Abstract
Microfluïdische inrichtingen zijn in staat om een nauwkeurige en controleerbare cellulaire micromilieu van pH, temperatuur, zoutconcentratie, en andere fysische of chemische stimuli. Ze werden gebruikt voor in vitro studies cellen door in vivo als omgeving. Vooral hoe cellen reactie op chemische gradiënten, elektrische velden, en schuifspanningen heeft veel belangen getrokken omdat deze verschijnselen zijn belangrijk bij het begrijpen van de cellulaire eigenschappen en functies. Deze microfluïdische chips kunnen worden vervaardigd uit glassubstraten, silicium wafers, polydimethylsiloxaan (PDMS) polymeren, polymethylmethacrylaat (PMMA) substraten, of polyethyleentereftalaat (PET) substraten. Uit deze materialen, PMMA substraten zijn goedkoop en kunnen gemakkelijk worden verwerkt met behulp van laser ablatie en schrijven. Hoewel enkele microfluïdische inrichtingen zijn ontworpen en vervaardigd voor het genereren van meerdere, naast elkaar bestaande chemische en elektrische stimuli, was geen van hen beschouwdvoldoende op het verminderen experimentele herhalingen, vooral voor screeningsdoeleinden. In dit rapport beschrijven we ons ontwerp en de fabricage van twee-PMMA gebaseerde microfluïdische chips voor het onderzoeken van cellulaire reacties, in de productie van reactieve zuurstofverbindingen en de migratie, onder één of samenleven chemische / elektrische / shear stress stimuli. De eerste chip genereert vijf relatieve concentraties van 0, 1/8, 1/2, 7/8 en 1 in de kweek regio, samen met een afschuifspanning gradiënt geproduceerd in elk van deze gebieden. De tweede chip genereert dezelfde relatieve concentraties, maar met vijf verschillende elektrische veldsterkte gecreëerd binnen elke cultuur gebied. Deze apparaten bieden niet alleen cellen met een nauwkeurige, controleerbare micro-omgeving, maar ook de experimentele throughput sterk toenemen.
Introduction
In vivo cellen zijn omgeven door een verscheidenheid aan biomoleculen waaronder extracellulaire matrix (ECM), koolhydraten, lipiden en andere cellen. Ze functionaliseren door te reageren op micro-prikkels uit de omgeving, zoals de interactie met ECM en de reacties op de chemische gradiënten van verschillende groeifactoren. Traditioneel worden in vitro cel studies bij celcultuurschalen wanneer de consumptie van cellen en reagentia is groot en cellen groeien in een statische (niet-circulerende) omgeving. Onlangs, micro-gefabriceerde apparaten geïntegreerd met vloeibare componenten hebben verstrekt een alternatief platform voor mobiele studies op een meer beheersbare manier. Dergelijke inrichtingen zijn in staat om een nauwkeurige micromilieu van chemische en fysische stimuli met een minimaal verbruik van cellen en reagentia. Deze microfluïdische chips kunnen worden vervaardigd uit glassubstraten, silicium wafers, polydimethylsiloxaan (PDMS) polymeren, polymethylmethacrylaat (PMMA) substraten of polyethylenetereftalaat (PET) substraten 1-3. PDMS-apparaten zijn transparant, biocompatibel en doorlaatbaar voor gassen, waardoor ze geschikt zijn voor langdurige celcultuur en studies. PMMA en PET substraten zijn goedkoop en gemakkelijk te verwerken met behulp van laser ablatie en schrijven.
Microfluïdische inrichtingen moeten de cellen te voorzien van een stabiele en controleerbare micro-omgeving waarin cellen zijn onderworpen aan verschillende chemische en fysische stimuli. Zo worden microfluïdische chips chemotaxis van cellen te bestuderen. In plaats van de traditionele methoden die in dienst Boyden kamer en capillaire 4,5 deze geminiaturiseerde fluïde apparaten kunnen precieze chemische gradiënten genereren voor het bestuderen van de cellen 'gedrag 1,6,7. Een ander voorbeeld is het directional migratie cellen onder elektrische velden (EF), een fenomeen genaamd electrotaxis bestuderen. Electrotactic gedrag cellen werd gerapporteerd als zijnde gerelateerd aan zenuwregeneratie 8, 9 embryonale ontwikkeling,en wondgenezing 10,11. En veel studies uitgevoerd om de electrotaxis van verschillende celtypen waaronder kankercellen 12,13 onderzoeken lymfocyten 14,15 leukemiecellen 11 en stamcellen 16. Conventioneel, Petrischalen en dekglaasjes worden gebruikt om electrotactic kamers te bouwen voor het opwekken van EF 17. Dergelijke eenvoudige opstellingen problemen opleveren van middelgrote verdamping en onnauwkeurig EF, maar ze kunnen worden overwonnen door microfluïdische apparaten omheind, goed gedefinieerde vloeibare kanalen 12,18,19.
