Abstract
Los dispositivos microfluídicos son capaces de crear un micro-entorno celular precisa y controlable de pH, temperatura, concentración de sal, y otros estímulos físicos o químicos. Se han utilizado comúnmente para estudios de células in vitro, proporcionando in vivo como entorno. Especialmente, la forma de respuesta de las células a los gradientes químicos, campos eléctricos, y esfuerzos de corte ha dibujado muchos intereses ya que estos fenómenos son importantes en la comprensión de las propiedades y funciones celulares. Estos chips de microfluidos pueden estar hechos de sustratos de vidrio, obleas de silicio, polímeros de polidimetilsiloxano (PDMS), polimetilmetacrilato (PMMA), sustratos o sustratos polietilentereftalato (PET). Fuera de estos materiales, los sustratos de PMMA son baratos y se pueden procesar fácilmente usando la ablación por láser y la escritura. Aunque algunos dispositivos microfluídicos se han diseñado y fabricado para generar múltiples, coexistiendo estímulos químicos y eléctricos, se consideró que ninguno de elloslo suficientemente eficiente en la reducción de las repeticiones experimentales, en particular con fines de detección. En este artículo, describimos nuestro diseño y fabricación de dos chips de microfluidos basada en PMMA para la investigación de las respuestas celulares, en la producción de especies reactivas de oxígeno y la migración, bajo estímulos de estrés individuales o coexistentes químicos / eléctricos / pernos de seguridad. El primer chip genera cinco concentraciones relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8, y 1 en las regiones de cultivo, junto con un gradiente de tensión de cizalladura producida en el interior de cada uno de estas áreas. El segundo chip genera la misma concentración relativa, pero con cinco intensidades de campo eléctrico creado diferentes dentro de cada área de la cultura. Estos dispositivos no sólo proporcionan células con una, controlable microambiente precisa, pero también aumentan en gran medida el rendimiento experimental.
Introduction
En las células in vivo están rodeados por una variedad de biomoléculas, incluyendo la matriz extracelular (ECM), hidratos de carbono, lípidos, y otras células. Ellos funcionalizar respondiendo a los estímulos micro-ambientales tales como interacciones con ECM y las respuestas a los gradientes químicos de diferentes factores de crecimiento. Tradicionalmente, los estudios de células in vitro se llevan a cabo en placas de cultivo celular en el que el consumo de las células y los reactivos es grande y las células crecen en una estática (no circulante) medio ambiente. Recientemente, los dispositivos de micro-fabricada integrados con componentes fluídicos han proporcionado una plataforma alternativa para los estudios de células de una manera más controlable. Tales dispositivos son capaces de crear un micro-entorno precisa de los estímulos químicos y físicos y reducir al mínimo el consumo de las células y los reactivos. Estos chips de microfluidos pueden estar hechos de sustratos de vidrio, obleas de silicio, polidimetilsiloxano polímeros (PDMS), polimetilmetacrilato (PMMA) sustratos, o polyethylenetereftalato (PET) Sustratos 1-3. dispositivos basados en PDMS son transparentes, biocompatible, y permeable a los gases, haciéndolos adecuados para el cultivo celular a largo plazo y estudios. PMMA y PET sustratos son baratos y fáciles de ser procesados utilizando ablación por láser y la escritura.
Los dispositivos microfluídicos deben proporcionar células con un micro-entorno estable y controlable donde las células están sujetos a diferentes estímulos químicos y físicos. Por ejemplo, chips de microfluidos se utilizan para estudiar la quimiotaxis de las células. En lugar de los métodos tradicionales que emplean cámara de Boyden y capilar 4,5 estos dispositivos fluídicos miniaturizados pueden generar gradientes químicos precisos para el estudio de los comportamientos células '1,6,7. Otro ejemplo es el estudio de la migración direccional de células bajo campos eléctricos (EFS), fenómeno llamado electrotaxis. Se informó de comportamientos Electrotactic de células que estar relacionado con la regeneración del nervio 8, el desarrollo embrionario 9,y la cicatrización de la herida 10,11. Además, muchos estudios se han realizado para investigar la electrotaxis de diversos tipos de células incluyendo células de cáncer de 12,13, linfocitos 14,15, células de leucemia 11, y las células 16 madre. Convencionalmente, placas de Petri y cubiertas de vidrio se utilizan para construir cámaras electrotactic para la generación de los EF 17. Tales configuraciones simples plantean problemas de evaporación media y EFS imprecisas, pero pueden ser superados por los dispositivos de microfluidos de canales de fluidos cerrado, bien definidos 12,18,19.
