Abstract
Mikroakışkan cihazlar pH, sıcaklık, tuz konsantrasyonu, ve diğer fiziksel ya da kimyasal uyarılara bir hassas ve kontrollü hücresel mikro çevrede oluşturma yeteneğine sahiptir. Bunlar genellikle çevresi gibi in vivo sağlayarak in vitro hücre çalışmaları için kullanılmıştır. bu olayların hücresel özellikleri ve işlevleri anlamada önemli olduğundan özellikle hücreleri kimyasal geçişlerini, elektrik alanlar ve kayma gerilmeleri cevabını kaç ilgi çekmiştir. Bu mikro-akışkan yongaları, cam substratlar silikon gofret, polidimetilsiloksan (PDMS) polimer, polimetilmetakrilat (PMMA) alt-tabakalar ya da polietilentereftalat (PET) alt tabakaların yapılabilir. Bu malzemelerin dışında, PMMA substratlar ucuz ve kolay bir şekilde lazerle ablasyonu ve yazma kullanılarak işlenebilir. Birkaç mikroakışkan cihazları, birden üreten kimyasal ve elektrik uyarılarının eşlik için tasarlanmış ve imal edilmiş olmasına rağmen, bunların hiçbiri kabul edildiYeterince tarama amacıyla özellikle deneysel tekrarlar, azaltılmasında etkili. Bu yazıda, tek veya eşlik eden kimyasal / elektrik / kayma gerilmesi uyaranlara altında, reaktif oksijen türlerinin üretimi ve göç, hücresel yanıtları araştırmak için iki PMMA esaslı mikroakışkan cips bizim tasarım ve imalat açıklar. İlk çip beş göreli konsantrasyonları üretir 0, 1/8, birlikte bu alanların her birinde içinde üretilen bir kayma gerilmesi gradyan ile kültür bölgelerinde 1/2, 7/8, ve 1. İkinci çip ancak her kültür alanı içinde oluşturulan beş farklı elektrik alan güçlü olan, aynı bağıl konsantrasyonlarını oluşturur. Bu cihazlar sadece hassas, kontrollü mikro-çevre hücreleri sağlamak değil, aynı zamanda büyük ölçüde deneysel verimi arttırmak değil.
Introduction
In vivo hücreler ekstrasellüler matriks (ECM), karbonhidratlar, lipidler ve diğer hücreleri dahil biyomoleküllerin çeşitli çevrili içinde. Bunlar çeşitli büyüme faktörleri kimyasal degradeler için ECM ile etkileşimler ve yanıtları mikro çevresel uyaranlara yanıt vererek işlerlik. Hücre ve reaktiflerin tüketimi büyüktür ve hücre ortamı (dışı dolaşım) statik yetiştiği Geleneksel olarak, in vitro hücre çalışmaları Hücre kültür tabaklarında yürütülmektedir. Son zamanlarda, akışkan bileşenleri ile entegre mikro fabrikasyon cihazlar daha kontrol edilebilir bir şekilde hücre çalışmaları için alternatif bir platform haline gelmiştir. Bu tür cihazlar hücreleri ve reaktifler tüketimini en aza indirirken, kimyasal ve fiziksel uyaranlar kesin bir mikro-ortam yaratma yeteneğine sahiptir. Bu mikro-akışkan yongaları, cam substratlar silikon gofret, polidimetilsiloksan yapılabilir (PDMS) polimerleri, polimetilmetakrilat (PMMA) alt-tabakalar ya da polyethylenetereftalat (PET) 1-3 alt tabakalar. PDMS tabanlı cihazlar uzun vadede hücre kültürü ve çalışmalar için uygun hale, şeffaf biyolojik olarak uyumlu ve gazlara karşı geçirgendir. PMMA ve PET yüzeyler, lazer ablasyon ve yazma kullanılarak işlenecek ucuz ve kolaydır.
Mikroakışkan cihazlar hücreleri, farklı kimyasal ve fiziksel uyarıcılara maruz kalan bir sabit ve kontrollü mikro ortam hücreleri sağlamalıdır. Örneğin, mikro-akışkan fiş hücrelerinin kemotaksisini incelemek için kullanılır. Bunun yerine Boyden odası ve kılcal 4,5 bu minyatür akışkan cihazlar hücrelerin davranışlarını 1,6,7 çalışmak için kesin kimyasal degradeler oluşturabilir istihdam geleneksel yöntemlerin. Başka bir örnek elektrik alanları (EFS), bir fenomen adlı electrotaxis altında hücrelerin yönlü göç incelemektir. Hücrelerin Electrotactic davranışları, rejenerasyon 8, embriyonik gelişme 9 ile ilişkili olduğu bildirilmiştirve 10,11 yara iyileşmesi. Ve birçok çalışma, 14,15 lenfositlerin, kanser hücreleri 12,13 dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinin electrotaxis araştırmak için lösemi hücrelerini 11 yapıldı ve hücreler 16 kök edilmiştir. Geleneksel olarak, petri ve örtücü camlar EF'lerini 17 üretilmesi için electrotactic odaları oluşturmak için kullanılır. Böyle basit kurulumları orta buharlaşma ve kesin olmayan EF sorunlarını teşkil, ama onlar kapalı, iyi tanımlanmış akışkan kanalların 12,18,19 ve mikroakışkan cihazlar aşılabilir.