Systematisch bestuderen cellulaire reacties onder nauwkeurig regelbare chemische en elektrische stimuli, zou het van groot nut microfluïdische inrichtingen staat om cellen met meerdere stimuli tegelijkertijd ontwikkelen. Bijvoorbeeld Li et al. rapporteerde een PDMS-gebaseerde microfluïdische apparaat voor het maken van één of naast elkaar bestaande chemische gradiënten en EF 20. Kao et al. devweggelopen een soortgelijke microfluïdische chip met de chemotaxis van longkanker cellen te moduleren door EF 6. Bovendien zou de doorvoersnelheid, Hou et al verhogen. ontworpen en gefabriceerd een PMMA multichannel-dual-elektrische veld chip om cellen te voorzien van 8 verschillende gecombineerde stimuli, zijnde (2 EF sterktes x 4 chemische concentraties) 21. Om de hele verdere versterking van de en voeg de shear stress stimulus, ontwikkelden we twee PMMA gebaseerde microfluïdische apparaten voor het bestuderen van cellulaire reacties onder één of samenleven chemische / elektrische / shear stress stimuli.
Gerapporteerd door Lo et al. 22,23, deze apparaten bevatten vijf onafhankelijke celkweek kanalen onderworpen aan continue vloeibare vloeiende, het nabootsen van de in vivo bloedsomloop. In de eerste chip (de chemische-shear stress chip of de CSS-chip), vijf relatieve concentraties van 0, 1/8, 1/2, 7/8 en 1 worden gegenereerd in de cultuur regio's, en een shear stress gradiënt produced in elk van de vijf gebieden cultuur. In de tweede chip (de chemische-elektrische veld chip of de CEF chip), met behulp van een enkele set van elektroden en 2 spuitpompen worden vijf EF krachten gegenereerd in aanvulling op vijf verschillende chemische concentraties binnen deze cultuur gebieden. Numerieke berekeningen en simulaties worden uitgevoerd om een beter ontwerp en functioneren deze chips en longkankercellen gekweekt binnen deze hulpmiddelen onder één of bestaande stimuli waarnemersregeling antwoorden voor de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), de migratiesnelheid, en de migratie richting. Deze chips worden aangetoond tijdbesparende, high-throughput en betrouwbare apparatuur voor het onderzoeken hoe cellen reageren op de verschillende micro-prikkels uit de omgeving zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. chip design en fabricatie
- Trek patronen worden weggenomen op PMMA substraten en dubbel-side tapes met behulp van commerciële software 24.
- Om de effecten van chemische concentraties en schuifspanningen bestuderen trek een "Kerstboom" patroon met een variërende breedte aan het einde in elk van de vijf gebieden kweek (Figuur 1A en 1B).
- Om de effecten van chemische concentraties en elektrische velden te bestuderen, trek een "kerstboom" patroon met twee vloeibare kanalen voor zout bruggen (Figuur 2A en 2B).
- Scribe een individuele patroon op een PMMA blad of een dubbel-side tape door het laden van het overeenkomstige bestand in de CO 2 laser afschrijver.
- Zet de laser kraspen, en controleer de verbinding met de computer. Open het patroon dat geablateerd met de commerciële software.
- Plaats een PMMA blad of een dubbelzijdige tape on top van het podium van de kraspen. Pas de scherpstelling van de CO2 laser zo nodig met de kalibratiebalk en toegankelijk He-Ne laser.
- Laad het patroon in de priem van ablatie op de PMMA plaat of tape.
- Pak de patroon plaat of tape, verwijderen van ongewenste stukken, en het oppervlak met stikstof blazen schoon te maken.
OPMERKING: De dikte van het PMMA-vel 1 mm, en die van de dubbelzijdige tape is 0,07 mm of 0,22 mm.
2. Chip Assembly
- Met superlijm, bevestig acryl adapters (lengte x breedte x hoogte = 10 mm x 10 mm x 5 mm, met schroefdraad in het midden) om de bovenste laag van de chip door het gelijktrekken van de schroefdraad en de gaten op de bovenste -De meeste laag. Deze adapters dienen als medium inlaten / uitlaten en zout brug connectors.
- Monteer de microfluïdische chip in een laminaire stroming kap.
- Monteer de chemische-shear stress microfluïdische chip (CSS chip).
- EENttach 3 vellen beschreven PMMA vellen met behulp van 2 stuks beschreven dubbelzijdige tape. (Figuur 1A en 1B).
- Voeg nog stuk van de 0,07 mm dubbelzijdig plakband op de onderzijde van de chip en bevestig de chip een 10 cm diameter Petrischaal.
- Zet de assemblage chip in de vacuümkamer voor overnachting.