Para estudiar sistemáticamente respuestas celulares en virtud de estímulos químicos y eléctricos precisos y controlables, sería de gran utilidad para el desarrollo de dispositivos de microfluidos capaces de proporcionar células con estímulos múltiples al mismo tiempo. Por ejemplo, Li et al. informó de un dispositivo de microfluidos basada en PDMS para la creación de una o coexistiendo gradientes químicos y los EF 20. Kao et al. devfugado un chip de microfluidos similar a modular la quimiotaxis de las células de cáncer de pulmón por EFS 6. Por otra parte, para aumentar el rendimiento, Hou et al. diseñado y fabricado un chip de doble-eléctrico-campo multicanal basados en PMMA para proporcionar células con 8 diferentes estímulos combinados, (2 puntos fuertes concentraciones de EF x 4 químicos) con 21. Para aumentar aún más el largo de y añadir el estímulo tensión de cizallamiento, hemos desarrollado dos dispositivos de microfluidos a base de PMMA para el estudio de las respuestas celulares en virtud de estímulos de estrés químicas simple o coexistiendo / eléctricos / cizallamiento.
Informado por Lo et al. 22,23, estos dispositivos contienen cinco canales de cultivo de células independientes que están sujetos a una circulación continua de fluidos, que imitan el sistema circulatorio in vivo. En el primer chip (chip química cizalla estrés o el chip CSS), cinco concentraciones relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8, y 1 se generan en las regiones de cultivo, y un gradiente de tensión de cizallamiento es produced dentro de cada una de las cinco áreas de cultivo. En el segundo chip (chip-químico de campo eléctrico o el chip CEF), mediante el uso de un único conjunto de electrodos y 2 bombas de jeringa, cinco puntos fuertes EF se generan, además de cinco concentraciones químicas diferentes dentro de estas áreas de cultivo. cálculos y simulaciones numéricas se realizan para un mejor diseño y operan estos chips, y las células de cáncer de pulmón cultivadas dentro de estos dispositivos están sujetos a los estímulos individuales o coexistentes para la observación de las respuestas con respecto a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la tasa de migración, y la dirección de migración. Estos chips se demostraron ser, de alto rendimiento y fiables en la investigación de cómo las células responden a diversos estímulos ambientales micro-ahorro de tiempo.
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Protocol
1. Chip de diseño y fabricación
- Dibujar patrones para ser extirpadas en sustratos de PMMA y cintas de doble cara utilizando software comercial 24.
- Para estudiar los efectos de las concentraciones químicas y esfuerzos de corte, dibujar un patrón de "árbol de Navidad" con una anchura variable en su extremo en cada una de las cinco áreas de cultivo (Figura 1A y 1B).
- Para estudiar los efectos de las concentraciones químicas y los campos eléctricos, dibujar un patrón de "árbol de Navidad", con dos canales de fluidos más para puentes de sal (Figura 2A y 2B).
- Escriba un patrón individual en una hoja de PMMA o una cinta de doble cara cargando el archivo correspondiente a la punta de trazar láser de CO2.
- Encender la punta de trazar láser, y comprobar su conexión al ordenador. Abra el patrón que se realiza la ablación usando el software comercial.
- Coloque una hoja de PMMA o una cinta de doble cara on superior de la etapa de la punta de trazar. Ajuste el enfoque del láser de CO 2 si es necesario con la barra de calibración y lo visible láser de He-Ne.
- Cargar el patrón en la punta de trazar para la ablación en la hoja de PMMA o la cinta.
- Recoge la lámina o cinta con dibujos, eliminar las piezas no deseados, y limpie la superficie con inyección de nitrógeno.
NOTA: El espesor de la hoja de PMMA es 1 mm, y la de la cinta de doble cara es 0,07 mm o 0,22 mm.
2. Asamblea de la viruta
- Con pegamento, coloque adaptadores en acrílico (largo x ancho x altura = 10 mm x 10 mm x 5 mm, con roscas de tornillo en el centro) a la en la capa superior del chip mediante la alineación de las roscas de los tornillos y los agujeros en la parte superior -la mayoría capa. Estos adaptadores sirven como entradas / salidas y conectores puente salino medio.
- Montar el chip de microfluidos dentro de una campana de flujo laminar.
- Montar el chip de microfluidos estrés químico cizalla (chip CSS).
- UNttach 3 hojas de hojas de PMMA trazadas utilizando 2 piezas de trazada cinta de doble cara. (Figura 1A y 1B).
- Añadir una pieza más del 0,07 mm de espesor cinta de doble cara a la parte inferior del chip y adjuntar el chip a un diámetro del plato 10 cm Petri.
- Poner el chip de montaje en la cámara de vacío durante toda la noche.
