Abstract
미세 유체 장치의 pH, 온도, 염농도, 다른 물리적 또는 화학적 자극을 정밀하고 제어 가능한 세포 미세 환경을 조성 할 수있다. 이들은 일반적으로 주변 같은 생체 내에서 제공하여 시험 관내 세포의 연구를 위해 사용되어왔다. 이러한 현상은 세포의 특성과 기능을 이해하는데 중요하기 때문에 특히, 세포가 화학 그라디언트, 전기 필드 및 전단 응력에 대응하여 얼마나 많은 관심을 받고있다. 이 마이크로 유체 칩은 유리 기판, 실리콘 웨이퍼, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 중합체, 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 기판, 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET) 기판에 제작 될 수있다. 이들 재료 중에서, PMMA 기판을 저렴하고 간편하게 레이저 어블 및 기입을 사용하여 처리 될 수있다. 몇 마이크로 유체 장치는 다수의 화학 물질을 생성하는 전기 자극을 공존 설계 및 제작 하였지만, 이들 중 어느 것도 고려되지 않았다충분히 목적을 선별 특히 실험적인 반복을 감소 시키는데 효율적입니다. 이보고에서는, 단일 또는 공존 화학적 / 전기적 / 전단 스트레스 자극에 따라, 반응성 산소 종의 생산 및 마이그레이션에, 세포 반응을 조사하는 두 PMMA 계 미세 유체 칩 우리의 설계 및 제작을 설명한다. 첫 번째 칩은 다섯 상대 농도를 생성 0, 1/8, 함께 각 영역 내에서 생산되는 전단 응력 구배와 문화 지역에서 1/2, 7/8, 1,. 두 번째 칩은 있지만, 각 문화 영역 내에서 생성 된 다섯 가지의 전계 강도와 같은 상대적으로 농도를 생성합니다. 이러한 장치는 정확하고 제어 가능한 마이크로 - 셀 환경을 제공 할뿐만 아니라, 매우 실험 처리량을 증가시키지.
Introduction
생체 내 세포 외 기질 (ECM), 탄수화물, 지질 및 기타 생체 세포를 포함하는 다양한 둘러싸여있다. 그들은 각종 성장 인자의 화학 그라디언트에 ECM과의 상호 작용 및 응답으로 마이크로 환경 자극에 반응하여 기능화. 세포 및 시약의 소비가 크고 세포 환경 (비순환) 고정 성장할 여기서 전통적으로, 시험 관내 세포 연구 세포 배양 접시에서 수행된다. 최근, 유체 구성 요소와 통합 마이크로 제조 장치는 더 많은 제어 방식으로 세포 연구에 대한 대안 플랫폼을 제공하고 있습니다. 이러한 장치는 세포 및 시약의 소비를 최소화하면서 화학적 및 물리적 자극의 정확한 미세 환경을 조성 할 수있다. 이 마이크로 유체 칩은 유리 기판, 실리콘 웨이퍼, 폴리 디메틸 실록산 제조 될 수있다 (PDMS) 중합체, 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 기재 또는 polyethylenetere프탈레이트 (PET)를 1-3 기판들. PDMS 기반 디바이스는 장기간 세포 배양 및 연구에 적합하게 투명 생체 적합성 및 기체 투과성이다. PMMA 및 PET 기판을 레이저 제거와 쓰기를 사용하여 처리 할 저렴하고 쉽습니다.
미세 유체 장치는 세포가 서로 다른 화학적, 물리적 자극에 될 수 있습니다 안정적이고 제어 미세 환경 세포를 제공해야한다. 예를 들어, 마이크로 유체 칩은 세포의 주 화성을 연구하는 데 사용됩니다. 대신에 보이든 챔버와 모세관 4,5 이러한 소형 유체 장치는 세포의 행동 1,6,7을 공부 정밀 화학 그라디언트를 생성 할 수 있습니다 사용 전통적인 방법. 또 다른 예는 전기장 (EFS), 현상이라는 electrotaxis에서 세포의 방향 이동을 연구하는 것입니다. 셀 Electrotactic 동작은 신경 재생 8, 9 배 발생과 관련된 것으로보고 된그리고 10, 11 상처 치유. 많은 연구는 14,15 림프구 암세포 (12, 13)을 포함하는 다양한 세포 유형의 electrotaxis을 조사 백혈병 세포 (11)을 수행하고, 세포를 16 줄기되었다. 통상적으로, 배양 접시와 커버 유리는 EFS (17)를 생성하기위한 electrotactic 챔버를 구성하는 데 사용됩니다. 이러한 간단한 설정은 중간 증발과 부정확 한 EFS의 문제를 제기하지만, 그들은 동봉, 잘 정의 된 유체 채널 12,18,19의 미세 유체 장치에 의해 극복 될 수있다.
