Abstract
Mikrofluidanordningar är kapabla att skapa en exakt och styrbar cellulär mikromiljö av pH, temperatur, saltkoncentration, och andra fysikaliska eller kemiska stimuli. De har vanligen används för in vitro-studier cell genom in vivo som omgivningen. Speciellt hur celler svaret till kemiska gradienter, elektriska fält, och skjuvspänningar har dragit många intressen eftersom dessa fenomen är viktiga för att förstå cellulära egenskaper och funktioner. Dessa mikroflödes chips kan vara gjorda av glasunderlag, kiselskivor, polydimetylsiloxan (PDMS) polymerer, polymetylmetakrylat (PMMA) substrat, eller polyetylentereftalat (PET) substraten. Ut ur dessa material, PMMA substrat är billiga och kan enkelt bearbetas med användning av laserablation och skrivning. Även om ett fåtal mikroflödessystem enheter har konstruerats och tillverkas för att generera flera, samtidiga kemiska och elektriska stimuli, var ingen av dem ansestillräckligt effektiv för att minska experimentella upprepningar, särskilt vid screening. I denna rapport beskriver vi vår design och tillverkning av två PMMA-baserade mikroflödessystem marker för att undersöka cellulära svar, i produktionen av reaktiva syreradikaler och migration under enstaka eller samexisterar kemiska / elektriska / skjuvspänning stimuli. Den första chip genererar fem relativa koncentrationerna av 0, 1/8, 1/2, 7/8, och en i kulturregioner, tillsammans med en skjuvspänning gradient produceras inom vart och ett av dessa områden. Den andra chip genererar samma relativa koncentrationer, men med fem olika elektriska fältstyrkor som skapats inom varje odlingsområde. Dessa enheter ger inte bara celler med en exakt, reglerbar mikromiljön utan också kraftigt öka den experimentella genomströmning.
Introduction
In vivo-celler är omgivna av en mängd olika biomolekyler inklusive extracellulär matris (ECM), kolhydrater, lipider, och andra celler. De funktionalisera genom att svara på mikromiljö stimuli såsom interaktion med ECM och svar på kemiska gradienter av olika tillväxtfaktorer. Traditionellt är cell in vitro studier genomfördes i cellodlingsskålar där förbrukningen av celler och reagens är stort och celler växer i en statisk (icke-cirkulerande) miljö. Nyligen har mikrotillverkade anordningar integrerade med fluid komponenter gav en alternativ plattform för cellstudier på ett mer kontrollerbart sätt. Sådana anordningar är i stånd att skapa en exakt mikromiljö av kemiska och fysikaliska stimuli och samtidigt minimera förbrukningen av celler och reagens. Dessa mikroflödes chips kan vara gjorda av glasunderlag, kiselskivor, polydimetylsiloxan (PDMS) polymerer, polymetylmetakrylat (PMMA) substrat, eller polyethylenetereftalat (PET) substraten 1-3. PDMS-baserade enheter är transparenta, biokompatibla och genomträngligt för gaser, vilket gör dem lämpliga för långvarig cellodling och studier. PMMA och PET-substrat är billiga och lätta att bearbetas med användning av laserablation och skrivning.
Mikroflödessystem enheter bör ge celler med en stabil och kontrollerbar mikro miljö där cellerna är föremål för olika kemiska och fysikaliska stimuli. Till exempel är mikrofluidchips används för att studera kemotaxi av celler. I stället för traditionella metoder som använder Boyden kammare och kapillär 4,5 dessa miniatyriserade fluidanordningar kan generera exakta kemiska gradienter för att studera celler beteenden 1,6,7. Ett annat exempel är att studera cellernas riktnings migration enligt elektriska fält (EFS), ett fenomen som heter electrotaxis. Electrotactic beteenden av celler rapporterades vara relaterade till nervregeneration 8, embryonal utveckling 9,och sårläknings 10,11. Och många studier har genomförts för att undersöka electrotaxis av olika celltyper, inklusive cancerceller 12,13, lymfocyter 14,15, leukemiceller 11, och stamceller 16. Konventionellt petriskålar och täckglas används för att konstruera electrotactic kammare för att generera EF 17. Sådana enkla inställningar skapar problem medium avdunstning och oprecisa EF, men de kan övervinnas genom mikroflödessystem enheter av slutna, väldefinierade fluidic kanaler 12,18,19.
Att systematiskt studera cellulära svar enligt precisa, styrbara kemiska och elektriska stimuli, skulle det vara till stor nytta för att utveckla mikroflödessystem enheter som kan ge celler med flera stimuli samtidigt. Till exempel, Li et al. rapporterade en PDMS-baserade mikroflödessystem enhet för att skapa enkla eller samexisterande kemiska gradienter och EF 20. Kao et al. devrymt en liknande mikroflödes chip för att modulera kemotaxi av lungcancerceller av EF 6. Dessutom, för att öka genomströmningen, Hou et al. konstrueras och tillverkas en PMMA-baserad flerkana-dual-elektriskt fält chip för att ge celler med 8 olika kombinerade stimuli, som är (2 EF styrkor x 4 kemiska koncentrationer) 21. För att ytterligare öka hela och lägga skjuvspänningen stimulans, utvecklade vi två PMMA-baserade mikroflödessystem enheter för att studera cellulära svar under en enda eller samexisterande kemiska / elektriska / skjuvspänning stimuli.
