 0,3 ml / min durante 1 hora; no chip CEF, a uma taxa de fluxo de 20 ul / min durante os primeiros 20 min e um caudal de 20 ul / h durante mais 120 minutos (tempo total = 2 horas).
- No chip CEF, para acompanhar a migração celular, o programa do estágio XY do microscópio para repetir tirar fotos, através de um single-lens reflex digital (DSLR), de determinado campo de pontos de vista (FOVs) dentro de áreas de cultura a cada 15 minutos para 2 h.
- Para medir a produção de ROS, utilizar o indicador baseado em fluorescência 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetato de (2'-7'-DCFDA).
- Prepare o estoque de 2'-7'-DCFDA a 10 mM em molecular grau biologia disulfóxido de metilo (DMSO). Diluir DCFDA única em DMEM sem soro (5 uM em DMEM). O desacetilase potencial poderia aumentar os sinais de fundo e diminuir os sinais nas células.
- Após 1 h de estímulo tensão de cisalhamento no chip CSS ou depois de 2 h de EF estímulo no chip CEF, bombear 2'-7'-DCFDA (5 uM em DMEM) para o chip a um caudal de 20 ul / min durante os primeiros 20 min e um caudal de 20 ul / h durante mais 20 min. Para a lavagem, a bomba de DMEM para o chip a um caudal de 20 ul / h durante 20 min.
- Tire fotos, através de uma câmera do dispositivo de carga acoplada (CCD), de certas FOVs dentro das áreas de cultura para analisar as intensidades fluorescentes.
5. Cálculos de concentrações químicas, tensões de cisalhamento, e campos elétricos
- Em ambos o chip CSS eo chip CEF, calcular as concentrações químicas nas cinco áreas de cultura. Por exemplo, através da injecção de H 2 O 2 de concentrções 0 e 200 um a partir das duas entradas, concentrações de 0, 25, são gerados 100, 175, e 200 uM.
NOTA: Ao assumir que todos os líquidos de fluxo dividido de forma suave e igualmente em torno do garfo, as concentrações relativas nas cinco áreas de cultura são 0, 1/8, 1/2, 7/8, e 1, respectivamente. - No chip de CSS, calcular a tensão de cisalhamento (τ) dentro de cada uma das áreas de cultura usando
27, onde Q é a taxa de fluxo de volume, η é a viscosidade de fluidos, h representa a altura do canal, e w é a largura do canal.
NOTA: Ao definir Q = 0,3 ml / min em cada entrada (Q = 0,12 ml / min em cada área de cultura), η = 0,0008 Pa.s para meio de cultura, h = 1 mm e w = 1 a 4 mm, o tensão de corte é calculado para variar de 0,0048 Pa (4 mm de largura região) a 0,0192 Pa (1 mm de largura região). - Dentroo chip CEF, calcular a força FE dentro de cada uma das áreas de cultura utilizando E = I / (σA FEP) (Lei de Ohm), onde I é a corrente eléctrica que flui através do canal de fluidos, σ é a condutividade eléctrica do meio de cultura, e a ef é a área da secção transversal efectiva do canal.
NOTA: Usando σ = 1,38 Ω -1 m -1 para o meio de cultura e A EFF = 0,22 mm 2 (width = 1 mm e altura = 0,22 mm), a força EF é calculada para ser E (mV / mm) = I ( A) × 3,3 × 10 6.- Como se mostra na Figura 2D, tratar o circuito equivalente, tal como cinco circuitos seção-C com quatro (8 + 35 + 8) segmentos e uma (5 + 35 + 5) do segmento.
NOTA: Ao analisar este circuito paralelo de acordo com a lei das tensões de Kirchhoff ea lei de Ohm, as correntes que fluem através de cinco cultura sãocomo, I 1 a I 5 de baixo para cima, está calculada em cerca de 0,49 I (área 1), 0,25 I (área 2), 0,13 I (área 3), 0,08 I (área 4), e 0,05 I (área 5), respectivamente, onde I é o total de corrente contínua (DC). Com uma CC aplicada de 0,157 mA, FE de 254, 130, 67, 41, e 26 mV / mm são gerados dentro das cinco áreas de cultura.