- Om de chemische-elektrische veld chip (CEF chip) monteren, bevestig de PMMA blad aan een dubbelzijdige tape met een dikte = 0,22 mm (figuur 2A en 2B).
- Bevestig de beschreven PMMA vel en dubbelzijdige tape aan een 10 cm diameter petrischaal met behulp van deze zelfde stukje tape.
- Laat de geassembleerde chip in de motorkap en blootgesteld aan UV gedurende 30 minuten voor sterilisatie.
- Sluit de inlaten naar twee 3-ml spuiten via plastic buizen en handvast moeren. Verbind de uitlaat met een verspilling buis via een plastic buisje en een vinger-tight moer.
LET OP: Autoclaafalle buizen en moeren 121 ° C gedurende 15 minuten voor gebruik. - Langzaam op de zuiger op de spuit aan premier de vloeibare kanalen met PBS. Duw spuiten heen en weer om luchtbellen te verwijderen.
- Zet de chips in een incubator gedurende de nacht bij 37 ° C onder 5% CO2.
LET OP: Deze twee maatregelen zijn erop gericht om de chip te wassen en verwijder alle resterende luchtbellen binnen de chip. - Neem de chip uit de incubator.
- Bereid agar zout bruggen voor het opwekken van elektrische velden in de CEF chip.
- Los 3% laag smeltpunt agarose in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer met een magnetron.
- Injecteren-oplossing gefaseerd agarose in de zoutbrug kanaal en plaats de elektroden voordat oplossing stolt.
- Plaats zilver / zilver-chloride elektroden in de buisvormige moeren.
- Sluit de spuiten aan de spuit pompen, en continu stroomt het kweekmedium (Dulbecco's Modified EagleR17; s medium, DMEM) in de vloeibare kanaal gedurende 10 min bij een stroomsnelheid van 20 pl / min PBS vervangen.
3. Cel Voorbereiding en experimentele opstelling
OPMERKING: Pre-warm 1x PBS, kweekmedium (DMEM plus FBS) en trypsine in een 37 ° C waterbad voor gebruik.
- Plaat 2 x 10 5 cellen longkanker CL1-5 25,26 in een 10 cm petrischaal met DMEM plus 10% foetaal runderserum (FBS) geleverd. Incubeer de cellen in een incubator onder 5% CO2 bij 37 ° C tot 90% confluentie.
- Zuig het medium en was de cellen eenmaal met voorverwarmd 1x PBS. Voeg 2 ml van 0,05% trypsine buffer om de cellen en wacht 2 tot 3 minuten bij 37 ° C om de cellen los.
- Overdracht van de cellen naar een steriele 15 ml centrifugebuis en voeg 6 ml kweekmedium in de buis. Keer de buis voor het mengen en neem 5 ul van de cel-bevattend medium voor het tellen van het aantal cellen in een hemocytometer.
- Centrifugeer de buis bij 300 x g gedurende 5 minuten. Schorten 10 6 cellen in 1 ml kweekmedium en plaats het celbevattende medium in een 1 ml spuit.
- Trekken de cel-bevattend medium in de microfluïdische chip uit het stopcontact en zorg ervoor dat de oplossing distribueert al door de vijf cultuur gebieden. Incubeer de chip in een incubator onder 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 2 uur.
4. experimentele opstelling
- Neem de chip uit de incubator en plaats het op de top van een transparante indium tin oxide (ITO) glas kachel.
OPMERKING: De ITO glas is verbonden met een proportionele-integrale-afgeleide (PID) regelaar voor de temperatuur op 37 ± 0,5 ° C via feedback van een thermische koppeling stevig ingeklemd tussen de ITO kachel en de chip. - Zet de chip-verwarmingsinrichting op een gemotoriseerde XY fase van een omgekeerde microscoop voor het bijhouden van celmigratie of vaste XY stadiumeen geïnverteerde fluorescentiemicroscoop voor het meten van de productie van ROS.
- Verschillende chemische concentraties genereren, vul twee spuiten van 5 ml van chemische oplossingen of relatieve concentraties 0 en 1 (opgelost in kweekmedium) en pomp ze in de chip op gewenste stroomsnelheden: in de CSS chip, met een stroomsnelheid van 0,3 ml / min gedurende 1 uur; in de CEF chip, met een stroomsnelheid van 20 pl / min, gedurende 20 min en een stroomsnelheid van 20 gl / uur nog eens 120 minuten (totale tijd = 2 uur).
- In de CEF chip, voor het bijhouden van celmigratie, het programma van de XY stadium van de microscoop te herhalen nemen van foto's via een digitale single-lens reflex (DSLR) camera, van bepaalde gebied van de views (EPB) binnen de cultuur gebieden elke 15 min voor 2 hr.
- Voor het meten van de productie van ROS, gebruik maken van de fluorescentie gebaseerde indicator 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetaat (2'-7'-DCFDA).