- Para montar el chip campo químico-eléctrica (chip CEF), adjuntar la hoja de PMMA en una cinta de doble cara de espesor = 0,22 mm (Figura 2A y 2B).
- Adjuntar la hoja de PMMA descrito y la cinta de doble cara en una placa de 10 cm de diámetro Petri utilizando este mismo trozo de cinta.
- Deje el chip montado dentro de la campana y exponerlo a los rayos UV durante 30 minutos para la esterilización.
- Conectar las entradas a dos jeringas de 3 ml a través de tubos de plástico y tuercas apretadas a mano. Conectar la salida a un tubo de residuos a través de un tubo de plástico y una tuerca con los dedos.
NOTA: Autoclavetodos los tubos y tuercas a 121 ° C durante 15 min antes de su uso. - Presione lentamente el émbolo de la jeringa para primos los canales de fluidos con PBS. Empuje jeringas de ida y vuelta para eliminar las burbujas.
- Poner las patatas fritas en el interior de una incubadora durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2.
NOTA: Estos dos pasos se dirigen a lavar el chip y eliminar las burbujas que quedan dentro del chip. - Tome el chip de la incubadora.
- Preparar puentes de sal de agar para generar campos eléctricos en el chip CEF.
- Disolver 3% de agarosa de bajo punto de fusión en tampón 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando un horno de microondas.
- Inyectar la solución de fase de agarosa en el canal de puente salino e insertar los electrodos antes de solución solidifica.
- Colocar electrodos / plata-cloruro de plata en las tuercas tubulares.
- Conectar las jeringas a las bombas de jeringa, y de forma continua el flujo del medio de cultivo (Modificado de Dulbecco Eagler17; s medio, DMEM) en el canal fluídico durante 10 min a un caudal de 20 l / min para reemplazar PBS.
3. Preparación de células y configuración experimental
NOTA: Pre-caliente 1x PBS, medio de cultivo (DMEM más FBS), y tripsina en un baño de agua C 37 ° antes de su uso.
- Plate 2 x 10 con cáncer de pulmón de células 5 CL1-5 25,26 en un plato de 10 cm Petri suministrado con DMEM más suero bovino fetal al 10% (FBS). Se incuban las células dentro de un incubador bajo 5% de CO2 a 37 ° C hasta 90% de confluencia.
- Aspirar el medio y se lavan las células una vez con pre-calentado PBS 1x. Añadir 2 ml de tampón de tripsina 0,05% a las células y esperar a 2-3 min a 37 ° C para separar las células.
- Transferir las células a un tubo de centrifugación estéril de 15 ml y añadir 6 ml de medio de cultivo en el tubo. Invertir suavemente el tubo para mezclar y llevar a cabo 5 l de medio que contiene células para contar el número de células en un hemocytometer.
- Se centrifuga el tubo a 300 x g durante 5 min. Suspender 10 6 células en 1 ml de medio de cultivo y colocar el medio que contiene células en una jeringa de 1 ml.
- Infundir el medio que contiene células en el chip de microfluidos de la toma y asegúrese de que la solución distribuye a lo largo de las cinco áreas de cultivo. Incubar el chip dentro de un incubador bajo 5% de CO2 a 37 ° C durante 2 hr.
4. Configuración Experimental
- Tome el chip de la incubadora y colocarlo en la parte superior de un calentador de vidrio de óxido de indio y estaño transparente (ITO).
NOTA: El vidrio ITO está conectado a un controlador proporcional-integral-derivativo (PID) para mantener la temperatura a 37 ± 0,5 ° C a través de la retroalimentación de un acoplador térmico sujeta firmemente entre el calentador de ITO y el chip. - Coloque el conjunto de chips-calentador en la parte superior de una etapa XY motorizado de un microscopio invertido para el seguimiento de la migración de células o una etapa fija XY deun microscopio de fluorescencia invertida para la medición de la producción de ROS.
- Para generar diferentes concentraciones químicas, llenar dos jeringas con 5 ml de soluciones químicas de concentraciones relativas 0 y 1 (disuelto en medio de cultivo) y la bomba de ellos en el chip a velocidades de flujo deseadas: en el chip CSS, a un caudal de 0,3 ml / min durante 1 hora; en el chip CEF, con un caudal de 20 l / min para el primero 20 min y un caudal de 20 l / hr para otro 120 min (tiempo total = 2 h).
- En el chip CEF, para el seguimiento de la migración celular, programa de la etapa de XY del microscopio para repetir tomar fotos, a través de un solo lente reflex digital (DSLR), de ciertos campos de visión (FOV) dentro de las áreas de cultivo cada 15 minutos durante 2 hora
- Para la medición de la producción de ROS, utilizar el indicador basado en la fluorescencia de 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetato de (2 '-7'-DCFDA).