NOTA: Para uma análise eléctrica simplificada da rede de microfluidos, todos os segmentos de fluidos são considerados como resistências com resistência proporcional aos seus comprimentos.
- Como se mostra na Figura 2D, tratar o circuito equivalente, tal como cinco circuitos seção-C com quatro (8 + 35 + 8) segmentos e uma (5 + 35 + 5) do segmento.
27, onde Q é a taxa de fluxo de volume, η é a viscosidade de fluidos, h representa a altura do canal, e w é a largura do canal. Análise 6. Os dados
Nota: A análise dos dados é realizada utilizando o software ImageJ.
- Analisar a produção de ROS.
- Executar o software ImageJ. Vá em "Arquivo" → Abrir para carregar uma imagem fluorescente para ser analisado.
- Vá até "Imagem" → "Tipo" → "16-bit" para alterar a imidade para uma escala de cinza.
- Desenhar um polígono para delimitar uma célula. Vá em "Analisar" → "Measure" para medir a intensidade de fluorescência média da célula.
- Repetir para recolher 6.1.3 intensidades de pelo menos 50 células de três experiências independentes, e calcula a intensidade média com erro padrão da média (SEM).
- Repita 6.1.1-6.1.4 para cada condição experimental.
- Analisar a migração celular.
- Executar o software ImageJ. Vá em "Arquivo" → Abrir para carregar uma imagem tirada no momento = 0 a ser analisado.
- Desenhar um polígono para delimitar uma célula. Ir para "analisar" → "medida" para medir o centro de massa da célula como (x 1, y 1).
- Repetir 6.2.1- 6.2.2 para medir o centro de massa da mesma célula (X 2, Y 2) a partir de uma outra imagem levar ao tempo = t.
- Calcular a taxa de migração (em mm / h) deesta célula como
. - Repetir 6.2.1-6.2.4 para recolher as taxas de migração de pelo menos 50 células de três experiências independentes, e calcular a taxa de migração significativo com o erro padrão da média (SEM).
- A partir de 6.2.2 e 6.2.3, calcular o direcionamento de migração desta célula como θ cosseno ou
, Onde θ é o ângulo entre o vector da EF aplicada (de positivo para negativo) e o vector a partir do inicial até à posição final da célula (Figura 2G). - Repetir 6.2.6 direcionamento para recolher a migração a partir de pelo menos 50 células de três experiências independentes, e calcular o direcionamento migração significativo com o erro padrão da média (SEM).
- Calcular a taxa de migração média com SEM eo direcionamento migração média com SEM para cada condição experimental.
NOTA: A directednessde 1 indica que todas as células migram para o cátodo, e um valor de -1 indica que todas as células migram para o ânodo. O direcionamento de um grupo de células que se deslocam aleatoriamente está próxima de 0.
- Analisar Alinhamento celular.
- Executar o software ImageJ. Vá em "Arquivo" → "Open" para carregar uma imagem a ser analisada.
- Tratar a célula como uma elipse e desenhar uma linha para indicar ao eixo longo de uma célula. Vá em "Analisar" → "Measure" para medir o ângulo β entre a linha ea direção EF horizontal.
- Repetir 6.3.2 β para recolher a partir de pelo menos 50 células de três experiências independentes, e calcular a média de cosseno β com erro padrão da média (SEM).
- Repita 6.3.1-6.3.3 para cada condição experimental.
NOTA: a cos β de 1 indica que todas as células alinhar paralelamente ao EF aplicada, e um valor de 0 indica que todas as células alinhar perpendicularly à EF aplicada.
. 