Rapporterat av Lo et al. 22,23, dessa enheter innehåller fem oberoende cellodlings kanaler är föremål för kontinuerlig flödes flödande, härma cirkulationssystemet in vivo. I det första chipset (den kemiska-skjuvspänning chip eller CSS-chip), fem relativa koncentrationerna av 0, 1/8, 1/2, 7/8 och 1 alstras i odlingsområden, och en skjuvspänning gradient är producerad i vart och ett av de fem kulturområden. I den andra chip (den kemiska-elektriska fältet chip eller CEF-chip), genom användning av en enda uppsättning av elektroder och 2 sprutpumpar, är fem EF styrkor genereras utöver fem olika kemiska koncentrationer inom dessa odlingsområden. Numeriska beräkningar och simuleringar görs för att bättre design och driva dessa marker, och lungcancerceller odlade i dessa enheter är föremål för en eller samexisterande stimuli för att observera deras svar i förhållande till produktionen av reaktiva syreradikaler (ROS), migrationshastigheten, och migrationen riktningen. Dessa marker är visat sig vara tidsbesparande, hög genomströmning och pålitliga enheter för att undersöka hur celler svarar på olika mikro stimuli från omgivningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chip Design och Fabrication
- Dra mönster som skall avlägsnas på PMMA substrat och dubbelsidiga band med hjälp av kommersiell programvara 24.
- För att studera effekterna av kemiska koncentrationer och skjuvspänningar, dra en "julgran" mönster med en varierande bredd vid sin ände i var och en av de fem kulturområden (figur 1A och 1B).
- För att studera effekterna av kemiska koncentrationer och elektriska fält, dra en "julgran" mönster med ytterligare två fluidic kanaler för saltbryggor (Figur 2A och 2B).
- Scribe en enskild mönster på en PMMA ark eller en dubbelsidigt band genom att läsa motsvarande fil i CO2-laser ritsnål.
- Sätta på lasern scriber, och kontrollera dess anslutning till datorn. Öppna mönstret som skall avlägsnas med användning av kommersiell programvara.
- Placera ett PMMA-ark eller en dubbelhäftande tejp on upp på scenen av ritspennan. Justera fokus CO2-laser vid behov med hjälp av kalibreringsfältet och den synliga He-Ne-laser.
- Ladda mönstret i ritspennan för ablation på PMMA-ark eller bandet.
- Plocka upp mönstrade ark eller band, ta bort oönskade bitar, och rengör ytan med kväveblåsning.
OBS: Tjockleken på PMMA-ark är 1 mm och den för den dubbelsidiga tejpen är 0,07 mm eller 0,22 mm.
2. Chip Assembly
- Med superlim, fäst akryl adaptrar (längd x bredd x höjd = 10 mm x 10 mm x 5 mm, med gängor i mitten) till den översta lagret av chipet genom att rikta in skruvgängorna och hålen på toppen -de flesta skiktet. Dessa adaptrar fungerar som medium inlopp / utlopp och saltbrygga kontakter.
- Montera mikroflödes chip inuti ett laminärt flöde huva.
- Montera kemikalie skjuvspänningen mikroflödes chip (CSS chip).
- enttach 3 ark ritsade PMMA ark med hjälp av 2 stycken beskrivs dubbelhäftande tejp. (Figur 1A och 1B).
- Lägga till ytterligare en bit av 0,07 mm tjock dubbelhäftande tejp till botten av chipet och fästa chipset till en 10 cm diameter Petri-skål.
- Sätta monterings chip i vakuumkammaren för över natten.
- För att montera den kemiska-elektriska fältet chip (CEF-chip), bifoga PMMA arket till en dubbelhäftande tejp tjocklek = 0,22 mm (figur 2A och 2B).
- Fästa den ritsade PMMA-ark och dubbelhäftande tejp på en 10 cm diameter Petri-skål med användning av denna samma tejpbit.
- Låt sammansatta chip inuti huven och utsättas för UV under 30 min för sterilisering.
- Ansluta inloppen till två 3 ml sprutor via plaströr och fingrarna nötter. Anslut utloppet till en avfallsröret via ett plaströr och en fingrarna mutter.
OBS: Autoklavalla rör och muttrar vid 121 ° C under 15 min före användning. - Tryck långsamt in kolven på sprutan till prime fluidic kanaler med PBS. Skjut sprutor och tillbaka för att avlägsna bubblor.
- Sätta flisen inuti en inkubator över natten vid 37 ° C under 5% CO2.
OBS: Dessa två steg syftar att tvätta chip och ta bort eventuella återstående bubblor i chipet. - Ta chipet ut ur inkubatorn.
- Förbered agar saltbryggor för att generera elektriska fält i CEF-chip.
- Lös 3% lågsmältande agaros i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) buffert med användning av en mikrovågsugn.