sistematik hassas, kontrol kimyasal ve elektriksel uyaranlar altında hücresel yanıtları incelemek için, aynı anda birden fazla uyaranlara hücreleri sağlayabilen mikroakışkan cihazlar geliştirmek için büyük kullanım olacaktır. Örneğin, Li ve diğ. Tek oluşturma veya kimyasal geçişlerini ve EF'lerini 20 coexisting için PDMS tabanlı mikroakışkan cihaz bildirdi. Kao ve diğerleri. devEF 6 akciğer kanser hücrelerinin kemotaksisini modüle benzer bir mikroakışkan çip eloped. Ayrıca, verimlilik, Hou ve ark artırmak için. tasarlanmış ve 8 farklı kombine uyaranlara olmanın (2 EF güçlü x 4 kimyasal konsantrasyonları) 21 ile hücreleri sağlamak için bir PMMA esaslı çok kanallı-çift-elektrik alan çip fabrikasyon. ayrıca boyunca artırmak ve kayma gerilmesi uyaran eklemek için, biz tek veya eşlik eden kimyasal / elektrik / kayma gerilmesi uyaranlara altında hücresel yanıtları incelemek için iki PMMA esaslı mikroakışkan cihazlar geliştirdi.
Lo ve ark. 22,23 tarafından bildirilen bu cihazlar in vivo dolaşım sistemini taklit eden sürekli akışkan akan tabi beş bağımsız hücre kültürü kanalları içerir. birinci çip (kimyasal kayma gerilimi çip veya CSS çip) beş göre 0 konsantrasyonları, 1/8, 1/2, 7/8 ve 1, kültür bölgelerinde üretilen ve bir kesme stresi gradyanı edilir süredenBeş kültür alanlarının her birinin içine ced. ikinci çip elektrot tek bir seti ve 2 şırınga pompaları kullanılarak (kimyasal-elektrik alan çip ve CEF çip) olmak üzere beş EF güçlü, bu kültür alanları içinde beş farklı kimyasal konsantrasyonlar ilave olarak oluşturulur. Sayısal hesaplamalar ve simülasyonlar daha iyi bir tasarım uygulandı ve bu yongaları işletmek ve bu cihazların içinde kültüre akciğer kanseri hücreleri reaktif oksijen türlerinin üretimi ile ilgili yanıtları gözlemlemek için tek veya eşlik eden uyaranlara (ROS) tabidir, göç oranı, ve göç yönü. Bu çipler zaman tasarrufu hücreleri çeşitli mikro-çevresel uyaranlara nasıl tepki araştırmak için, yüksek verim ve güvenilir cihazlar olduğu gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chip Tasarım ve İmalat
- Beraberlik desenleri ticari yazılım 24 kullanılarak PMMA yüzeyleri ve çift taraflı bantlar üzerinde kesip çıkartılacak.
- Beş kültür alanlarında (Şekil 1A ve 1B) her ucunda değişen genişliğe sahip bir "Noel ağacı" desen çizmek, kimyasal konsantrasyonlar ve kayma gerilmeleri etkilerini incelemek için.
- Tuz köprüleri için iki tane daha akışkan kanalları (Şekil 2A ve 2B) ile "Noel ağacı" desen çizmek, kimyasal konsantrasyonlar ve elektrik alanların etkilerini araştırmak.
- Çizici PMMA levha veya CO 2 lazer Scriber içine ilgili dosyayı yükleyerek bir çift taraflı bant üzerinde bireysel bir desen.
- Lazer Scriber açın ve bilgisayara olan bağlantısını kontrol edin. desen açın ticari yazılımı kullanılarak kesilip edilecek.
- PMMA levha ya da bir çift taraflı bant o yerleştirinScriber aşamasında n üst. Kalibrasyon bar ve görünür He-Ne lazer kullanarak gerekirse CO 2 lazer odağı ayarlayın.
- PMMA levha veya banda ablasyon için Scriber içine desen yükleyin.
- , Desenli levha veya bant Pick up istenmeyen parçaları kaldırmak ve azot üfleme ile yüzeyi temizleyin.
Not: PMMA tabakanın kalınlığı 1 mm, ve çift-taraflı bant olduğu 0.07 mm ya da 0.22 mm 'dir.
2. Chip Meclisi
- süper yapıştırıcı ile, üst vida konuları ve delikleri aynı hizaya getirerek çip en üst katmana (ortada vida dişleri uzunluk x genişlik x yükseklik = 10 mm x 10 mm x 5 mm) akrilik adaptörleri eklemek -En katmanı. Bu adaptörler giriş / çıkışları ve tuz köprüsü konnektörleri orta olarak hizmet vermektedir.
- Laminer akış kaput içinde mikroakışkan çip takılacak.
- Kimyasal kayma gerilmesi mikroakışkan çip (CSS chip) birleştirin.
- birttach tarif çift taraflı bant 2 adet kullanılarak tarif PMMA levhalar 3 yaprak. (Şekil 1A ve 1B).