체계적으로 정밀 제어 및 전기 화학적 자극 하에서 세포 반응을 연구하기 위해, 동시에 복수의 자극을 가진 세포를 제공 할 수있는 미세 유체 소자를 개발하기 위해 아주 유용하게 사용될 것이다. 예를 들면은, 리튬 등. 하나 만들거나 화학 그라데이션 및 EFS (20)를 공존을위한 PDMS 기반 미세 유체 장치를보고했다. 카오는 등. DEVEFS 6 폐암 세포의 주 화성을 조절 유사한 미세 유체 칩을 눈 맞아 달아. 또한, 처리량, 허우 등의 알을 증가시킵니다. 설계 8 가지 조합 자극되고 (2 EF 강도 × 4 화학적 농도) 21 셀을 제공하는 PMMA 기반 멀티 - 이중 전계 칩 제조. 또한 전역을 증가시키고 전단 응력 자극을 추가하려면, 우리는 단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에 따라 세포 반응을 연구하기위한 두 PMMA 기반 미세 유체 장치를 개발했다.
소호 등의 알. 22, 23으로보고,이 장치는 생체 순환 시스템을 흉내 낸 연속 유체 흐름에 따라 다섯 가지 독립적 인 세포 배양 채널을 포함한다. 제 1 칩 (화학 전단 응력 칩 또는 CSS 칩) 다섯 대하여 0의 농도를 1/8, 1/2, 7/8, 및 1 배양 영역에서 발생하고, 전단 응력 구배이다되고 produ의다섯 문화 각 영역 내부 세드릭. 제 칩 전극 중 하나의 세트와이 주사기 펌프를 사용하여 (화학 - 전계 칩 또는 CEF 칩)에서, 다섯 EF 강도는 이러한 배양 영역 내에서 다섯 가지 화학 물질의 농도에 부가하여 발생된다. 수치 계산과 시뮬레이션 나은 설계를 수행하고 이러한 칩을 제공하고,이 장치의 내부에 배양 폐암 세포는 반응성 산소 종의 생성과 관련하여 자신의 응답을 관찰하는 단일 또는 공존 자극 (ROS) 적용을 받는다 마이그레이션 속도 및 마이그레이션 방향. 이 칩은 시간을 절약 세포는 다양한 마이크로 환경 자극에 어떻게 반응하는지 조사에 대한 높은 처리량과 신뢰할 수있는 장치로 입증된다.
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Protocol
1. 칩 설계 및 제조
- 그리기 패턴은 상용 소프트웨어 (24)를 사용하여 PMMA 기판 및 양면 테이프에 절제합니다.
- 다섯 배양 영역 (도 1a 및도 1b)의 각각의 말단에 가변 폭의 "크리스마스 트리"패턴을 그리는, 화학 농도 및 전단 응력의 효과를 연구한다.
- 소금 교량이 더 유체 채널 (그림 2A와 2B)와 "크리스마스 트리"패턴을 그려, 화학 물질 농도와 전기장의 효과를 연구합니다.
- 스크 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 시트 또는 CO 2 레이저 스크 라이버에 해당 파일을로드하여 양면 테이프의 개별 패턴입니다.
- 레이저 스크 라이버를 켜고 컴퓨터와의 연결을 확인합니다. 패턴을 열고하면 상용 소프트웨어를 사용하여 절제합니다.
- 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 시트 또는 양면 테이프 (을)를 배치스크 라이버의 무대 n 개의 탑. 교정 바와 가시 He-Ne 레이저를 사용하여 필요에 CO 2 레이저의 초점을 조정한다.
- PMMA 시트 또는 테이프에 절제의 스크 라이버로 패턴을로드합니다.
- , 디자인 시트 또는 테이프를 들고 불필요한 부분을 제거하고 질소 불고와 표면을 청소합니다.
주 : PMMA 시트의 두께는 1 mm이고, 상기 양면 테이프의 0.07 mm 또는 0.22 mm이다.
2. 칩 조립
- 슈퍼 접착제, 상단의 나사산과 구멍에 맞춰 칩의 최상위 층 (중간 나사산 길이 x 폭 x 높이 = 10mm X 10mm X 5mm) 아크릴 어댑터를 연결 - 대부분의 층. 이러한 어댑터는 입구 / 출구과 소금 브리지 커넥터 매체의 역할을한다.
- 층류 후드 내부의 마이크로 유체 칩을 조립합니다.
- 화학 - 전단 응력 미세 유체 칩 (CSS 칩)을 조립합니다.
- 에이ttach 스크라이브 양면 테이프 2 개를 사용하여 스크라이브 PMMA 시트 3 장. (도 1a 및도 1b).
- 칩의 아래로 0.07 mm 두께의 양면 테이프의 또 하나의 조각을 추가하고 10cm 직경 페트리 접시에 칩을 부착합니다.
- 밤새 진공 챔버 내의 조립체 칩을 넣어.