- Bereid de voorraad van 2'-7'-DCFDA bij 10 mM in de moleculaire biologie klas dimethyl sulfoxide (DMSO). Verdun DCFDA in DMEM alleen zonder serum (5 uM in DMEM). De potentiële deacetylase kan de achtergrondsignalen te verhogen en de signalen in cellen te verlagen.
- Na 1 h schuifspanning stimulus in de CSS chip of na 2 h EF stimulus in de CEF chip, pomp 2'-7'-DCFDA (5 uM in DMEM) in de chip met een stroomsnelheid van 20 pl / min de eerste 20 min en een stroomsnelheid van 20 gl / uur gedurende nog eens 20 min. Voor het wassen, pompen DMEM in de chip met een stroomsnelheid van 20 pl / uur gedurende 20 min.
- Neem's, via een ladingsgekoppelde inrichting (CCD) camera, bepaalde EPB in cultuur gebieden voor het analyseren van de fluorescentie-intensiteiten.
5. Berekeningen van chemische concentraties, schuifspanningen, en elektrische velden
- In zowel de CSS-chip en de CEF chip, het berekenen van de chemische concentraties in de vijf gebieden cultuur. Bijvoorbeeld door het injecteren H 2 O 2 van concentraties 0 en 200 pM van de twee inlaten, concentraties van 0, 25, 100, 175 en 200 pM worden gegenereerd.
OPMERKING: Door aan te nemen dat alle vloeistoffen stroomsplitsingsproces soepel en gelijkmatig rond de splitsing, de relatieve concentraties in de kweek vijf gebieden 0, 1/8, 1/2, 7/8 en 1 resp. - In de CSS-chip, het berekenen van de shear stress (τ) in elk van de kweek gebieden met behulp
27, waarbij Q het debiet, η de vloeibare viscositeit, h de hoogte van het kanaal, en w is de breedte van het kanaal.
OPMERKING: Door Q = 0,3 ml / min in elke inlaat (Q = 0,12 ml / min in elke kweek gebied), η = 0,0008 Pa.s voor cultuurmedium, h = 1 mm, en w = 1 ~ 4 mm, de shear stress wordt berekend varieert van 0,0048 Pa (4 mm breed regio) 0,0192 Pa (1 mm breed regio). - InCEF chip Bereken het EF sterkte binnen elk van de kweek zones met E = I / (σA eff) (wet van Ohm), waarin I de elektrische stroom in de vloeibare kanaal σ de elektrische geleidbaarheid van het kweekmedium, en Aeff de effectieve dwarsdoorsnede van het kanaal.
LET OP: Het gebruik van σ = 1,38 Ω -1 m -1 voor kweekmedium en A eff = 0,22 mm 2 (width = 1 mm en height = 0,22 mm), de EF sterkte wordt berekend op E (mV / mm) = I (be A) × 3,3 x 10 6.- Zoals getoond in figuur 2D, de behandeling van de equivalente schakeling vijf keizersnede circuits met vier (8 + 35 + 8) segmenten en één (5 + 35 + 5) segment.
OPMERKING: Door het analyseren van deze parallelle schakeling volgens Kirchhoff spanning recht en wet van Ohm, stromen over vijf cultuurals ik 1 tot I 5 van beneden naar boven, berekend ongeveer 0,49 te zijn ik (gebied 1), 0,25 I (gebied 2), 0,13 I (gebied 3), 0,08 I (gebied 4), en 0,05 I (area 5) respectievelijk, waarbij I de totale gelijkstroom (dc). Met een toegepaste dc van 0,157 mA, EF van 254, 130, 67, 41, en 26 mV / mm worden gegenereerd binnen de vijf cultuur gebieden.
OPMERKING: Voor een vereenvoudigde elektrische analyse van de microfluïdische netwerk alle vloeibare segmenten geacht weerstanden weerstand evenredig met de lengte.
- Zoals getoond in figuur 2D, de behandeling van de equivalente schakeling vijf keizersnede circuits met vier (8 + 35 + 8) segmenten en één (5 + 35 + 5) segment.
27, waarbij Q het debiet, η de vloeibare viscositeit, h de hoogte van het kanaal, en w is de breedte van het kanaal. 6. Data Analysis
Opmerking: Data analyse wordt uitgevoerd met de ImageJ software.
- Analyseer de productie van ROS.
- Voer de ImageJ software. Ga naar "File" → Openen om een fluorescerende afbeelding te laden om te worden geanalyseerd.
- Ga naar "Beeld" → "Type" → "16-bit" om de im veranderenleeftijd om een grijstinten.
- Teken een polygoon om een cel te omsluiten. Ga naar "analyseren" → "Measure" naar de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de cellen te meten.
- Herhaal 6.1.3 intensiteiten te verzamelen van ten minste 50 cellen van drie onafhankelijke experimenten, en berekent het gemiddelde intensiteit standaardfout van het gemiddelde (SEM).