, Onde θ é o ângulo entre o vector da EF aplicada (de positivo para negativo) e o vector a partir do inicial até à posição final da célula (Figura 2G). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O estresse químico-cisalhamento (CSS) Chip
O chip CSS é feito de três folhas PMMA, cada um de 1 mm de espessura, ligados em conjunto por meio de duas fitas de duas faces, cada uma espessura de 0,07 milímetros (Figura 1A e 1B). A estrutura de "árvore de Natal" gera cinco concentrações relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8 e 1 nas cinco áreas de cultura. Ao conceber a área de cultura como um triângulo, um gradiente de tensão de corte, com uma magnitude relacionada com a taxa de volume de fluxo, a viscosidade de fluidos, e a dimensão do canal de fluidos, é criado no interior de cada uma das áreas. Este chip é então ligado, através de uma outra 0,07 mm de espessura de fita de dupla face, a uma placa de Petri por células do cancro do pulmão CL1-5 de cultura e observou-se a produção de ROS em resposta a diferentes concentrações químicas e tensões de corte. A produção de ROS em células de câncer de pulmão é altamente relacionada com lumetástase do câncer ng e desenvolvimento, e certas substâncias químicas e tensão de cisalhamento foram demonstrados para ser envolvido na geração de ROS 23.
Em primeiro lugar, para estudar o efeito de H 2 O 2, um estímulo químico, sobre a produção de ROS, as células foram incubadas com o fluxo contínuo de H 2 O 2 em soluções de 0, 25, 100, 175, e 200 uM. Como mostrado na Figura 1C, a intensidade de fluorescência aumentou à medida que a concentração de H 2 O 2 aumentou, indicando que H 2 O 2 estimulou a produção de ROS. Em seguida, para investigar o efeito da tensão de corte para a produção de ROS, as células foram expostas a um gradiente de tensão de corte de 0,0048 Pa a 0,0192 Pa. A Figura 1D mostra que a intensidade de fluorescência aumentou à medida que a tensão de cisalhamento aumentado (as tensões de cisalhamento foram as mais altas ea menor nas áreas frente e atrás, respectivamente), sugereming que a maior tensão de cisalhamento induzida mais produção de ROS. Além disso, este chip CSS foi utilizado para estudar a produção de ROS em resposta a diferentes concentrações de α-tocoferol, um antioxidante de uma forma de vitamina E. As células foram estimuladas por tensão de corte mais α-tocoferol de 0, 3,2, 12,5, 21,9 , e 25 ug / ml. Como mostrado na Figura 1E, para concentrações α-tocoferol menor do que 21,9 pg / ml, a intensidade fluorescente diminuiu à medida que a concentração aumenta, indicando o efeito da α-tocoferol em reduzir a produção de ROS. No entanto, como a concentração aumentada para 25 ug / ml, a intensidade média também aumentou, o que sugere que esta alta concentração de α-tocoferol não eliminar grande ROS em comparação com concentrações mais baixas.
O Campo Chemical-elétrico (CEF) Chip
O chip CEF é feita de um PMMA um milímetro de espessura e de 0,22 mm de fita dupla face com canais fluídicos estampados nele (Figura 2A e 2B). Da mesma forma, a estrutura de "árvore de Natal" cria cinco concentrações relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8 e 1 nas cinco áreas de cultura. Além disso, estes cinco domínios paralelos são ligados perpendicularmente para formar um caminho análogo ao fluídica um circuito eléctrico. O campo eléctrico gerado dentro de uma área de cultura está relacionada com a condutividade do fluido, a área da secção transversal do canal, e a corrente contínua (CC) que passa através da área. De acordo com a lei das tensões de Kirchhoff ea lei de Ohm, as correntes nas cinco áreas de cultura são 0,49 I, 0,25 I, 0,13 I, 0,08 I, e 0,05 I, respectivamente, onde I é a CC aplicada (Figura 2C). Este chip está ligado, através da fita de face dupla de 0,22 mm de espessura, para uma placa de Petri de cultura de células do cancro do pulmão CL1-5 para observar a migração celular e a produçõeN de ROS em resposta a diferentes concentrações químicas e campos eléctricos.