- 화학 - 전계 칩 (CEF 칩)를 조립하는 두께의 양면 테이프로 PMMA 시트를 부착 = 0.22 mm (도 2A 및 2B).
- 테이프의이 같은 조각을 사용하여 10cm 직경 페트리 접시에 스크라이브 PMMA 시트와 양면 테이프를 부착합니다.
- 후드 내부에 조립 된 칩을두고 살균 30 분 동안 UV에 노출.
- 플라스틱 튜브를 손으로 조인 너트를 통해이 3 ml를 주사기로 입구를 연결합니다. 플라스틱 관, 손으로 조인 너트를 통해 폐기물 관에 콘센트를 연결합니다.
참고 : 오토 클레이브이전에 사용에 15 분 동안 121 ° C에서 모든 튜브와 너트입니다. - 천천히 PBS와 주요 유체 채널 주사기의 플런저를 우울. 거품을 제거하기 위해 앞뒤로 주사기를 밀어 넣습니다.
- 5 % CO 2에서 37 ° C에서 하룻밤 인큐베이터 안에 칩을 넣어.
참고 :이 두 단계는 칩 내에 남아있는 거품을 칩을 씻어 제거하는 것을 목표로하고 있습니다. - 인큐베이터에서 칩을 가져 가라.
- CEF 칩에 전기장을 생성하는 한천 소금 교량을 준비합니다.
- 마이크로파를 이용하여, 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 버퍼 3 % 저 융점 아가로 오스를 녹인다.
- 솔루션 단계적 소금 다리 채널로 아가로 오스 주입 및 솔루션이 응고되기 전에 전극을 삽입합니다.
- 관 너트에 실버 / 실버 염화물 전극을 배치합니다.
- 둘 베코의 수정 EagleR (주사기 펌프에 주사기를 연결하고 지속적으로 배지 흐름17, 20 μL의 유량에서 10 분 동안 유체 채널로의 배지는 DMEM) / 분 PBS하기.
3. 셀 준비 및 실험 설정
참고 : 사전 따뜻한 1X PBS, 사용 전에 37 ° C의 물을 욕조에 배지 (DMEM 플러스 FBS), 트립신.
- 플레이트 (2) × 105 폐암 세포 CL1-5 더한 DMEM, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)가 공급되는 10cm 페트리 접시 25,26. 90 % 합류 할 때까지 37 ℃에서 5 % CO 2 인큐베이터에 따라 내부의 세포를 인큐베이션.
- 매체를 기음과 미리 예열 1X PBS로 한 번 세포를 씻으십시오. 세포에 0.05 % 트립신 버퍼 2 ML을 추가하고 세포를 분리하기 위해 37 ℃에서 2 분 3 기다립니다.
- 15 ㎖의 멸균 된 원심 분리 튜브에 세포 이동 및 관에 배양 배지 6 ㎖에 추가한다. 조심스럽게 혼합 관을 거꾸로하고 hemocytomete에서 세포 수를 카운트하는 세포 함유 배지 5 μl를 꺼내아르 자형.
- 300 X에서 튜브를 원심 분리기 5 분 g. 배지 1 ㎖에 10 6 세포를 일시 중단하고, 1 mL의 주사기에 세포 함유 배지를 배치했다.
- 콘센트에서 미세 유체 칩에 셀 함유 배지를 주입하고, 용액이 오 문화 영역을 통해 모두 배포해야합니다. 2 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO 2 인큐베이터에 따라 내부의 칩 부화.
4. 실험 설정
- 인큐베이터에서 칩을 가지고 투명 인듐 주석 산화물 (ITO) 유리 히터의 상부에 배치.
주 : ITO 유리 열 커플러로부터의 피드백을 통해 37 ± 0.5 ℃의 온도를 유지하기위한 비례 적분 미분 (PID) 제어기로 연결되는 ITO는 히터 칩 사이에 단단히 고정. - 세포 이동 또는 고정 XY 스테이지를 추적 반전 현미경 전동 XY 스테이지 위에 칩 히터 어셈블리를ROS의 생성을 측정하기위한 반전 형광 현미경.
- (배양 배지에 용해) 상대 농도가 0 및 1의 화학 용액 5 ㎖로 두 주사기를 채우기 다른 화학적 농도를 생성하고 원하는 유량 칩로 펌핑 다음 CSS 칩에 0.3 mL의 유속 1 시간 동안 / 분; 처음 20 분 동안 20 μL / 분의 유속에서 CEF 칩 다른 120 분 (총 시간 = 2 시간) 20 μL / hr의 유속이다.
- CEF 칩에서 디지털 일안 반사를 통해, 문화 영역 2 매 15 분 이내 뷰의 특정 필드 (영상 범위)의 (DSLR) 카메라를, 세포 이동, 현미경의 XY 스테이지는 사진을 찍고 반복하는 프로그램을 추적 시간.