- Preparar la acción de 2'-7'-DCFDA a 10 mM en di calidad para biología molecularsulfóxido de metilo (DMSO). Diluir DCFDA en DMEM sólo sin suero (5 mM en DMEM). El deacetilasa potencial podría aumentar las señales de fondo y disminuir las señales en las células.
- Después de 1 hr de estímulo tensión de corte en el chip CSS o después de 2 h de EF estímulo en el chip CEF, la bomba de 2'-7'-DCFDA (5 mM en DMEM) en el chip a un caudal de 20 l / min para la primera 20 min y un caudal de 20 l / hr durante otros 20 min. Para el lavado, la bomba de DMEM en el chip a un caudal de 20 l / h durante 20 min.
- Tomar fotos, a través de una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD), de ciertos FOV dentro de las áreas de cultivo para el análisis de las intensidades fluorescentes.
5. Los cálculos de las concentraciones químicas, esfuerzos de corte, y los campos eléctricos
- En tanto el chip y el chip CSS CEF, el cálculo de las concentraciones químicas en las cinco áreas de cultivo. Por ejemplo, mediante la inyección de H 2 O 2 de concentrciones 0 y 200 micras de las dos entradas, las concentraciones de 0, 25, se generan 100, 175 y 200 micras.
NOTA: Si se asume que todos los líquidos se separaron de flujo suave y uniformemente sobre el tenedor, las concentraciones relativas de las cinco áreas de cultivo son 0, 1/8, 1/2, 7/8, y 1, respectivamente. - En el chip de CSS, calcular la tensión de corte (τ) dentro de cada una de las áreas de cultivo utilizando
27, donde Q es el caudal volumétrico, η es la viscosidad de fluidos, h es la altura del canal, y W es la anchura del canal.
NOTA: Al establecer Q = 0,3 ml / min en cada entrada (Q = 0,12 ml / min en cada área de cultivo), η = 0,0008 Pa · s para el medio de cultivo, h = 1 mm, y w = 1 ~ 4 mm, la tensión de cizallamiento se calcula en un rango de 0,0048 Pa (4 mm región de ancho) a 0,0192 Pa (1 mm región de ancho). - Enel chip CEF, calcular la fuerza de FC dentro de cada una de las áreas de cultivo utilizando E = E / (s A ef) (ley de Ohm), donde I es la corriente eléctrica que fluye a través del canal de fluido, σ es la conductividad eléctrica del medio de cultivo, y A eff es el área de sección transversal efectiva del canal.
NOTA: El uso σ = 1,38 Ω -1 m -1 para medio de cultivo y A eff = 0,22 mm 2 (anchura = 1 mm y la altura = 0,22 mm), la resistencia EF se calcula para ser E (mV / mm) = I ( A) × 3,3 × 10 6.- Como se muestra en la Figura 2D, tratar el circuito equivalente cinco circuitos de sección C con cuatro (8 + 35 + 8) segmentos y uno (5 + 35 + 5) segmento.
NOTA: Al analizar este circuito paralelo de acuerdo con la ley de voltaje de Kirchhoff y la ley de Ohm, las corrientes que fluyen a través de la cultura son cincocomo, I 1 a I 5 de abajo hacia arriba, se calculan en alrededor de 0,49 I (zona 1), 0,25 I (zona 2), 0,13 I (zona 3), 0,08 I (zona 4), y 0,05 I (área de 5), respectivamente, donde I es el total de corriente continua (cC). Con una corriente continua aplicada de 0.157 mA, los EF de 254, 130, 67, 41, y 26 mV / mm se generan dentro de las cinco áreas de cultivo.
NOTA: Para un análisis eléctrico simplificado de la red de microfluidos, todos los segmentos de fluidos se consideran como resistencias con resistencia proporcional a su longitud.
- Como se muestra en la Figura 2D, tratar el circuito equivalente cinco circuitos de sección C con cuatro (8 + 35 + 8) segmentos y uno (5 + 35 + 5) segmento.
27, donde Q es el caudal volumétrico, η es la viscosidad de fluidos, h es la altura del canal, y W es la anchura del canal. Análisis 6. Datos
Nota: El análisis de datos se realizó utilizando el software ImageJ.
- Analizar la producción de ROS.
- Ejecutar el software ImageJ. Ir a "Archivo" → Abrir para cargar una imagen fluorescente para ser analizada.
- Ir a "Imagen" → "Tipo" → "16-bit" para cambiar el imedad a una escala de grises.