- çip altına 0.07 mm kalınlığında çift taraflı bant bir parça daha ekleyin ve 10 cm çapında Petri kabı çipi takın.
- gece boyunca vakum odasında montaj çip koyun.
- Kimyasal-elektrik alan yonga (CEF chip) monte etmek için, kalınlığı bir çift taraflı bant PMMA levha takmak = 0.22 mm (Şekil 2A ve 2B).
- bant bu aynı parça kullanarak bir 10 cm çapında Petri kabı tarif PMMA levha ve çift taraflı bant takın.
- kaput içinde monte çip bırakın ve sterilizasyon için 30 dakika süreyle UV maruz kalmaktadır.
- plastik tüpler ve parmak sıkı fındık üzerinden iki 3 ml'lik şırınga girişleri bağlayın. Bir plastik tüp ve bir parmak sıkı somun vasıtasıyla atık tüpüne prizine takın.
NOT: Otoklavkullanımdan önce, 15 dakika boyunca 121 ° C 'de, tüm borular ve fındık. - Yavaş yavaş PBS ile Başbakan akışkan kanallarına şırınga pistonu bastırın. kabarcıklarını çıkarmak için ileri ve geri şırınga itin.
- % 5 CO2 altında 37 ° C'de gece boyunca bir inkübatör içinde cipsleri.
Not: Bu iki adım çip içinde kalan kabarcıklar çip yıkayın ve kaldırmak amaçlanmaktadır. - kuluçka çipi alır.
- CEF çip elektrik alanların oluşturulması için agar tuz köprüleri hazırlayın.
- Bir mikrodalga kullanılarak 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) tamponu içinde% 3 düşük erime noktası agaroz eritilir.
- çözüm aşamalı tuz köprüsü kanala agaroz enjekte edilir ve çözüm katılaşır önce elektrotlar eklemek.
- boru şeklindeki fındık içine gümüş / gümüş klorür elektrotlar yerleştirin.
- Dulbecco'nun Modifiye EagleR (enjektör pompaları şırınga bağlayın ve sürekli kültür ortamı akış17; 20 ul bir akış hızında, 10 dakika boyunca akışkan kanal içine ortamıdır, DMEM) / dakika PBS yerine.
3. Hücre Hazırlama ve Deneysel Kurulum
Not: Pre-sıcak 1X PBS, kullanmadan önce, bir 37 ° C su banyosu içinde kültür ortamı (DMEM artı FBS) ve tripsin.
- Plaka 2 x 10 5 hücre akciğer kanseri CL1-5 DMEM artı% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile birlikte 10 santimetrelik bir petri tabağına 25,26. % 90 birleştiği kadar 37 ° C 'de% 5 CO2 altında bir inkübatör içinde inkübe hücreleri.
- orta aspire ve önceden ısıtılmış 1x bir kez PBS ile yıkayın hücreleri. hücrelere% 0.05 tripsin tampon maddesi 2 ml ilave edilir ve hücreleri ayırmak için 37 ° C 'de 2 dakika ile 3 bekleyin.
- 15 ml'lik steril bir santrifüj tüpüne aktarılır ve hücreler tüp içine kültür ortamı 6 ilave edin. Yavaşça karıştırma tüp ters bir hemocytomete hücre sayısını saymak için hücre ihtiva eden bir ortamda 5 ul almakr.
- 300 x tüp santrifüj 5 dakika boyunca örn. Kültür ortamının 1 ml 10 6 hücre askıya alma ve 1 ml şırınga içinde, hücre içeren ortam yerleştirin.
- prizden mikroakışkan çip içine hücre içeren orta aşılamak ve çözüm beş kültür alanlarında aracılığıyla tüm dağıtır emin olun. 2 saat boyunca 37 ° C 'de% 5 CO2 altında bir inkübatör içinde çip inkübe edin.
4. Deneysel Kurulum
- kuluçka çip alın ve şeffaf indiyum kalay oksit (ITO) cam ısıtıcı üstüne yerleştirin.
NOT: İTO cam termal coupler geribildirim yoluyla 37 ± 0.5 ° C sıcaklığı korumak için bir oransal-integral-türev (PID) denetleyiciye bağlı İTO ısıtıcı ve çip arasındaki sıkı kenetlenmiş. - Hücre göçü veya sabit bir XY takibi için bir ters mikroskop motorlu bir XY üst yonga ısıtıcı montaj koyunROS üretiminin ölçülmesi için bir ters flüoresan mikroskop.
- (Kültür ortamı içinde çözülmüş) göreli konsantrasyonları 0 ve 1 arasında bir kimyasal çözeltilerin 5 ml ile iki şırınga dolgu farklı kimyasal konsantrasyonları oluşturabilir ve istenen akış hızlarında çip içine pompalamak için: CSS çipte, 0.3 ml 'lik bir akış hızında 1 saat / dk; İlk 20 dakika boyunca 20 ul / dk'lık bir akış oranında CEF çip ve bir 120 dakika (toplam süresi = 2 saat) 20 ul / saat akış hızında.
- CEF çipte, dijital tek lensli refleks yoluyla, kültür alanlarında 2 için her 15 dk içinde görüş belli bir alanda (FOVs) içinde (DSLR) fotoğraf makinesi, hücre göçü, mikroskobun XY fotoğraf çekmek tekrarlamak için programı izlemek için hr.