- ROS의 생성을 측정하기 위해, 형광 기반 표시 -2'- 7'- dichlorodihydrofluoresce 디 아세테이트 (2'- 7'- DCFDA)를 사용한다.
- 분자 생물학 수준의 디 10 밀리미터에서 2'-7'-DCFDA의 재고를 준비메틸 설폭 사이드 (DMSO). 단지 혈청 (DMEM 5 μM)없이 DMEM에 DCFDA을 희석. 전위 아세틸 라제 백그라운드 시그널을 증가시키고 세포 내에서 신호를 줄일 수있다.
- CSS의 칩 또는 CEF 칩 EF 자극 2 시간 후에 전단 응력 자극 1 시간 후, 20 μL / 분의 유속에서 칩에 2'- 7'- DCFDA (DMEM 5 μM)를 펌프 처음 20 분, 또 다른 20 분 동안 20 μL / hr의 유속. 세척, 20 분 동안 20 μL / hr의 유속으로 상기 칩 DMEM 펌프.
- 형광 강도를 분석하기위한 배양 영역 내에서 소정의 영상 범위의 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 통해 사진을 찍어.
화학 물질의 농도, 전단 응력 및 전기 분야의 5. 계산
- CSS의 칩과 칩 CEF 모두에서, 다섯 배양 분야의 화학적 농도를 계산한다. 예를 들어, CONCENTR의 H 2 O 2를 주입하여관리 포인트 0 개의 입구에서 200 μM, 0, 25, 100, 175, 및 200 μM이 생성 농도.
주 : 모든 액체 분할 흐름을 원활하게하는 것이 동등 포크 주위 가정하여, 다섯 배양 영역의 상대적인 농도는 각각, 0, 1/8, 1/2, 7/8, 1이다. - CSS의 칩에 사용하여 배양 각 영역 내에서의 전단 응력 (τ)을 계산
Q는 유체 점도 η 체적 유량, 27은, H는 채널의 높이이고 w는 채널의 폭이다.
주 : 각 입구 (Q = 0.12 ㎖ / 분 각 배양 영역)에서 Q = 0.3 ㎖ / 분으로 설정함으로써 η = 0.0008 파 · S 배지, H = 1mm, 및 w = 1 ~ 4mm의 용 전단 응력은 0.0192 아빠에 0.0048 아빠 (4 mm 폭 영역) (1 mm 폭 지역)의 범위로 계산된다. - 에서CEF 칩, σ는 배양액의 전기 전도도이며, I는 유체 채널을 통해 흐르는 전류이고 E = I / (ΣA의 EFF) (옴의 법칙)을 사용하여 배양 각 영역 내의 EF 강도를 계산 및 EFF 채널의 유효 단면적이다.
주 : 사용 σ는 = 1.38 Ω -1 m -1 배지 및 EFF = 0.22 mm (2) (폭 = 1 mm, 높이 = 0.22 mm)를 들어, EF 강도 E (MV / mm) = I (것으로 계산 A) 3.3 × 10 6 ×.- 도 2D에 도시 된 바와 같이, 네 개의 (8 + 35 + 8) 세그먼트 중 하나 (5 + 35 + 5) 세그먼트 다섯 C 섹션 회로와 같은 등가 회로를 처리한다.
주 : 키르히 호프의 전압 법칙과 옴의 법칙에 따라이 병렬 회로를 분석함으로써, 오 문화를 통해 흐르는 전류는I (1)가 아래에서 위로 I 내지 5로서, I (영역 1) 약 0.49로 계산되고, 0.25 I (영역 2) 0.13 I (영역 (3)), 0.08 I (영역 4) 0.05 I를 (면적 5) 각각 I)은 전체 직류 (DC이다. 0.157 mA, 254의 EFS, 130, 67, 41, 26 MV / mm의 적용 직류로 다섯 가지 문화 영역 내에서 생성된다.
참고 : 미세 유체 네트워크의 단순화 된 전기 분석을 위해, 모든 유체 세그먼트는 자신의 길이에 비례 저항 저항으로 간주됩니다.
- 도 2D에 도시 된 바와 같이, 네 개의 (8 + 35 + 8) 세그먼트 중 하나 (5 + 35 + 5) 세그먼트 다섯 C 섹션 회로와 같은 등가 회로를 처리한다.
Q는 유체 점도 η 체적 유량, 27은, H는 채널의 높이이고 w는 채널의 폭이다. 6. 데이터 분석
참고 : 데이터 분석은 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 수행된다.
- ROS의 생산을 분석합니다.
- ImageJ에 소프트웨어를 실행합니다. 형광 이미지를로드 "파일"→ 열기로 이동하는 분석한다.
- 메신저를 변경하려면 "이미지"→ "입력"→ "16 비트"로 이동그레이 스케일로 세.