- Herhaal 6.1.1-6.1.4 voor elke experimentele conditie.
- Analyseer Cell Migratie.
- Voer de ImageJ software. Ga naar "File" → Openen om een beeld dat bij tijd = 0 geladen te worden geanalyseerd.
- Teken een polygoon om een cel te omsluiten. Ga naar "analyseren" → "Measure" naar het zwaartepunt van de cel (1 x, y 1) te meten.
- Herhaal 6.2.1- 6.2.2 het zwaartepunt van dezelfde cel (x 2, y 2) van een ander beeld meten nemen op tijdstip = t.
- Bereken de migratie percentage (in micrometer / uur) vanDeze cel
. - Herhaal 6.2.1-6.2.4 migratie tarieven te verzamelen van ten minste 50 cellen van drie onafhankelijke experimenten, en berekent het gemiddelde migratie tarief met standaardfout van het gemiddelde (SEM).
- Van 6.2.2 en 6.2.3, het berekenen van de migratie gerichtheid van deze cel als cosinus θ of
, Waarbij θ de hoek tussen de vector van de toegepaste EF (tussen positief en negatief) en de vector van het begin tot de eindpositie van de cel (figuur 2G). - Herhaal 6.2.6 migratie gerichtheid te verzamelen van ten minste 50 cellen van drie onafhankelijke experimenten, en berekent het gemiddelde migratie gerichtheid met standaardfout van het gemiddelde (SEM).
- Bereken het gemiddelde migratie tarief met SEM en het gemiddelde migratie gerichtheid met SEM voor elke experimentele conditie.
LET OP: Een gerichtheidvan 1 geeft aan dat alle cellen migreren naar de kathode, en een -1 waarde aangeeft dat alle cellen migreren naar de anode. De gerichtheid van een groep van willekeurig bewegende cellen dicht bij 0.
- Analyseer Celuitlijning.
- Voer de ImageJ software. Ga naar "Bestand" → "Open" om een afbeelding te laden te analyseren.
- Behandel de cel als een ellips en trek een lijn op de lengteas van een cel aan te geven. Ga naar "analyseren" → "Measure" om de hoek β tussen de lijn en de horizontale EF richting te meten.
- Herhaal 6.3.2 om β verzamelen van ten minste 50 cellen van drie onafhankelijke experimenten, en bereken de gemiddelde cosinus β met standaardfout van het gemiddelde (SEM).
- Herhaal 6.3.1-6.3.3 voor elke experimentele conditie.
OPMERKING: cos β van 1 geeft aan dat alle cellen uitgelijnd parallel aan de toegepaste EF en een waarde 0 aangeeft dat alle cellen uitlijnen perpendicularly aan de toegepaste EF.
. 
, Waarbij θ de hoek tussen de vector van de toegepaste EF (tussen positief en negatief) en de vector van het begin tot de eindpositie van de cel (figuur 2G). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
The Chemical-shear stress (CSS) Chip
De CSS chip bestaat uit drie PMMA platen, elk met een dikte van 1 mm, aan elkaar bevestigd via twee dubbelzijdig klevende banden, elk met een dikte van 0,07 mm (Figuur 1A en 1B). De "Christmas tree" structuur genereert vijf relatieve concentraties van 0, 1/8, 1/2, 7/8, en 1 op de vijf gebieden cultuur. Door het ontwerpen van de kweek gebied als een driehoek, een schuifspanning gradiënt met een magnitude verwante het volumedebiet, de vloeibare viscositeit, en de afmeting van de vloeibare kanaal Binnen elk van de gebieden. Deze chip wordt vervolgens gekoppeld via een 0,07 mm dik dubbelzijdig plakband, een petrischaal voor het kweken longkanker CL1-5 cellen en de productie van ROS werd waargenomen in reactie op verschillende chemische concentraties en schuifspanningen. De productie van ROS bij longkanker cellen is sterk gerelateerd aan lung uitzaaiing en ontwikkeling, en bepaalde chemicaliën en schuifspanning aangetoond betrokken zijn bij ROS generatie 23.