Em primeiro lugar, este chip foi usado para estudar a produção de ROS em resposta a diferentes concentrações de honokiol, diferentes forças de EFS e tratamentos combinados de ambos. Honokiol, um polifenol pequena molécula isolada do género magnólia, verificou-se ter anti-angiogénicos, anti-inflamatórios, antitumorais e propriedades em estudos pré-clínicos 28. Como se mostra na Figura 2D, o ROS produzido era quase o mesmo para o EFS inferiores a 67 mV / mm, mas foi aumentada com o aumento da FE acima deste valor. A Figura 2E mostra que sob tratamentos combinados de campos eléctricos e honokiol, o nível de ROS ficou quase a mesma, indicando que honokiol inibiu a produção de ROS exógena (isto é., ROS relacionadas com EF estímulo), especialmente sob EF mais elevados. A migração celular sob química única ou coexistindo/ estímulos elétricos também foi investigado usando este chip CEF. Como pode ser visto na Figura 2F, sem a adição de honokiol, a taxa de migração aumentou à medida que a força FE aumentou. Após a adição de diferentes concentrações honokiol, a taxa de migração diminuída em geral, o que sugere que honokiol reduzida a migração de células, possivelmente através da inibição da produção de ROS. O direcionamento de migração é mostrada na Figura 2G. Na presença de EF única, células de cancro do pulmão revelou migração direccional proeminente para o ânodo (com valores negativos). Depois de adicionar honokiol de diferentes concentrações, houve uma ligeira diminuição no direcionamento de migração para todas as áreas estimuladas-EF.
Figura 1: The Chemical-tensão de cisalhamento (CSS) Chip usado para estudar os efeitos de substâncias químicas e tensões de corte em células de câncer de pulmão 2.3
(A) Três camadas de substratos de PMMA são ligadas entre si por meio de duas fitas de duas faces para formar o chip CSS. (B) O chip CSS integrado. (C) Topo: as imagens de campo brilhante de CL 1-5 células após fluorescente e ser tratado com diferentes concentrações de H 2 O 2. Barra de escala = 50 mm. Parte inferior: intensidade de fluorescência média com SEM representada graficamente em diferentes concentrações de H 2 O 2. (D) Top: imagens fluorescentes de CL 1-5 células sob diferentes tensões de cisalhamento. Barra de escala = 50 mm. Resumindo: intensidade de fluorescência média com SEM plotados em diferentes tensões de cisalhamento. (E) superior: fluorescente e brilhante-campo imagens de CL 1-5 células depois de ser estimulado com tensão de corte com diferentes concentrações de α-tocoferol. Barra de escala = 50 mm. Parte inferior: intensidade de fluorescência média com SEM representada graficamente em diferentes concentrações de α-tocoferol. Os dados aqui apresentados wcomo publicado originalmente em referência 23. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: The Chip campo Chemical-elétrico (CEF) usado para estudar os efeitos de produtos químicos e campos elétricos em células de câncer de pulmão 22.