- 셀을 둘러싸 다각형을 그립니다. 셀의 평균 형광 강도를 측정하는 → "측정"을 "분석"로 이동합니다.
- 3 개의 독립적 인 실험의 적어도 50 세포 세기를 수집하고, 평균의 표준 오차 (SEM)으로 평균 강도를 계산 6.1.3을 반복한다.
- 각 실험 조건에 대한 6.1.1-6.1.4를 반복합니다.
- 세포 이동을 분석합니다.
- ImageJ에 소프트웨어를 실행합니다. 시간 = 0에서 촬영 된 이미지를로드 "파일"→ 열기로 이동하는 분석한다.
- 셀을 둘러싸 다각형을 그립니다. (× 1, Y 1)과 세포의 질량 중심을 측정하는 → "측정"을 "분석"로 이동합니다.
- 6.2.1- 6.2.2은 = 시간 t을 다른 이미지에서와 같은 세포의 질량 중심 (× 2, Y 2)를 측정하기 위해 반복합니다.
- 의 (μm의 / 시간 단위) 이동 속도를 계산이 셀로
. - 3 개의 독립적 인 실험의 적어도 50 세포에서 이주 요금을 수집하고, 평균의 표준 오차 (SEM)으로의 평균 이동 속도를 계산하도록 반복 6.2.1-6.2.4.
- 6.2.2과 6.2.3에서, 코사인 θ로이 세포의 마이그레이션 directedness을 계산하거나
, θ는 (양에서 음으로)인가 EF의 벡터 사이의 각도와 셀 (도 2G)의 끝 위치에 처음부터 벡터이다. - 3 개의 독립적 인 실험의 50 세포에서 마이그레이션 directedness를 수집하고 평균의 표준 오차 (SEM)과 평균 마이그레이션 directedness을 계산하기 위해 6.2.6를 반복합니다.
- SEM와 평균 이동 속도와 각 실험 조건에 대한 SEM과 평균 마이그레이션 directedness을 계산합니다.
참고 : directedness+1 모든 세포가 캐소드 측으로 이주 것을 나타내고, 값 -1이 모든 셀이 양극 측으로 이주 것을 나타낸다. 무작위로 이동 셀 그룹의 directedness는 0에 가깝습니다.
- 셀 정렬을 분석합니다.
- ImageJ에 소프트웨어를 실행합니다. 이미지를로드하기 위해 "파일"→ "열기"로 이동하는 분석한다.
- 타원과 세포 치료 및 세포의 장축을 나타 내기 위해 선을 그립니다. 라인과 수평 EF 방향 사이의 β 각도를 측정하는 → "측정"을 "분석"로 이동합니다.
- 3 개의 독립적 인 실험의 50 세포에서 β를 수집 6.3.2를 반복 계산 평균 코사인 β 평균의 표준 오차 (SEM)와 함께.
- 각 실험 조건에 대한 6.3.1-6.3.3를 반복합니다.
주 : 1의 β COS A는 모든 셀이인가 EF 평행하게 정렬되도록 표시하고, 0 값은 모든 셀 perpendicularl 정렬 것을 나타낸다인가 된 EF에 y를.
. 
, θ는 (양에서 음으로)인가 EF의 벡터 사이의 각도와 셀 (도 2G)의 끝 위치에 처음부터 벡터이다. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
화학 전단 응력 (CSS) 칩
CSS의 칩이 양면 테이프를 통해 함께 연결된 세 PMMA 시트 두께 1mm 각, 두께가 0.07 mm (도 1A 및 1B) 각각에 형성된다. 은 "크리스마스 트리"구조는 0의 다섯 상대 농도를 생성 1/8, 다섯 문화 분야에서 1/2, 7/8, 1. 체적 유량, 유체 점도 및 유체 채널의 사이즈에 관련된 크기로, 삼각형, 전단 응력 구배로 배양 영역을 설계함으로써, 각 영역 내에서 생성된다. 이 칩은 배양 폐암 CL1-5 세포 배양 접시에, 또 0.07 mm 두께의 양면 테이프로 부착하고, ROS의 생성은 다른 화학적 농도 및 전단 응력에 응답하여 관찰 하였다. 폐암 세포 내 ROS의 생성은 고도의 LU와 관련된NG 암 전이 개발 및 특정 화학 전단 응력은 ROS의 생성 (23)에 관여하는 것으로 입증되었다.