- ROS üretiminin ölçülmesi için, flüoresan bazlı göstergesi 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diasetat (2'-7'-DCFDA) kullanın.
- Moleküler biyoloji sınıf di 10 mM 2'-7'-DCFDA stok hazırlamametil sülfoksit (DMSO). Sadece serumu (DMEM 5 mcM) olmadan DMEM DCFDA seyreltin. Potansiyel deasetilaz arka plan sinyallerini artırmak ve hücrelerde sinyalleri azaltabilir.
- CSS çip veya CEF çip EF uyarıcının 2 saat sonra kesilme baskısı uyaran 1 saat sonra, 20 ul / dk'lık bir akış oranı için de çip halinde 2'-7'-DCFDA (DMEM 5 uM) pompa ilk 20 dakika ve 20 dakika boyunca 20 ul / saat arasında bir akış hızı. Yıkama için, 20 dakika boyunca 20 ul / saat akış hızı ile yonga içine DMEM pompa.
- floresan şiddetleri analiz etmek için, kültür alanlarında bazı FOVs arasında, bir şarj-kuplajlı aygıt (CCD) kamera ile Fotoğraflar al.
Kimyasal Konsantrasyonlarına, Kesme Zoru ve Elektrik Alanlar 5. Hesaplamalar
- CSS çip ve CEF çipi hem de, beş kültür alanlarında kimyasal konsantrasyonlarının hesaplamak. Örneğin, concentr ve H2O 2 enjekteations 0 ve iki giriş 200 uM, 0, 25, 100, 175 ve 200 uM oluşturulacak konsantrasyonları.
NOT: Tüm sıvılar bölünmüş akışı o düzgün ve eşit çatal etrafında üstlenerek, beş kültür alanlarında göreli konsantrasyonları sırasıyla, 0, 1/8, 1/2, 7/8, ve 1 bulunmaktadır. - CSS yongası kullanılarak kültür alanlarının her birinde kayma gerilmesi (τ) hesaplamak
Q, akışkan viskoziteli η debisi, 27, H kanalının yüksekliği, w kanalının genişliğidir.
NOT: Her girişine (S = 0.12 ml / dakika, her bir kültür alanı) Q = 0.3 ml / dk ile η = 0.0008 Pa s kültür ortamı, h = 1 mm, ve W = 1 ~ 4 mm için, kayma gerilmesi 0,0192 Pa 0,0048 Pa (4 mm genişliğinde bölge) (1 mm genişliğinde bölge) arasında değiştiği hesaplanmıştır. - İçindeCEF çip, σ kültür ortamı elektriksel iletkenlik, ben akışkan kanal boyunca akan elektrik akımı olan E = I / (σA eff) (Ohm yasası) kullanarak kültür alanlarının her birindeki EF gücünü hesaplamak ve A eff kanalın etkin bir kesit alanıdır.
Not: kullanma σ = 1.38 Ω -1 m-1 kültür ortamı ve A eff = 0.22 ila 2 mm (genişlik = 1 mm ve yükseklik = 0.22 mm), EF gücü E (mV / aa) = I (olarak hesaplanır A) 3.3 × 10 6 ×.- Şekil 2D'de gösterildiği gibi, dört (8 + 35 + 8) segmentler ile bir (5 + 35 + 5) kademeli bir beş C-kesitli devreler gibi eşdeğer devre tedavi.
NOT: Kirchhoff gerilim kanunu ve Ohm yasasına göre bu paralel devre analiz ederek, beş kültür boyunca akan akımlardırBen 1 alttan üste I 5 üzerinden gibi, ben (bölge 1) civarında 0.49 olarak hesaplanır, 0.25 I (bölge 2), 0.13 I (bölge 3), 0.08 I (bölge 4), ve 0.05 I (bölge 5), sırası ile, l), toplam akım (DC olduğu. 0.157 mA, 254 EF, 130, 67, 41 ve 26 mV / mm, uygulanan DC beş kültür alanlarında oluşturulur.
Not: mikroakışkan ağ basitleştirilmiş elektriksel analiz için tüm akışkan segmentleri uzunluklarına orantılı direnç direnç olarak kabul edilmektedir.
- Şekil 2D'de gösterildiği gibi, dört (8 + 35 + 8) segmentler ile bir (5 + 35 + 5) kademeli bir beş C-kesitli devreler gibi eşdeğer devre tedavi.
Q, akışkan viskoziteli η debisi, 27, H kanalının yüksekliği, w kanalının genişliğidir. 6. Veri Analizi
Not: Veri analizi ImageJ yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir.
- ROS üretimi analiz edin.
- ImageJ yazılımı çalıştırın. Bir floresan resim yüklemek için "Dosya" → Aç gidin analiz edilecek.
- im değiştirmek için "Resim" → "Tip" → "16-bit" gitgri ölçekli yaş.
- Bir hücreyi içine bir çokgen çizmek. Hücrenin ortalama floresan yoğunluğu ölçmek için → "Tedbir" "Analiz" gidin.