Ten eerste, om het effect van H 2 O 2, een chemische stimulus, op de productie van ROS bestuderen, werden cellen geïncubeerd met continue stroming van H 2 O 2 oplossingen bij 0, 25, 100, 175, en 200 uM. Zoals getoond in figuur 1C, de fluorescentie-intensiteit verhoogd als de concentratie van H 2 O 2 verhoogde, wat aangeeft dat H 2 O 2 stimuleerde de productie van ROS. Vervolgens de invloed van afschuifspanning op de productie van ROS onderzoeken werden cellen blootgesteld aan een schuifspanning gradiënt van 0,0048 Pa tot 0,0192 Pa. Figuur 1D toont dat de fluorescentie-intensiteit verhoogd de schuifspanning verhoogd (de schuifspanningen waren het hoogst en de laagste in de voorste en achterste gebieden, respectievelijk), suggererening dat hogere shear stress veroorzaakte meer ROS productie. Tevens was dit CSS chip gebruikt voor de productie van onderzoeken bij reactie op verschillende concentraties van α-tocoferol, een antioxidant of een vorm van vitamine E. De cellen werden gestimuleerd door schuifspanning plus α-tocoferol of 0, 3,2, 12,5, 21,9 en 25 ug / ml. Zoals getoond in figuur 1E, voor α-tocoferol concentraties van minder dan 21,9 pg / ml, de fluorescentie-intensiteit af als de concentratie verhoogd, over de gevolgen van α-tocoferol het verminderen van de productie van ROS. Aangezien de concentratie verhoogd tot 25 ug / ml, de gemiddelde intensiteit toegenomen, wat suggereert dat deze hoge concentratie van α-tocoferol weinig ROS heeft elimineren vergelijking met lagere concentraties.
The Chemical-elektrische veld (CEF) Chip
Het CEF chip bestaat uit een 1 mm dikke PMMA en 0,22 mm dubbelzijdig tape met vloeistofkanalen patroon op (figuur 2A en 2B). Ook de "kerstboom" structuur creëert vijf relatieve concentraties van 0, 1/8, 1/2, 7/8 en 1 in de kweek vijf gebieden. Bovendien zijn deze vijf gebieden parallel loodrecht verbonden met een fluïde pad analoog aan een elektrisch circuit vormen. Het elektrisch veld opgewekt in een cultuur gebied is gerelateerd aan de geleidbaarheid van de vloeistof, de dwarsdoorsnede van het kanaal en de gelijkstroom (DC) door het gebied. Volgens Kirchhoff spanning wet en de wet van Ohm, de stromingen in de vijf cultuur gebieden zijn 0,49 I, 0,25 I, 0,13 I, 0,08 I, en 0,05 I, respectievelijk, waar ik de toegepaste dc (figuur 2C). Deze chip is bevestigd, via 0,22 mm dik dubbelzijdig plakband, een petrischaal voor het kweken longkanker CL1-5 cellen celmigratie en kleding observerenn ROS reactie op verschillende concentraties chemische en elektrische velden.
Aanvankelijk werd deze chip gebruikt voor de productie van onderzoeken bij reactie op verschillende concentraties van honokiol verschillende sterktes van EF en gecombineerde behandelingen van beide. Honokiol, een klein molecuul polyfenol geïsoleerd uit het geslacht magnolia, bleek anti-angiogene, ontstekingsremmende en antitumor eigenschappen in preklinische studies 28 hebben. Zoals getoond in figuur 2D, de ROS productie was vrijwel hetzelfde voor EF lager dan 67 mV / mm, maar verhoogd met toenemende EF boven deze waarde. Figuur 2E toont dat onder gecombineerde behandeling van elektrische velden en honokiol het ROS-niveau bijna verbleven dezelfde, wat aangeeft dat honokiol de productie van exogene ROS (bijv., met betrekking tot ROS EF stimulus), vooral bij hogere EF geremd. De migratie cel onder één of bestaande chemische/ Elektrische stimuli werd ook onderzocht met behulp van deze CEF chip. Zoals blijkt uit figuur 2F, zonder toevoeging van honokiol, de migratie steeg de EF sterkte toe. Na toevoeging honokiol van verschillende concentraties, de migratie daalde in het algemeen suggereert dat honokiol verminderde celmigratie mogelijk via remmen van de productie van ROS. De migratie gerichtheid is getoond in figuur 2G. In aanwezigheid van EF alleen longkanker cellen vertoonden zichtbare gerichte migratie naar de anode (negatieve waarden). Na toevoeging honokiol verschillende concentraties was er een lichte afname van migratie directheid voor EF-gestimuleerde gebieden.
Figuur 1: The Chemical-shear stress (CSS) Chip gebruikt om de effecten van chemische stoffen en schuifspanningen op longkanker cellen te bestuderen 2.3
(A) Drie lagen van PMMA substraten samengebonden via twee dubbelzijdige tape om de CSS chip vormen. (B) De geïntegreerde CSS chip. (C) Bovenste: Fluorescerend bright-field afbeeldingen CL 1-5 cellen na behandeling met verschillende concentraties H 2 O 2. Schaal bar = 50 micrometer. Onder: gemiddelde fluorescentie-intensiteit met SEM bepaald bij verschillende concentraties H 2 O 2. (D) Top: Fluorescent beelden van CL 1-5 cellen onder verschillende schuifspanningen. Schaal bar = 50 micrometer. Onder: gemiddelde fluorescentie-intensiteit met SEM uitgezet op verschillende schuifspanningen. (E) Top: Fluorescerend bright-field afbeeldingen CL 1-5 cellen na stimulatie met afschuifspanning met verschillende concentraties van α-tocoferol. Schaal bar = 50 micrometer. Onder: gemiddelde fluorescentie-intensiteit met SEM bepaald bij verschillende concentraties van α-tocoferol. Gepresenteerde gegevens hier wzoals oorspronkelijk gepubliceerd in referentie 23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: The Chip Chemisch-elektrisch veld (CEF) gebruikt om de effecten van chemische stoffen en elektrische velden op longkankercellen 22 Studie.