먼저, ROS의 생성에 H 2 O (2), 화학적 자극의 효과를 연구하기 위해, 세포가 연속 2 O 2 용액 0, 25, 100, 175, 및 200 μM에서 H의 흐름과 함께 배양 하였다. 도 1c에 도시 된 바와 같이, 형광 강도는 H 2 O 2가 ROS의 생성을 자극을 나타내는 증가 된 H 2 O 2 농도 증가. 이어서, ROS의 생성에 대한 전단 응력의 영향을 조사하기 위해, 세포를 0.0192로 0.0048 Pa의 전단 응력 구배에 노출 된 아빠.도 1d는 형광 강도가 증가 된 전단 응력 증가 것을 보여준다 (전단 응력이 가장 높았다 등) 각각 전면 및 후면 영역에서 가장 낮은 제안높은 전단 응력이 더 ROS 생성을 유도한다는 보내고. 또한,이 CSS 칩 α 토코페롤의 상이한 농도에 응답하여 ROS의 생성을 연구하기 위해 사용되었다 비타민 E. 셀 형태의 산화 방지제가 전단 응력 플러스 0 α 토코페롤, 3.2, 12.5, 21.9로 자극 하였다 , 25 μg의 / ㎖. α 토코페롤의 농도를 들면,도 1E에서보다 낮은 21.9 μg의 / ml에 도시 된 바와 같이, 형광 강도는 ROS의 생성을 감소 α 토코페롤의 효과를 나타내는, 증가 된 농도가 감소 하였다. 농도가 25 μg의 / ㎖로 증가하지만, 평균 강도는 α 토코페롤이 고농도 낮은 농도에 비해 훨씬 ROS를 제거하지 않았 음을 시사 증가.
화학 전기 필드 (CEF) 칩
CEF 칩은 두께 1mm의 PMMA 및 0.2 이루어지는그것은 (그림 2A와 2B)에 패턴 유체 채널 2 mm 양면 테이프. 유사하게, "크리스마스 트리"구조는 0의 다섯 상대 농도를 생성 1/8, 다섯 배양 분야의 1/2, 7/8, 1. 또한, 이들 다섯 병렬 영역은 전기 회로와 유사한 유체 경로를 형성하기 위해 수직으로 연결된다. 배양 영역 내에서 발생되는 전계 영역을 통과하는 유체가 채널의 단면적, 및 직류 (DC)의 도전성에 관한 것이다. I이 적용된 DC (도 2c)이다 키르히 호프의 전압 법 및 옴의 법칙에 따르면, 다섯 배양 영역에서 전류는, 각각 0.49 I, 0.25 I, 0.13 I, 0.08 I, 0.05 I이다. 이 칩은 세포 이동과 블라우스를 관찰 CL1-5 폐암 세포를 배양하기위한 배양 접시로 0.22 mm 두께의 양면 테이프로 부착되고다른 화학 물질의 농도와 전기장에 응답하여 ROS의 n은.
첫째로,이 칩 honokiol 상이한 농도, EFS 다른 장점, 및 양자의 조합 치료에 반응 ROS의 생성을 연구하기 위해 사용되었다. Honokiol, 목련 속에서 분리 저분자 폴리 페놀은 전임상 연구 28 항 혈관, 항 염증 및 항 종양 성질을 갖는 것으로 밝혀졌다. 도 2D에 도시 된 바와 같이, ROS는 제조가 거의 67 MV / mm 미만 EFS에 대해 동일하지만,이 값보다 EFS 증가함에 따라 증가 하였다.도 2e는 전기장과 honokiol의 조합 치료 아래 ROS 수준 거의 머문 것을 보여준다 동일 honokiol 외생 ROS의 생성을 억제 (예., EF 자극 관련된 ROS), 특히 높은 EFS 하에서 것을 나타낸다. 단일 또는 화학적 공존 하에서 세포 이동/ 전기 자극은 CEF이 칩을 사용하여 조사 하였다. honokiol의 첨가없이,도 2F에 도시 된 바와 같이, EF 강도가 증가할수록, 마이그레이션 속도는 증가 하였다. 상이한 농도의 honokiol을 첨가 한 후, 이동 속도는 ROS의 생성을 억제하는 것을 통해 가능 honokiol 감소 된 세포 이동을 시사 일반적으로 감소 하였다. 마이그레이션 directedness 그림 2G에 표시됩니다. EF의 존재 하에서 만, 폐암 세포 (음의 값)와 애노드쪽으로 띄는 방향 이동을 나타내었다. 다른 농도의 honokiol을 추가 한 후, 모든 EF-자극 영역에 대한 마이그레이션 directedness에 약간의 감소가 있었다.