- Dibujar un polígono para encerrar una célula. Ir a "Analizar" → "medida" para medir la intensidad media de fluorescencia de la célula.
- Repita 6.1.3 para recoger intensidades de al menos 50 células de tres experimentos independientes, y calcular la intensidad media con el error estándar de la media (SEM).
- Repita 6.1.1-6.1.4 para cada condición experimental.
- Analizar la migración celular.
- Ejecutar el software ImageJ. Ir a "Archivo" → Abrir para cargar una imagen tomada en el tiempo = 0 a analizar.
- Dibujar un polígono para encerrar una célula. Ir a "Analizar" → "medida" para medir el centro de masa de la célula como (x 1, y 1).
- Repetir 6.2.1- 6.2.2 para medir el centro de masa de la misma célula que (x 2, y 2) a partir de otra imagen tomar en el tiempo = t.
- Calcular la tasa de migración (en m / h) deesta célula como
. - Repita 6.2.1-6.2.4 para recoger las tasas de migración a partir de al menos 50 células de tres experimentos independientes, y calcular la tasa media de migración con el error estándar de la media (SEM).
- A partir de 6.2.2 y 6.2.3, se calcula la direccionalidad de migración de esta célula como θ o coseno
, Donde θ es el ángulo entre el vector de la EF aplicada (de positivo a negativo) y el vector desde el inicio a la posición final de la célula (Figura 2G). - Repita 6.2.6 para recoger directedness la migración a partir de al menos 50 células de tres experimentos independientes, y calcular la migración direccionalidad media con el error estándar de la media (SEM).
- Calcular la tasa de migración media con SEM y la direccionalidad de migración media con SEM para cada condición experimental.
NOTA: Una direccionalidadde 1 indica que todas las células migran hacia el cátodo, y un valor de -1 indica que todas las células migran hacia el ánodo. La direccionalidad de un grupo de células que se mueven al azar es cercano a 0.
- Analizar Alineación de la celda.
- Ejecutar el software ImageJ. Ir a "Archivo" → "Abrir" para cargar una imagen para ser analizada.
- El tratamiento de la célula como una elipse y trazar una línea para indicar el eje mayor de una célula. Ir a "Analizar" → "medida" para medir el ángulo β entre la línea y la dirección EF horizontal.
- Repita 6.3.2 para recoger β de por lo menos 50 células de tres experimentos independientes, y calcular media coseno β con el error estándar de la media (SEM).
- Repita 6.3.1-6.3.3 para cada condición experimental.
NOTA: A cos β de 1 indica que todas las células se alinean en paralelo a la EF aplicada, y un valor de 0 indica que todas las células se alinean perpendicularlY a la EF aplicada.
. 
, Donde θ es el ángulo entre el vector de la EF aplicada (de positivo a negativo) y el vector desde el inicio a la posición final de la célula (Figura 2G). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El estrés químico-cizalla (CSS) de la viruta
El chip CSS está hecho de tres hojas de PMMA, cada una de 1 mm de espesor, unidos entre sí por medio de dos cintas de doble cara, cada una de espesor de 0,07 mm (Figura 1A y 1B). La estructura de "árbol de Navidad" genera cinco concentraciones relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8, y 1 en las cinco áreas de cultivo. Mediante el diseño de la zona de cultivo como un triángulo, un gradiente de tensión de cizallamiento, con una magnitud relacionada con la tasa de volumen de flujo, la viscosidad de fluidos, y la dimensión del canal fluídico, se crea dentro de cada una de las áreas. a continuación, se adjunta Este chip, a través de otro 0,07 mm de espesor de cinta de doble cara, a una placa de Petri para cultivar células CL1-5 de cáncer de pulmón y se observó la producción de ROS en respuesta a diferentes concentraciones químicas y tensiones de cizallamiento. La producción de ROS en células de cáncer de pulmón está muy relacionada con lula metástasis del cáncer ng y el desarrollo, y ciertos productos químicos y el esfuerzo cortante se demostraron estar involucrados en la generación de ROS 23.