- Üç bağımsız deneyin en az 50 hücrelerinden yoğunluklarını toplamak ve ortalamanın standart hatası (SEM) ile, ortalama yoğunluğunu hesaplamak için 6.1.3 tekrarlayın.
- Her bir deney koşulu için 6.1.1-6.1.4 tekrarlayın.
- Hücre Göç analiz edin.
- ImageJ yazılımı çalıştırın. zaman = 0 alındığı bir resim yüklemek için "Dosya" → Aç gidin analiz edilecek.
- Bir hücreyi içine bir çokgen çizmek. (X 1, y 1) olarak hücrenin kütle merkezini ölçmek için → "Tedbir" "Analiz" gidin.
- 6.2.1- 6.2.2 = anda t almak başka bir görüntüden aynı hücrenin kütle merkezi (x 2, y 2) ölçmek için tekrarlayın.
- ve (mm / hr) göç oranını hesaplamakBu hücresi,
. - Üç bağımsız deneyden en az 50 hücrelerinden göç oranlarını toplamak ve ortalama standart hata (SEM) ile ortalama göç oranını hesaplamak için 6.2.1-6.2.4 tekrarlayın.
- 6.2.2 ve 6.2.3 itibaren, kosinüs İçeride ISTV melerin RWMAIWi'nin olarak bu hücrenin göç Yönetme hesaplama veya
, Θ (pozitiften negatife) uygulamalı EF vektörü arasındaki açı ve hücrenin (Şekil 2G) son pozisyonuna baştan vektörü olduğu. - Üç bağımsız deneyin en az 50 hücrelerinden geçiş Yönetme toplamak ve ortalamanın standart hatası (SEM) ile, ortalama geçiş Yönetme hesaplamak 6.2.6 tekrarlayın.
- SEM ile ortalama göç oranı ve her deneysel koşul için SEM ile ortalama göç Yönetme hesaplayın.
NOT: Bir yönetme+1 Tüm hücreleri katoda doğru göç olduğunu gösterir ve bir -1 değeri tüm hücreleri anot doğru göç olduğunu gösterir. rasgele hareket eden hücreler, bir grup yönetme 0 civarındadır.
- Hücre Hizalama analiz edin.
- ImageJ yazılımı çalıştırın. Bir resim yüklemek için "Dosya" → "Aç" git analiz edilecek.
- bir elips olarak hücre tedavisinde ve bir hücrenin uzun ekseni belirtmek için bir çizgi çizin. Hat ve yatay EF yönü arasındaki β açıyı ölçmek için → "Tedbir" "Analiz" gidin.
- Üç bağımsız deneyden en az 50 hücrelerinden p toplamak için 6.3.2 tekrarlayın ve hesaplamak ortalama kosinüs β ortalama standart hata (SEM) ile.
- Her bir deney koşulu için 6.3.1-6.3.3 tekrarlayın.
NOT: +1 p cos A tüm hücreleri uygulamalı EF paralel hizaya belirten ve 0 değeri tüm hücreleri perpendicularl hizaya olduğunu gösteriruygulamalı EF y.
. 
, Θ (pozitiften negatife) uygulamalı EF vektörü arasındaki açı ve hücrenin (Şekil 2G) son pozisyonuna baştan vektörü olduğu. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kimyasal kayma gerilme (CSS) Çip
CSS çip, iki çift taraflı bantlar ile birlikte bağlı üç PMMA levhalar, kalınlık 1 mm, her biri, kalınlığı 0.07 mm (Şekil 1A ve 1B) her biri yapılır. "Noel ağacı" yapısı 0 beş nispi konsantrasyonları üretir 1/8, beş kültür alanlarında 1/2, 7/8, ve 1. hacim akış hızını, akışkan viskozitesi ve akışkan kanalın boyutu ile ilgili bir büyüklüğü ile, bir üçgen, bir kayma gerilmesi degrade olarak kültür alanı tasarlayarak, alanların her birinde oluşturulur. Bu çip daha sonra kültür, akciğer kanseri CL1-5 hücreleri için bir Petri kabı, bir 0.07 mm kalınlığında, çift taraflı bant ile, bağlı olduğu ve ROS üretimi, farklı kimyasal konsantrasyonlar ve kayma gerilmeleri tepki gözlendi. akciğer kanseri hücrelerinde ROS üretimi oldukça lu ile ilgilidirng kanser metastazı ve geliştirme, ve bazı kimyasallar ve kayma gerilmesi ROS nesil 23 dahil olmak üzere ortaya konmuştur.