(A) een laag van PMMA wordt op een kweekschaal gebonden via een dubbelzijdige tape om de CEF chip vormen. (B) Het vloeibare patroon van de CSS-chip. (C) Het equivalente elektrische circuit van de microfluïdische chip. (D) Links: TL en bright-field beelden van CL 1-5 cellen na de behandeling met verschillende sterktes van EF. Schaal bar = 50 micrometer. Rechts: Mean fluorescentintensiteit SEM uitgezet op verschillende sterktes van EF. (E) Links: TL en bright-field beelden van CL 1-5 cellen na de behandeling met gecombineerde honokiol en EF. Schaal bar = 50 micrometer. Rechts: De gemiddelde fluorescentie-intensiteit met SEM uitgezet bij gecombineerd honokiol en EF. (F) De migratiesnelheden van CL1-5 cellen na behandeling met EF alleen (aangeduid als controle) en de gecombineerde honokiol en EF (gemarkeerd als honokiol). (G) De migratie gerichtheid van CL1-5 cellen na de behandeling met EF alleen (gemarkeerd als controle) en gecombineerde honokiol en EF (gemarkeerd als honokiol). Hier gepresenteerde gegevens werd oorspronkelijk gepubliceerd in verwijzing 22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PMMA-gebaseerde chips worden gemaakt door laserablatie en schrijven die goedkoper en gemakkelijker methoden zijn vergeleken met PDMS-gebaseerde chips ingewikkelder zachte lithografie vereist. Na het ontwerpen van een microfluïdische chip, kan de fabricage en assemblage worden gedaan binnen slechts 5 minuten. Er zijn een aantal kritische stappen die de aandacht moet worden besteed aan het uitvoeren van het experiment. De eerste is de "assembleren" kwestie. De adapters moet goed worden vastgelijmd aan de bovenste laag van de chip. Lijm zou kunnen lekken in de vloeibare kanalen als er te veel wordt toegepast, en de vloeistof kan uit de chip lek als er te weinig lijm wordt gebruikt. Ook het monteren van de PMMA-substraten en de dubbelzijdig klevende banden, is het belangrijk om de druk strak op de gehele chip om eventuele vloeistoflekkage te voorkomen passen. De tweede is de "bubble" kwestie. Blazen aandrukken wordt 1x PBS continu stroomde in de vloeibare kanaal 1 of 2 min bij een stroomsnelheid van 20 pl / min en de chip is pgeregen in een incubator nacht onder 5% CO2 bij 37 ° C. Als er belletjes steeds binnen de vloeistofkanalen, zal de stroom niet-uniform zijn, waardoor homogene chemische concentratie en EF distributie. De derde is de "cel loading" kwestie. Het aantal cellen geladen in de kweek gebieden moeten goed worden gecontroleerd. Als het aantal cellen te laag is, moeten vele experimentele runs worden uitgevoerd om voldoende gegevens te verzamelen voor statistische doeleinden. Als het aantal cellen te hoog is, zal het moeilijk zijn om individuele cellen onderscheiden en kwantificeren van de migratie.
In het CSS chip, een "kerstboom" structuur gecombineerd met een driehoekig gebied cultuur genereert verschillende chemische concentraties in vijf gebieden, elk met een afschuifspanning gradiënt. Fluidic schuifspanningen bekend waren naar de bijlage, de morfologie, de migratie en de activiteit van de cellen te beïnvloeden. Shear stress van zo laag als 0,25-0,6 Pa celhechting kon communicerenEn zelfs hogere waarden van de spanningen (0,5 -10 Pa) werden gemeld aan hechtende cellen 29 te verwijderen. Laminaire schuifspanning variërend 0,8-1,5 Pa geïnduceerde celuitlijning in de stroomrichting 30, en zelfs lagere waarden (0,1-1 Pa) was bekend dat celmorfologie en permeabiliteit 29 beïnvloeden. Bovendien, gladde spiercellen blootgesteld aan stress van 2-120 Pa scheren kende een daling van het aantal cellen 31. Lu et al. meldde het ontwerp en de bouw van microfluïdische shear apparatuur voor de kwantitatieve analyse van celadhesie 27. De schuifspanning in de vloeibare kanaal werd gemodificeerd door het veranderen van de afmetingen van het kanaal. Chin et al. beschreef een hemodynamische Lab-on-a-chip voor het regelen van het debiet van het kweekmedium in het microkanaal naar het stromingsprofiel van het bloed bootsen in het vat 32. De schuifspanning in de vloeibare kanaal werd gemodificeerd door het veranderen van de stroomsnelheid van het medium. In dese twee apparaten, terwijl een schuifspanning van elke waarde kan worden gegenereerd, slechts één enkele waarde werd aangeboden binnen een cultuur gebied tegelijk. Ter vergelijking, de onderhavige CSS chip heeft het voordeel dat een schuifspanning gradiënt in een driehoekig gebied, waardoor de experimentele throughput vooral voor een screening doeleinden.