En primer lugar, para estudiar el efecto de H 2 O 2, un estímulo químico, en la producción de ROS, las células se incubaron con un chorro continuo de H 2 O 2 soluciones a los 0, 25, 100, 175 y 200 micras. Como se muestra en la Figura 1C, la intensidad de fluorescencia aumentó a medida que la concentración de H 2 O 2 aumentado, lo que indica que H 2 O 2 estimuló la producción de ROS. A continuación, para investigar el efecto de la tensión de cizallamiento en la producción de ROS, las células fueron expuestas a un gradiente de tensión de cizallamiento de 0,0048 Pa a 0,0192 Pa. La Figura 1D muestra que la intensidad de fluorescencia aumentó a medida que la tensión de cizallamiento aumentado (los esfuerzos de corte fueron los más altos y la más baja en las zonas frontal y posterior, respectivamente), sugierening que el aumento de la tensión de cizallamiento induce una mayor producción de ROS. Además, se utilizó este chip CSS para estudiar la producción de ROS en respuesta a diferentes concentraciones de α-tocoferol, un antioxidante de una forma de vitamina E. Las células se estimularon por la tensión de cizallamiento más α-tocoferol de 0, 3,2, 12,5, 21,9 y 25 mg / ml. Como se muestra en la figura 1E, para concentraciones de α-tocoferol inferior a 21,9 g / ml, la intensidad de fluorescencia disminuyó a medida que el aumento de la concentración, lo que indica el efecto de α-tocoferol en la reducción de la producción de ROS. Sin embargo, como la concentración aumentó a 25 g / ml, la intensidad media también aumentó, lo que sugiere que esta alta concentración de α-tocoferol no eliminó mucho ROS en comparación con las concentraciones más bajas.
El campo de la química-eléctrica (CEF) de la viruta
El chip CEF está hecho de un PMMA 1 mm de espesor y un 0,22-mm cinta de doble cara con canales fluídicos estampadas en el mismo (figura 2A y 2B). Del mismo modo, la estructura de "árbol de Navidad" crea cinco concentraciones relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8, y 1 en las cinco áreas de cultivo. Además, estas cinco áreas paralelas están conectados perpendicularmente para formar una trayectoria de fluido análogo a un circuito eléctrico. El campo eléctrico generado dentro de un área de cultivo está relacionada con la conductividad del fluido, el área de sección transversal del canal, y la corriente continua (DC) que pasa a través de la zona. De acuerdo con la ley de voltaje de Kirchhoff y la ley de Ohm, las corrientes en las cinco áreas de cultivo son 0,49 I, 0,25 I, 0,13 I, 0,08 I, y 0,05 I, respectivamente, donde I es la corriente continua aplicada (Figura 2C). Este chip está unido, a través de la 0,22 mm de espesor de cinta de doble cara, a una placa de Petri para el cultivo de células de cáncer de pulmón CL1-5 para observar la migración celular y la production de ROS en respuesta a diferentes concentraciones químicas y campos eléctricos.
En primer lugar, este chip se utilizó para estudiar la producción de ROS en respuesta a diferentes concentraciones de honokiol, diferentes puntos fuertes de los EF, y los tratamientos combinados de ambos. Honokiol, un polifenol pequeña molécula aislada del género Magnolia, se encontró que tienen, y propiedades antitumorales antiinflamatorios antiangiogénicos en estudios preclínicos 28. Como se muestra en la Figura 2D, el ROS producido fue casi la misma para los EF inferiores a 67 mV / mm, pero se incrementó con el aumento de los EF encima de este valor. Figura 2E muestra que bajo tratamientos combinados de los campos eléctricos y honokiol, el nivel de ROS se mantuvo casi el mismo, lo que indica que honokiol inhibe la producción de ROS exógeno (es decir., ROS relacionados con EF estímulo), especialmente bajo EFs más altas. La migración de las células bajo químico simple o coexistiendo/ estímulos eléctricos también se investigó el uso de este chip CEF. Como se ve en la Figura 2F, sin la adición de honokiol, la tasa de migración aumentó a medida que la fuerza aumenta EF. Después de añadir honokiol de diferentes concentraciones, la tasa de migración disminuyó en general, lo que sugiere que honokiol reducción de la migración de células posiblemente a través de la inhibición de la producción de ROS. La direccionalidad de migración se muestra en la figura 2G. En presencia de EF única, las células de cáncer de pulmón mostraron migración direccional prominente hacia el ánodo (con valores negativos). Después de la adición de diferentes concentraciones honokiol, hubo una ligera disminución en la direccionalidad de migración para todas las áreas de EF-estimulado.