İlk olarak, ROS üretimine H2O 2, kimyasal bir uyarıcı etkisini incelemek için hücreler, sürekli 2 O 2 çözeltiler, 0, 25, 100, 175 ve 200 uM H akan kuluçkalanmıştır. Şekil 1C'de gösterildiği gibi, floresan yoğunluğu H2O 2 ROS üretimini stimüle gösteren, artan H2O 2 konsantrasyonu artmıştır. Sonraki, ROS üretimine kayma gerilmesi etkisini araştırmak için, hücreler 0.0192 ile 0.0048 Pa kayma gerilmesi degrade maruz bırakıldı Pa. Şekil 1D floresan yoğunluğu artmış kayma gerilmesi olarak arttığını göstermektedir (kayma gerilmeleri yüksek idi ve) sırasıyla Ön ve Arka alanlarda, en düşük, önermekyüksek kayma gerilmesi daha ROS üretimini uyardığını ing. Ayrıca, bu CSS çip α-tokoferol farklı konsantrasyonlarına yanıt olarak ROS üretimini incelemek için kullanılmıştır, E vitamini Hücreler bir biçimde bir antioksidan kesme stresi ile 0 α-tokoferol, 3.2, 12.5, 21.9 ile uyarıldı ve 25 ug / ml olmuştur. Α-tokoferol konsantrasyonu için, Şekil 1 E'deki daha düşük 21.9 ug / ml gösterildiği gibi, floresan yoğunluğu ROS üretimini azaltmada α-tokoferol etkisini gösteren, artan konsantrasyon olarak azalmıştır. konsantrasyonu, 25 ng / ml düzeyine Bununla birlikte, ortalama yoğunluğu da α-tokoferol, bu yüksek konsantrasyonlu düşük konsantrasyonlara göre çok daha ROT ortadan olmadığını düşündürmektedir artmıştır.
Kimyasal-elektrik Field (CEF) Çip
CEF çip 1 mm kalınlıkta bir PMMA ve 0.2 arasında yapılırBunun (Şekil 2A ve 2B) desenli akışkan kanallı 2 mm çift taraflı bant. Benzer şekilde, "Noel ağacı" yapısı 0 beş nispi konsantrasyonları oluşturur 1/8, beş kültür alanlarında 1/2, 7/8, ve 1. Buna ek olarak, bu beş paralel alanlar bir elektrik devresine benzer bir akışkan yolu oluşturmak için dikey olarak bağlıdır. bir kültür alanı içinde oluşturulan elektrik alan alanı üzerinden geçen sıvının kanalın kesit alanı, doğru akım (DC) iletkenliği ile ilgilidir. Ben uygulanan DC (Şekil 2C) olduğu Kirchhoff gerilim kanunu ve Ohm yasasına göre, beş kültür alanlarında akımlar, sırasıyla, 0.49 ben 0.25 ben 0.13 ben 0.08 ben ve 0.05 ben vardır. Bu çip, hücre göçü ve productio gözlemlemek için akciğer kanseri CL1-5 hücrelerin kültürlenmesi için bir Petri kabı, 0.22 mm kalınlığında, çift taraflı bant ile, bağlı olduğuFarklı kimyasal konsantrasyonlar ve elektrik alanlarına tepki olarak ROS n.
İlk olarak, bu çip honokiol farklı konsantrasyonlarda, EF farklı güçlü ve her ikisi de bir arada uygulamaya yanıt olarak ROS üretimini incelemek için kullanılmıştır. Honokiol, genus Manolya izole edilen bir küçük moleküllü polifenol, klinik öncesi çalışmalar 28 antianjiyojenik, anti-enflamatuar ve anti-tümör özelliklere sahip olduğu tespit edilmiştir. Şekil 2D'de gösterildiği gibi, ROS üretilen yaklaşık 67 mV / mm 'den düşük EF aynı, ancak bu değerin üstünde EF'lerini arttıkça artış oldu. Şekil 2E, elektrik alanları ve honokiol kombine işlemler altında ROS seviyesi, neredeyse kaldı göstermektedir aynı honokiol eksojen ROS üretimini inhibe (yani., EF uyarı ile ROS), özellikle daha yüksek EF altında olduğunu göstermektedir. tek veya eşlik eden kimyasal altında hücre göçü/ Elektrik uyaranlara da bu CEF çipi kullanılarak araştırılmıştır. Honokiol ilavesi olmadan, Şekil 2F'de görüldüğü gibi EF gücü arttıkça, geçiş hızı arttırılabilir. Farklı konsantrasyonlarda honokiol ilave edildikten sonra, göç oranı ROS üretiminin engellenmesi ile muhtemelen bu honokiol indirgenmiş hücre göçü öne genel olarak azalmıştır. Taşıma yönetme Şekil 2G'de gösterilmektedir. EF huzurunda sadece, akciğer kanseri hücreleri (negatif değerler ile) anot doğru belirgin yönlü göç gösterdi. Farklı konsantrasyonlarda honokiol ilave edildikten sonra, her EF-uyarılan alanlar için taşıma yönetme hafif bir azalma oldu.
Şekil 1: Kesme Akciğer Kanseri Hücreleri Gerilmelerinin Kimyasalların Etkileri ve Eğitim için Kullanılan Kimyevi-makaslama Stres (CSS) Çip 2.3
(A) PMMA yüzeyler üç katmanları CSS çip oluşturmak için iki çift taraflı bantlar aracılığıyla birbirine bağlıdırlar. (B) entegre CSS çip. (C) en: Floresan ve 1-5 sonrasında, hücreler CL parlak-alanlı görüntüler H2O 2 farklı konsantrasyonları ile tedavi edilen. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Alt: SEM ortalama floresan yoğunluğu, H2O 2 farklı konsantrasyonlarda çizilir. (D) Üst: 1-5 hücreleri farklı kayma gerilmeleri altında CL Floresan görüntüler. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Alt: SEM ile ortalama floresan yoğunluğu farklı kayma gerilmeleri de çizilen. (E) en: 1-5 hücreleri, α-tokoferol farklı konsantrasyonları ile kesme stresi ile uyarıldıktan sonra CL flüoresan ve parlak alan ve görüntüler. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Alt: SEM ortalama floresan yoğunluğu α-tokoferol farklı konsantrasyonda çizilir. Veriler W burada sunulanBaşlangıçta referans 23'te yayınlanan. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Kimyasalların Etkileri ve Akciğer Kanseri Hücreleri 22 Elektrik Alanlar Eğitim için Kullanılan Kimyevi-elektrik alan (CEF) Çip.