(A) uma camada de PMMA é ligado numa placa de cultura por meio de uma fita adesiva de dupla face para formar o chip CEF. (B) O padrão fluídico do chip CSS. (C) O circuito eléctrico equivalente do chip de microfluidos. (D) Esquerda: fluorescente e brilhante-campo imagens de CL 1-5 células após ser tratado com diferentes dosagens do EFS. Barra de escala = 50 mm. Direita: fluorescente médiaintensidade com SEM plotados em diferentes pontos fortes do EFS. (E) Esquerda: imagens de campo brilhante de CL 1-5 células após fluorescente e sendo tratada com honokiol e FE combinados. Barra de escala = 50 mm. Direita: A média de intensidade de fluorescência com SEM plotados em honokiol e FE combinados. (F) As taxas de migração de células CL1-5 após serem tratadas com o EFS somente (marcados como controle) e honokiol combinados e EFS (marcado como honokiol). (G) O direcionamento migração de células CL1-5 depois de serem tratados com o EFS somente (marcados como controle) e honokiol combinados e EFS (marcado como honokiol). Os dados aqui apresentados foi publicado originalmente na referência 22. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
fritas à base de PMMA são fabricadas usando ablação a laser e escrita que são métodos mais baratos e mais fáceis quando comparado aos chips baseados em PDMS que exigem litografia macia mais complicado. Após a criação de um chip microfluídico, a fabricação e montagem pode ser feito dentro de apenas 5 min. Existem alguns passos importantes que se deve prestar atenção para na realização do experimento. O primeiro é a questão "montagem". As placas deverão ser adequadamente coladas à camada mais superior do chip. Cola pode vazar para os canais fluídicos se muito é aplicada, e o líquido pode vazar para fora do chip se muito pouco de cola é usado. Além disso, na montagem dos substratos de PMMA e as fitas de duas faces, é importante aplicar a pressão para pressionar todo o chip firmemente para impedir qualquer fuga de líquido. O segundo é a questão "bolha". Para remover as bolhas, 1x PBS é continuamente fluiu para dentro do canal de fluidos durante 1 ou 2 minutos, a uma taxa de fluxo de 20 ul / min e, em seguida, o chip é patado dentro de uma incubadora durante a noite sob CO2 a 5% a 37 ° C. Se houver bolhas restantes dentro dos canais de fluidos, o fluxo vai ser não-uniforme, fazendo com que a concentração química e distribuição não homogénea EF. O terceiro é a questão "o carregamento de células". O número de células carregadas dentro das áreas de cultivo deve ser bem controlada. Se o número de células é muito baixo, muitas corridas experimentais devem ser realizados para recolher dados suficientes para fins estatísticos. Se o número de células é demasiado elevada, será difícil distinguir células individuais e quantificar a sua migração.
No chip CSS, uma estrutura de "árvore de Natal" combinada com uma área de cultura triangular gera diferentes concentrações químicas em cinco áreas, cada uma com um gradiente de tensão de cisalhamento. tensões de cisalhamento de fluidos foram conhecido para afectar a ligação, a morfologia, a migração, e a actividade das células. tensões de cisalhamento de tão baixo quanto 0,25-0,6 Pa poderia interagir fixação das células, Foram relatados valores e até mesmo mais elevados de estresse (0,5 -10 Pa) para remover as células aderentes 29. Laminar tensões de cisalhamento variando 0,8-1,5 alinhamento celular induzida Pa na direcção de fluxo 30, e valores ainda mais baixos (0,1-1 Pa) foram conhecido para afectar a morfologia celular e a permeabilidade 29. Além disso, as células musculares lisas submetidos a tensões de corte de 2-120 Pa experimentou um declínio no número de células 31. Lu et al. relatou a concepção e construção de dispositivos de cisalhamento microfluídicos de análise quantitativa de adesão celular 27. A tensão de corte no interior do canal de fluidos foi modificado alterando as dimensões do canal. Chin et al. descrito um sistema de hemodinâmica Lab-on-a-chip para controlar o caudal do meio de cultura no micro-canal para imitar o perfil de fluxo do sangue no vaso 32. A tensão de corte no interior do canal de fluidos foi modificada por alteração da taxa de fluxo do meio. NoSE de dois dispositivos, mesmo que uma tensão de cisalhamento de quaisquer valores poderiam ser geradas, apenas um único valor estava disponível dentro de uma área de cultura de uma só vez. Por comparação, a presente chip de CSS tem a vantagem de proporcionar um gradiente de tensão de corte em uma área triangular, aumentando a taxa de transferência experimental especialmente para um propósito de triagem.