그림 1 : 전단은 폐암 세포에 강조한다 화학 제품의 효과 및 연구에 사용 된 화학 전단 응력 (CSS) 칩 2.삼
(A)는 PMMA 기판의 세 층은 CSS 칩을 형성하는 두 개의 양면 테이프를 통해 함께 결합된다. (B) 통합 CSS 칩. (C) 위쪽 : 형광 1-5 세포 후의 CL의 명 시야 화상은 H 2 O 2의 다양한 농도로 처리된다. 스케일 바는 50 μm의 =. 아래 : SEM과 평균 형광 강도는 H 2 O 2의 서로 다른 농도로 꾸몄다. (D) 맨 : 1-5 세포를 다른 전단 응력에서 CL의 형광 이미지. 스케일 바는 50 μm의 =. 아래 : SEM과 평균 형광 강도는 다른 전단 응력에 꾸몄다. (E) 최고 : 1-5 세포 α 토코페롤의 다른 농도와 전단 응력로 자극 된 후 CL의 형광 밝은 필드 이미지. 스케일 바는 50 μm의 =. 아래 : SEM과 평균 형광 강도는 α 토코페롤의 다른 농도로 꾸몄다. 데이터 승 여기에 제시원래 기준 23 년에 출판있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 화학 물질의 효과 및 폐암 세포 (22)에 전기 분야를 연구에 사용 된 화학 - 전기장 (CEF) 칩.
PMMA의 (A) 하나의 층은 CEF 칩을 형성하는 양면 테이프를 통해 배양 용기에 결합된다. (B)이 CSS 칩의 유체 패턴. (C) 미세 유체 칩의 등가 전기 회로. (D) 왼쪽 : 1-5 세포 후 CL의 형광 밝은 필드 이미지는 EFS의 다른 강점으로 처리된다. 스케일 바는 50 μm의 =. 오른쪽 : 형광 평균SEM와 강도는 EFS의 다른 강점으로 꾸몄다. (E) 왼쪽 : 형광등과 1-5 세포 후 CL의 밝은 필드 이미지가 결합 honokiol와 EFS로 처리된다. 스케일 바는 50 μm의 =. 오른쪽 : SEM 결합 honokiol 및 EFS에서 플롯과 형광 강도를 의미한다. (F) 만 (제어로 표시) EFS와 결합 honokiol와 EFS로 처리 된 후 CL1-5 세포의 이동 속도가 (honokiol로 표시). (G) (honokiol로 표시) 만 (제어로 표시) EFS와 결합 honokiol와 EFS로 처리 된 후 CL1-5 세포의 마이그레이션 directedness. 여기에 제시된 데이터는 원래 기준 22 년에 출판되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
PMMA 계 칩보다 복잡한 소프트 리소그래피를 필요 PDMS 기반의 칩에 비해 저렴하고 쉬운 방법이다 레이저 어블 및 기입을 사용하여 제조된다. 미세 유체 칩을 설계 한 후, 제조 및 조립은 5 분 이내에 수행 할 수 있습니다. 주의 실험을 수행에 지급해야 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 "부착"문제이다. 어댑터는 칩의 최상위 계층에 제대로 붙어해야합니다. 너무이인가되면 접착제 유체 채널로 누출 수 있고, 너무 적은 접착제가 사용되는 경우, 액체는 칩 밖으로 유출 할 수있다. 또한, 상기 PMMA 기판과 양면 테이프를 조립할 때, 그 액체 누출을 방지하기 위해 밀접 전체 칩을 눌러 압력을 적용하는 것이 중요하다. 두 번째는 "버블"문제이다. 기포를 제거하기 위해, 1X PBS 연속 20 μL / 분의 유속으로 1 또는 2 분 동안 유체 채널로 유입 된 후, 상기 칩은 P이고37 ° C에서 하룻밤 5 % CO 2에서 인큐베이터 안에 레이스. 유체 채널 내에 남아있는 기포가있을 경우, 흐름은 비균질 화학 농도 및 EF 분포 일으키는 불균일 할 것이다. 세 번째는 "셀 로딩"문제입니다. 배양 영역에로드 된 셀의 개수가 잘 조절하여야한다. 셀 수가 너무 낮다면, 많은 실험이 실행 통계적 목적에 충분한 데이터를 수집하기 위해 실시한다. 셀 수가 너무 높은 경우, 각각의 세포를 구별하고 그들의 이동을 정량화하기 어렵다.
CSS의 칩 삼각 배양 영역과 결합 된 "크리스마스 트리"구조는 각각이 전단 응력 구배를 갖는 5 개 영역의 서로 다른 화학 물질의 농도를 생성한다. 유체 전단 응력은 첨부 형태 마이그레이션 및 세포의 활성에 영향을 미치는 것으로 알려졌다. 아빠가 세포 부착을 인터페이스 할 수 낮은 0.25-0.6로의 전단 응력, 스트레스 (0.5 -10 PA) 및 더 높은 값을 부착 세포 (29)을 제거하는 것으로보고되었다. 흐름 (30) 및 더 낮은 값 (0.1 PA)의 방향으로 0.8 내지 1.5 파 유도 세포 정렬 범위 층류 전단 응력 세포 형태학 및 투과도 29 영향을주는 것으로 알려져 있었다. 또한, 2-120 아빠의 응력을 전단을 실시 평활근 세포는 세포 수 (31)의 감소를 경험했다. 루는 등. 세포 부착 (27)의 정량 분석을위한 미세 유체 전단 장치의 설계 및 구성을보고했다. 유체 채널 내에 전단 응력은 채널의 크기를 변경함으로써 변경되었다. 턱 등. 용기 (32)에 혈액의 유동 프로파일을 모방하는 마이크로 채널에서의 배양 배지의 유량을 제어하는 혈역학 랩 온어 칩 시스템을 설명했다. 유체 채널 내에 전단 응력은 매체의 유량을 변경함으로써 변경되었다. 에서SE 두 장치는 임의 값의 전단 응력을 생성 할 수있는 경우에도, 단 하나의 값이 한 번에 하나의 배양 공간 내의 유효했다. 이에 비해, 본 CSS 칩은 하나의 삼각형 영역의 전단 응력 구배를 제공하는 스크리닝 목적을 위해, 특히 실험 처리량을 증가시키는 장점을 갖는다.