PMMA (A) Tek kat CEF çip oluşturmak için çift taraflı bant aracılığıyla bir kültür kabı üzerine bağlıdır. (B) CSS yonga akışkan desen. (C) mikroakışkan çip eşdeğer elektrik devresi. (D) Sol: 1-5 hücreleri sonra CL Floresan ve parlak alan görüntüleri EF farklı güçlü ile tedavi edilir. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Sağ: floresan ortalamaSEM ile yoğunluğu EF farklı kuvvetlerde çizilen. (E) Sol: Floresan ve 1-5 hücre sonra CL parlak alan görüntüleri kombine honokiol ve EF ile tedavi edilir. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Sağ: SEM kombine honokiol ve EF de çizilen ile floresan yoğunluğu ortalama. (F), sadece (kontrol olarak işaretli) EF ve birleştirilen honokiol ve EFS ile tedavi edildikten sonra CL1-5 hücre migrasyonu (honokiol olarak işaretlenir). (G) (honokiol olarak işaretli) Sadece (kontrol olarak işaretli) EF ve birleştirilen honokiol ve EFS ile tedavi edildikten sonra CL1-5 hücre göçü yönetme. Burada sunulan veriler, başlangıçta referans 22'de yayınlandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PMMA esaslı cips daha karmaşık yumuşak litografi gerektiren PDMS tabanlı çipleri ile karşılaştırıldığında daha ucuz ve daha kolay yöntemlerdir lazer ablasyon ve yazma kullanılarak imal edilir. mikroakışkan çip tasarladıktan sonra, imalat ve montaj sadece 5 dakika içinde yapılabilir. dikkat deneyi gerçekleştirirken ödenmesi gerektiğini bazı kritik adımlar vardır. İlk "birleştirme" bir konudur. Adaptör çipin en üst tabakaya düzgün yapıştırılmış olmalıdır. Çok fazla uygulandığı takdirde tutkal akışkan kanallarına sızarak olabilir ve çok az yapıştırıcı kullanıldığında sıvı çip dışarı sızıntı olabilir. Ayrıca, PMMA yüzeyler ve çift taraflı bantlar montaj, herhangi bir sıvı sızıntısını önlemek için sıkıca tüm çip basın baskı uygulamak önemlidir. İkinci "balon" bir konudur. kabarcıklarını çıkarmak için, 1 x PBS, sürekli 20 ul / dk'lık bir akış oranında 1 ya da 2 dakika boyunca akışkan kanal içine akıtılır ve daha sonra çip p37 ° C'de gece boyunca% 5 CO2 altında bir inkübatör içinde görüşlü. akışkan kanal içinde kalan kabarcıklar ise, akış homojen olmayan bir kimyasal konsantrasyon ve EF dağıtım neden muntazam olmayan olacaktır. Üçüncü "hücre yükleme" bir konudur. Kültür alanlara yüklü hücrelerin sayısı iyi kontrol edilmelidir. hücre sayısı çok düşükse, birçok deneysel çalışma istatistiksel amaçlı yeterli veri toplamak için yapılmalıdır. Hücre sayısı çok yüksek ise, tek tek hücrelerin ayırt ve taşıma ölçmek zor olacaktır.
CSS çipte, üçgen kültür alanı ile birlikte "Noel ağacı" yapısı her bir kayma gerilmesi değişim ölçüsüne sahip, beş alanda farklı kimyasal konsantrasyonlarını oluşturur. Akışkan kayma gerilmeleri eki, morfolojisi, göç ve hücrelerin aktivitesini etkilediği bilinmektedir bulundu. Pa hücre eki arayüz olabilir gibi düşük 0,25-0,6 olarak kesme gerilmeleri, Gerilmeler (0.5 -10 Pa) ve hatta daha yüksek değerler yapışık hücrelere 29 kaldırmak bildirildi. Akış 30 ve hatta daha düşük değerlere (0.1-1 Pa) yönünde 0.8 ila 1.5 Pa neden olduğu hücre hizalama kadar laminer kayma gerilmeleri hücre morfolojisi ve geçirgenliği 29 etkilediği bilinir. Ayrıca, 2-120 Pa kesme baskısına tabi düz kas hücrelerinin hücre sayısı 31 bir düşüş yaşadı. Lu ve ark. hücre yapışması 27 kantitatif analiz için mikroakışkan kesme cihazlarının tasarım ve inşaat bildirdi. akışkan kanal içinde kayma gerilmesi kanalının boyutlarını değiştirerek modifiye edildi. Chin et al. kap 32 kan akış profilini taklit edecek şekilde mikro-kanal kültür ortamının akış hızının kontrol edilmesi için bir hemodinamik Lab-on-a-chip sistemi tarif. akışkan kanal içinde kesilme baskısı ortamın akış oranının değiştirilmesi ile modifiye edilmiştir. içindese iki cihazın, herhangi bir değerler kayma gerilmesi elde edilebilecek olsa da, sadece tek değer bir seferde bir kültür alanı içinde kullanılabilir. Buna karşılık, bu CSS çip, bir üçgen alanında bir kesme stresi gradyanı tarama amacı için özellikle deney verim arttırma avantajına da sahiptir.