No chip de CEF, as áreas de cultura da estrutura "árvore de Natal" são perpendicularmente ligados para formar um caminho análogo ao fluídica um circuito eléctrico. Em um aplicada corrente directa, cinco forças EF são gerados no interior das áreas de cultura com cada um tendo um fluxo de uma concentração química específica. Convencionalmente, os experimentos electrotactic foram realizados em placas de Petri onde os problemas do EFS imprecisas, a evaporação média, grandes células / consumo de reagente, bem como o aumento de aquecimento Joule poderiam ocorrer. Fechado, dispositivos microfluídicos em miniatura superar de forma eficiente estes inconvenientes. Por exemplo, para estudar o electrotaxis ócélulas humanas de f T de memória sangue, Lin et ai. relatado um dispositivo microfluídico de plástico contendo duas, lado-a-lado micro-canais idênticos, duas pontas de pipeta modificadas serviram como reservatórios médias, e dois eletrodos de platina para aplicação EF 15. Para aumentar o rendimento, os chips electrotactic baseados em PMMA foram fabricadas para fornecer vários pontos fortes EF em um único dispositivo 12,33. Além disso, dispositivos microfluídicos capazes de gerar química controlável e estímulos elétricos ao mesmo tempo são de grande interesse. Li et al. fabricou um dispositivo microfluídico baseado no PDMS para gerar gradientes químicos / FE simples ou coexistentes para investigar o quimiotático ou migração electrotactic de células T 14. Kao et al. Empregou um dispositivo micro semelhante para modular a quimiotaxia de células de câncer de pulmão usando o EFS 12. Nestes dois dispositivos, uma estrutura em forma de Y foi aplicado para criar um gradiente de concentração estável de uma única EF aplicada. Hou et al. relatado um chip multicanal-dual-elétrico-campo para estudar o efeito simultâneo de produtos químicos e EFS em células de câncer de pulmão 21. Este dispositivo foi capaz de fornecer 8 combinações de estímulos elétricos / químicos (2 elétrica x 4 químicos) em um experimento. Embora o rendimento aumentado, a capacidade deste chip foi limitado a (1), apenas uma força de FC (mais um zero como um controlo), e (2) quatro bombas de seringa são necessários para o bombeamento de produtos químicos em quatro canais independentes. Em comparação, o presente chips CEF tem a vantagem de gerar cinco pontos fortes EF juntamente com cinco concentrações químicas através de um único conjunto de eletrodos e 2 bombas de seringa.
Mesmo que estes chips são fácil de ser fabricada, eles têm algumas limitações. Em primeiro lugar, apenas cinco concentrações "específicos" e cinco pontos fortes EF "específicos" pode ser gerada. Em segundo lugar, a largura do canal de fluidos não pode ser inferior a 1 mm devido à focagem doCO 2 feixe de laser. No entanto, ao controlar com precisão a concentração química na entrada e a corrente eléctrica que passa através do canal de fluidos, quaisquer concentrações fortes e EF pode ser obtido nas áreas de cultura. Em conclusão, o presente CSS e batatas fritas CEF são capazes de fornecer células com estímulos química única ou coexistindo / elétrica / de tensão de cisalhamento controláveis. Em um chip de CSS única, cinco concentrações de químicos diferentes em combinação com um gradiente de tensão de corte pode ser gerado. Além disso, em um chip de CEF única, cinco concentrações de químicos diferentes em combinação com cinco forças EF pode ser criado. Ao aumentar as ramificações da estrutura "árvore de Natal", a taxa de transferência destes chips pode ser ainda aumentada. Esses chips são demonstrado ser uma, economia de tempo fácil, confiável, e uma plataforma de alto rendimento para estudos de comportamento celular sob estímulos química / elétrica / de tensão de cisalhamento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10 cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImageJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
References
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