Figura 1: El estrés químico-cizalla (CSS) chip usado para estudiar los efectos de los productos químicos y los esfuerzos de cizalladura sobre las células del cáncer de pulmón 2.3
(A) Tres capas de sustratos de PMMA están unidos a través de dos cintas de doble cara para formar el chip CSS. (B) El chip de CSS integrado. (C) Parte superior: fluorescentes y las imágenes de campo claro de CL 1-5 células después de ser tratados con diferentes concentraciones de H 2 O 2. Barra de escala = 50 micras. En pocas palabras: la intensidad media de fluorescencia con SEM representa a diferentes concentraciones de H 2 O 2. (D) Inicio: Fluorescente imágenes de CL 1-5 células bajo diferentes tensiones de corte. Barra de escala = 50 micras. En pocas palabras: la intensidad media de fluorescencia con SEM representa a diferentes tensiones de corte. (E) Top: imágenes fluorescentes y de campo claro de CL 1-5 células después de haber sido estimulado con esfuerzo de corte con diferentes concentraciones de α-tocoferol. Barra de escala = 50 micras. En pocas palabras: la intensidad media de fluorescencia con SEM representa a diferentes concentraciones de α-tocoferol. Los datos presentados aquí wsegún lo publicado originalmente en referencia 23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: el chip de campo químico-eléctrica (CEF) Se utiliza para estudiar los efectos de los productos químicos y los campos eléctricos sobre las células del cáncer de pulmón 22.
(A) Una capa de PMMA se une a una placa de cultivo a través de una cinta de doble cara para formar el chip CEF. (B) El patrón fluídico del chip CSS. (C) El circuito eléctrico equivalente del chip microfluídico. (D) Izquierda: fluorescentes y las imágenes de campo claro de CL 1-5 células después de ser tratados con diferentes concentraciones de los EF. Barra de escala = 50 micras. Derecha: La media de fluorescenciaintensidad con SEM representa en diferentes puntos fuertes de los EF. (E) Izquierda: fluorescentes y las imágenes de campo claro de CL 1-5 células después de ser tratados con honokiol y EFS combinado. Barra de escala = 50 micras. Derecha: La media de intensidad de fluorescencia con SEM representa en honokiol y EFS combinado. (F) Las tasas de migración de las células CL1-5 después de ser tratada con los EF solamente (marcados como control) y honokiol combinado y EFS (marcados como honokiol). (G) La direccionalidad migración de las células CL1-5 después de ser tratado con EFS solamente (marcados como control) y honokiol combinado y EFS (marcado como honokiol). Los datos presentados aquí se publicó originalmente en 22 de referencia. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
los chips basados en PMMA se confeccionan mediante ablación con láser y la escritura que son los métodos más fáciles y más baratos en comparación con los chips basados en PDMS que requieren más complicado litografía blanda. Después de diseñar un chip de microfluidos, la fabricación y el montaje se puede hacer en tan sólo 5 min. Hay algunos pasos críticos que se deberá prestar atención a en la realización del experimento. La primera es la cuestión "montaje". Los adaptadores deben pegarse correctamente al en la capa superior del chip. Pegamento se podrían producir pérdidas en los circuitos de fluidos, si se aplica demasiado, y el líquido podría fugarse del chip si se usa demasiado poco de pegamento. Además, en el montaje de los sustratos de PMMA y las cintas de doble cara, es importante para aplicar presión para presionar todo el chip firmemente para evitar cualquier fuga de líquido. El segundo es el tema "burbuja". Para eliminar las burbujas, 1x PBS se hace fluir continuamente en el canal fluídico para 1 o 2 min a un caudal de 20 l / min y luego el chip es patado dentro de una incubadora durante la noche bajo 5% de CO 2 a 37 ° C. Si hay burbujas que quedan dentro de los canales de fluidos, el flujo será no uniforme, provocando la concentración química y distribución no homogénea de EF. La tercera es la cuestión "carga de las células". El número de células cargadas en las áreas de cultivo debe estar bien controlado. Si el número de células es demasiado bajo, muchas corridas experimentales deben llevarse a cabo para recoger suficientes datos para fines estadísticos. Si el número de células es demasiado alta, será difícil para distinguir las células individuales y cuantificar su migración.
En el chip CSS, una estructura de "árbol de Navidad" combinado con una superficie de cultivo triangular genera diferentes concentraciones químicas en cinco áreas, cada una con un gradiente de tensión de corte. Se conocen tensiones de cizallamiento fluídicos para afectar a la unión, la morfología, la migración, y la actividad de las células. esfuerzos de cizalla de un precio tan bajo como 0,25-0,6 Pa podría interconectar la unión celular, Se informó de los valores e incluso más altos de estrés (0,5 -10 Pa) para eliminar las células adherentes 29. Se conocen tensiones de cizallamiento laminar que van desde 0,8 hasta 1,5 Pa alineación celular inducida en la dirección de flujo 30, y los valores aún más bajos (0,1 a 1 Pa) para afectar a la morfología celular y la permeabilidad 29. Por otra parte, las células del músculo liso sometidas a tensiones de corte de 2-120 Pa experimentaron un descenso en el número de células 31. Lu et al. informaron el diseño y la construcción de dispositivos de corte de microfluidos para el análisis cuantitativo de la adhesión celular 27. La tensión de corte en el canal fluídico se modificó por el cambio de las dimensiones del canal. Chin et al. se describe un sistema hemodinámico Lab-on-a-chip para controlar la velocidad de flujo del medio de cultivo en el micro-canal para imitar el perfil de flujo de la sangre en el recipiente 32. La tensión de corte en el canal fluídico se modificó por el cambio de la velocidad de flujo del medio. En eldos dispositivos se, a pesar de un esfuerzo cortante de cualquiera de los valores podría ser generado, sólo un único valor estaba disponible dentro de un área de cultivo al mismo tiempo. En comparación, la presente chip de CSS tiene la ventaja de proporcionar un gradiente de tensión de cizallamiento en un área triangular, aumentando el rendimiento experimental especialmente para un propósito de detección.