CEF yongasında "Noel ağacı" yapısı kültür alanları dikey bir elektrik devresine benzer bir akışkan yolu oluşturmak için bağlı bulunmaktadır. Bir doğru akım uygulanmış olarak, beş EF güçlü her biri özel bir kimyasal konsantrasyon arasında bir akış oranı ile birlikte kültür alanları içinde oluşturulur. Geleneksel olarak, electrotactic deneyler kesin EF, orta buharlaştırma, büyük hücre / reaktif tüketimi ve artan Joule ısıtma sorunları meydana gelebilir Petri kapları üzerinde gerçekleştirilmiştir. Kapalı, minyatür mikroakışkan cihazlar verimli bir şekilde bu dezavantajların üstesinden. Örneğin, electrotaxis o incelemek içinf insan kan hafıza T hücreleri, Lin ve diğ. iki modifiye pipet uçları orta rezervuar olarak görev iki özdeş, yan-yana mikro kanallar, ve EF uygulaması 15 için iki platin elektrot içeren plastik bir mikroakışkan cihaz bildirdi. Verimi artırmak için, PMMA esaslı electrotactic cips tek bir cihazda 12,33 birden EF güçlü sağlamak için imal edilmiştir. Ayrıca, kontrol kimyasal ve elektriksel uyaranları üretme kapasitesine sahip mikroakışkan cihazları aynı anda yüksek ilgi vardır. Li ve diğ. T hücrelerinin 14 kemotaktik veya electrotactic göç araştırmak için tek veya eşlik eden kimyasal degradeler / EF'lerini oluşturmak için PDMS tabanlı mikroakışkan cihaz fabrikasyon. Kao ve diğerleri. EF'lerini 12 kullanarak, akciğer kanser hücrelerinin kemotaksisini modüle benzer bir mikroakışkan cihaz kullanılabilir. Bu iki cihaz olarak, Y-şeklinde bir yapı tek uygulanan EF istikrarlı bir konsantrasyon gradyanı oluşturmak için uygulanmıştır. Hou vd. Akciğer kanseri hücrelerinin 21 kimyasallar ve EF eşzamanlı etkisini araştırmak için bir çok kanallı-çift elektrik alan yonga bildirdi. Bu cihaz bir deneyde, elektrik / kimyasal uyaranlara (2 elektrik x 4 kimyasal) 8 kombinasyonları sağlamak mümkün oldu. verim artmasına rağmen, bu çipin kapasitesi (1) sadece tek bir EF gücü (artı bir kontrol olarak biri sıfır) ve (2) dört şırınga pompaları dört bağımsız kanal içine kimyasal maddelerin pompalanması için gerekli sınırlıydı. Buna karşılık, bu CEF çip elektrot tek bir grubu ve 2 şırınga pompaları ile birlikte beş kimyasal konsantrasyonlar beş EF güçlü üretme avantajına sahiptir.
Bu yongalar imal edilmesi kolay olsa da, bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, sadece beş "özel" konsantrasyonları ve beş "özel" EF güçlü oluşturulabilir. İkinci olarak, akışkan kanalının genişliği odaklama bağlı en az 1 mm olamazCO2 lazer ışını. Bununla birlikte, tam da giriş ve akışkan kanalından geçen elektrik akımı kimyasal konsantrasyonunun kontrol edilmesi suretiyle, herhangi bir konsantrasyon ve EF güçlü kültür alanda elde edilebilir. Sonuç olarak, bu CSS ve CEF cips kontrol tek veya eşlik eden kimyasal / elektrik / kayma gerilmesi uyaranlara hücreleri sağlama yeteneğine sahiptirler. Tek bir CSS çip, bir kesme stresi gradyanı ile kombinasyon halinde, beş farklı kimyasal konsantrasyonu oluşturulabilir. Buna ek olarak, tek bir CEF chip beş EF güçlü birlikte beş farklı kimyasal konsantrasyonu oluşturulabilir. "Noel ağacı" yapısının dalları artırarak, bu çiplerin verim daha da artırılabilir. Bu çipler kimyasal / elektrik / kayma gerilmesi uyaranlara altında cep davranış çalışmaları için kolay, zaman tasarrufu, güvenilir ve yüksek verimli bir platform olarak gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10 cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImageJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
References
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
- Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- Adler, J.
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107 (2014).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
- Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
- Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
- Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
- Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
- Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117 (2012).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007 (2014).
- Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15 (2016).
- Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108 (2013).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
- Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
- Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
- Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
- Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
- Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
- Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