In de CEF chip, de cultuur gebieden van de "kerstboom" structuur loodrecht verbonden met een fluïde pad analoog aan een elektrisch circuit vormen. Bij een gelijkstroom toegepast worden vijf EF krachten opgewekt in de kweek gebieden met elk een stroom van een specifieke chemische concentratie. Conventioneel, electrotactic experimenten werden uitgevoerd op petrischaaltjes waar de problemen van onnauwkeurige EF, middelgrote verdamping, grote cel / reagensverbruik, en verhoogde Joule verwarming kan optreden. Afgesloten, miniatuur microfluïdische apparaten efficiënt deze nadelen te overwinnen. Bijvoorbeeld, om te studeren de electrotaxis of menselijk bloed memory T-cellen, Lin et al. rapporteerde een plastic microfluïdische apparaat met twee identieke, side-by-side micro-kanalen, twee pipetpunten gemodificeerd diende als medium reservoirs en twee platina elektroden EF toepassing 15. Om de doorvoer te verhogen, werden PMMA-based electrotactic chips gefabriceerd om meerdere EF sterke punten te bieden in één enkel apparaat 12,33. Ook microfluïdische inrichtingen kunnen genereren regelbare chemische en elektrische stimuli tegelijkertijd zijn van groot belang. Li et al. gefabriceerd van een PDMS-gebaseerde microfluïdische apparaat om één of bestaande chemische gradiënten / EF te genereren voor het onderzoeken van de chemotactische of electrotactic migratie van T-cellen 14. Kao et al. Gebruikt een soortgelijke microfluïdische apparaat om de chemotaxis van longkanker cellen moduleren met EF 12. In beide apparaten is een Y-vormige structuur toegepast op een stabiele concentratiegradiënt te creëren in één toegepaste EF. Hou et al. rapporteerde een multichannel-dual-elektrische veld chip aan de gelijktijdige effect van chemische stoffen en EF op longkankercellen 21 bestuderen. Dit apparaat was in staat om 8 combinaties van elektrische / chemische stimuli (2 elektrische x 4 chemische) te bieden in één experiment. Hoewel het debiet verhoogd, werd het vermogen van deze chip beperkt tot (1) in een EF sterkte (plus een nul als controle), en (2) vier spuitpompen zijn vereist voor het verpompen van chemicaliën in vier onafhankelijke kanalen. Ter vergelijking, de onderhavige CEF chip heeft het voordeel van het genereren vijf EF krachten en vijf chemische concentraties via één stel elektroden 2 en spuitpompen.
Hoewel deze chips zijn gemakkelijk te fabriceren, ze hebben een aantal beperkingen. Ten eerste kan slechts vijf "specifieke" concentraties en vijf "specifieke" EF krachten worden gegenereerd. Ten tweede kan de breedte van de vloeibare kanaal niet minder dan 1 mm door de concentratie van deCO 2 laserstraal. Door echter nauwkeurig regelen van de chemische concentratie bij de inlaat en de elektrische stroom die door de vloeibare kanaal, kunnen concentraties en EF krachten kunnen worden bereikt in de cultuur gebieden. Kortom, de onderhavige CSS en CEF chips zijn in staat om cellen met controleerbare enkele of bestaande chemische / elektrische / schuifspanning stimuli. In één CSS chip, kunnen vijf verschillende chemische concentraties in combinatie met een afschuifspanning gradiënt gegenereerd. Bovendien, in een enkele chip CEF vijf verschillende chemische concentraties in combinatie met vijf EF sterktes kunnen worden gecreëerd. Door verhoging van de takken van de "kerstboom" structuur, kan de doorvoer van deze chips verder worden verhoogd. Deze chips wordt aangetoond dat een eenvoudige, tijdbesparende, betrouwbare en high-throughput platform voor studies van cellulaire gedrag bij chemische / elektrische / schuifspanning stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10 cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImageJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
References
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
- Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- Adler, J.
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107 (2014).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
- Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
- Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
- Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
- Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
- Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117 (2012).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007 (2014).
- Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15 (2016).
- Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108 (2013).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
- Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
- Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
- Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
- Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
- Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
- Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