CEF 칩에서, "크리스마스 트리"구조 배양 영역은 수직으로 전기 회로와 유사한 유체 경로를 형성하도록 접속된다. 한 직류인가에서 다섯 EF 강도는 각각의 특정 화학 물질의 농도의 흐름을 갖는 배양 영역 내부에서 발생된다. 종래 electrotactic 실험 부정확 EFS 매체 증발, 대 세포 / 시약 소비 증가 주울 가열의 문제가 발생할 수있는 배양 접시에서 수행 하였다. 밀폐 된 소형의 마이크로 유체 장치는 효율적으로 이러한 단점을 극복. 예를 들어, O electrotaxis 공부F 인간 혈액 메모리 T 세포, 린 등. 두 개의 변형 된 피펫 팁 중간 저장소 역할을 동일한 두 개의 나란히 마이크로 채널 및 EF 애플리케이션 (15)에 대한 두 개의 백금 전극을 포함하는 플라스틱 미세 유체 소자를보고 하였다. 처리량을 증가시키기 위해, PMMA 계 electrotactic 칩을 하나의 단일 장치 12,33 다중 EF 강도를 제공하도록 제조되었다. 또한, 제어 가능한 화학적 및 전기 자극을 발생하는 미세 유동 장치가 동시에 높은 관심이다. 리 등. T 세포 (14)의 주 화성 또는 electrotactic 이동을 조사하는 단일 또는 공존 화학적 구배 / EFS를 생성 PDMS 기반의 미세 유체 소자를 제작. 카오는 외. EFS (12)를 이용하여 폐암 세포의 주 화성을 조절 유사한 미세 유동 장치를 이용. 이 두 장치에서는, Y 자형 구조는 하나의 응용 EF에서 안정한 농도 구배를 만들기 위해인가. 허우 등. 폐암 세포 (21)에 화학 물질과 EFS의 동시 효과를 연구 할 수있는 멀티 - 이중 전계 칩을 발표했다. 이 장치는 하나의 실험에서 전기 / 화학적 자극 (2 전기 화학 × 4)의 8 개의 조합을 제공 할 수 있었다. 처리량이 증가하지만,이 칩의 용량은 (1) 하나의 EF 강도 (및 대조군으로서 하나의 제로), (2) 네 개의 주사기 펌프는 네 개의 독립 채널로 화학 물질을 펌핑 필요로 한정 하였다. 이에 비해, 본 CEF 칩 전극 중 하나의 세트의 두 시린지 펌프를 통해 함께 다섯 화학적 농도 다섯 EF 강도를 생성하는 장점이있다.
이 칩을 제조 할 쉽게 있지만, 그들은 몇 가지 제한이 있습니다. 먼저, 다섯 "특정"농도 다섯 "특정"EF 세기를 생성 할 수있다. 둘째, 유체 채널의 너비는 상기 포커싱 때문에 1mm 미만 수 없다CO 2 레이저 빔. 그러나 정확하게 입구 및 유체 채널을 통과하는 전류의 화학 물질의 농도를 제어함으로써 임의의 농도 및 EF 강도는 배양 영역에서 달성 될 수있다. 결론적으로, 본 CSS 및 CEF 칩은 단일 또는 공존 제어 화학적 / 전기적 / 전단 스트레스 자극에 세포를 제공 할 수있다. 하나의 CSS 칩에서, 전단 응력 구배와 조합하여 다섯 가지의 화학적 농도를 생성 할 수있다. 또한, 하나의 칩에 CEF 다섯 EF 세기와 조합하여 다섯 가지의 화학적 농도를 생성 할 수있다. 은 "크리스마스 트리"구조의 가지를 증가시킴으로써,이 칩의 스루풋을 더욱 증가시킬 수있다. 이 칩은 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에 따라 세포의 행동을 연구하기 쉬운, 시간 절약, 신뢰성 및 높은 처리량 플랫폼으로 입증된다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10 cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImageJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
References
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