En el chip CEF, las áreas de cultivo de la estructura de "árbol de Navidad" son perpendicularmente conectado para formar una trayectoria de fluido análogo a un circuito eléctrico. En un aplicaron corriente continua, cinco puntos fuertes EF se generan dentro de las áreas de cultivo y cada una tiene un flujo de una concentración química específica. Convencionalmente, los experimentos electrotactic se realizaron en placas de Petri en donde podrían producirse problemas de los EF imprecisos, evaporación media, de células grandes / consumo de reactivos, y el aumento de calentamiento por efecto Joule. Cerrados, los dispositivos de microfluidos en miniatura superar estos inconvenientes de manera eficiente. Por ejemplo, para estudiar la electrotaxis océlulas T de memoria sangre humanos f, Lin et al. informado de un dispositivo para microfluidos de plástico que contiene dos, de lado a lado micro-canales idénticos, dos puntas de pipeta modificados sirven como reservorios medianas, y dos electrodos de platino para la aplicación EF 15. Para aumentar el rendimiento, los chips electrotactic basados en PMMA fueron fabricados para proporcionar múltiples puntos fuertes de EF en un solo dispositivo de 12,33. Además, los dispositivos de microfluidos capaces de generar química controlable y estímulos eléctricos al mismo tiempo son de gran interés. Li et al. fabricado un dispositivo de microfluidos basada en PDMS para generar gradientes químicos / FAs individuales o coexistentes para la investigación de la quimiotaxis o migración de las células T electrotactic 14. Kao et al. Empleó un dispositivo de microfluidos similar a modular la quimiotaxis de las células del cáncer de pulmón mediante EFS 12. En estos dos dispositivos, se aplica una estructura en forma de Y para crear un gradiente de concentración estable en un solo EF aplicada. Hou et al. informaron un chip multicanal de doble-electric-campo para estudiar el efecto concurrente de los productos químicos y los EF en las células de cáncer de pulmón 21. Este dispositivo fue capaz de proporcionar 8 combinaciones de estímulos eléctricos / químicos (2 x 4 eléctrica químicos) en un experimento. Aunque el rendimiento aumenta, la capacidad de este chip se limita a (1) sólo una fuerza EF (más un cero como control), y (2) se requieren cuatro bombas de jeringa para el bombeo de productos químicos en cuatro canales independientes. En comparación, el chip de la presente CEF tiene la ventaja de generar cinco puntos fuertes EF junto con cinco concentraciones químicas a través de un único conjunto de electrodos y 2 bombas de jeringa.
A pesar de que estos chips son fáciles de fabricar, tienen algunas limitaciones. En primer lugar, sólo cinco concentraciones "específicas" y cinco fortalezas EF "específicas" se pueden generar. En segundo lugar, la anchura del canal de fluido no puede ser inferior a 1 mm debido a la focalización de laCO 2 rayo láser. Sin embargo, controlando con precisión la concentración química en la entrada y la corriente eléctrica que pasa a través del canal de fluido, cualquier concentración y fortalezas EF se pueden conseguir en las áreas de cultivo. En conclusión, el presente CSS y patatas fritas CEF son capaces de proporcionar células con estímulos químicos sola o coexistiendo / eléctrica / tensión de cizallamiento controlables. En un chip CSS solo, cinco concentraciones químicas diferentes en combinación con un gradiente de tensión de cizallamiento se pueden generar. Además, en un chip único CEF, cinco concentraciones químicas diferentes en combinación con cinco puntos fuertes EF pueden ser creados. Mediante el aumento de las ramas de la estructura de "árbol de Navidad", el rendimiento de estos chips se puede aumentar más. Estos chips se demostraron ser una, ahorro de tiempo fácil, fiable, y una plataforma de alto rendimiento para los estudios de comportamiento celular bajo estímulos químicos / eléctricos / esfuerzo cortante.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10 cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImageJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
References
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