- Injicera lösnings fasas agaros i saltbryggan kanal och sätt elektroderna innan lösningen stelnar.
- Placera silver / silverkloridelektroder i de rörformade nötter.
- Anslut sprutorna till sprutpumpar, och kontinuerligt flöde av odlingsmedium (Dulbeccos modifierade EagleR17; s-medium, DMEM) in fluidic kanal för 10 min vid en flödeshastighet av 20 ul / min för att ersätta PBS.
3. Cellberedning och experimentuppställning
OBS: Pre-varm 1x PBS, odlingsmedium (DMEM plus FBS), och trypsin i en 37 ° C vattenbad före användning.
- Plattan 2 x 10 5 lungcancer CL1-5 celler 25,26 i en 10 cm petriskål som levereras med DMEM plus 10% fetalt bovint serum (FBS). Inkubera cellerna inuti en inkubator under 5% CO2 vid 37 ° C tills 90% konfluens.
- Aspirera mediet och tvätta cellerna en gång med förvärmda 1x PBS. Tillsätt 2 ml av 0,05% trypsin-buffert till cellerna och vänta på 2 till 3 minuter vid 37 ° C för att lösgöra cellerna.
- Överföra celler till en 15 ml sterilt centrifugrör och tillsätt 6 ml odlingsmedium in i röret. Vänd försiktigt röret för att blanda och ta ut 5 pl av cellinnehållande medium för räkning av antalet celler i en hemocytometer.
- Centrifugera röret vid 300 x g under 5 min. Suspendera 10 6 celler i 1 ml odlingsmedium och placera cellinnehållande medium i en 1 ml spruta.
- Ingjuta cellinnehållande medium i mikroflödessystem chip från vägguttaget och se till att lösningen distribuerar genom hela fem kulturområden. Inkubera chipet inuti en inkubator under 5% CO2 vid 37 ° C under 2 h.
4. Experimentell Setup
- Ta chipet ur inkubatorn och placera den på toppen av en transparent indiumtennoxid (ITO) glasvärmare.
OBS: ITO glas är ansluten till en proportional-integral-derivata (PID) regulator för upprätthållande av temperaturen vid 37 ± 0,5 ° C via återkoppling från en termisk kopplare fastklämd tätt mellan ITO värmaren och chippet. - Sätta den spånvärmeaggregatet på toppen av en motoriserad XY skede av ett inverterat mikroskop för att spåra cellmigration eller en fast XY stadium avett inverterat fluorescensmikroskop för att mäta produktionen av ROS.
- För att generera olika kemiska koncentrationer, fyll två sprutor med 5 ml av kemiska lösningar av relativa koncentrationer 0 och 1 (lösta i odlingsmedium) och pumpa dem i chipet vid önskade flödeshastigheter: i CSS-chip, med en flödeshastighet av 0,3 ml / min under 1 h; i CEF-chip, med en flödeshastighet av 20 | il / min för den första 20 min och en flödeshastighet av 20 | j, l / timme för en annan 120 minuter (total tid = 2 h).
- I FSE chip, för att spåra cell migration, program XY skede av mikroskop för att upprepa att ta bilder, via en digital spegelreflex (DSLR) kamera av visst område visningar (FOVs) inom kulturområden varje 15 min för 2 h.
- För mätning av produktionen av ROS, använder fluorescensbaserade indikator 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetat (2'-7'-DCFDA).
- Förbered lager av 2'-7'-DCFDA vid 10 mM i molekylärbiologi klass dimetylsulfoxid (DMSO). Späd DCFDA i DMEM endast utan serum (5 iM i DMEM). Potentialen deacetylas kan öka bakgrundssignaler och minska signalerna i cellerna.
- Efter 1 h av skjuvspänning stimulus i CSS-chip eller efter 2 h av EF stimulans i CEF-chip, pumpa 2'-7'-DCFDA (5 ^ M i DMEM) i chipet vid en flödeshastighet av 20 | il / min för den första 20 min och en flödeshastighet av 20 | il / h under ytterligare 20 min. För tvättning, pumpa DMEM i chipet vid en flödeshastighet av 20 | il / h under 20 min.
- Ta bilder, via en laddningskopplad anordning (CCD) kamera, av vissa FOVs inom kulturområden för att analysera de fluorescerande intensiteter.
5. Beräkningar av kemiska koncentrationer, skjuvspänningar, och elektriska fält
- I både CSS chip och CEF chip, beräkna de kemiska koncentrationer i de fem kulturområden. Till exempel, genom att injicera H2O 2 av concentrsamheten 0 och 200 ^ M från två inlopp, koncentrationer av 0, 25, 100, 175, och 200 ^ M genereras.
OBS: Genom att anta att alla vätskor split-flöde smidigt och jämnt runt gaffel, de relativa koncentrationerna i de fem kulturområden är 0, 1/8, 1/2, 7/8 och 1, respektive. - I CSS-chip, beräkna skjuvspänningen (τ) inom vart och ett av de kulturområden med hjälp av
27, där Q är volymflödet, η är fluidic viskositet, h är höjden av kanalen, och w är bredden av kanalen.
OBS: Genom att sätta Q = 0,3 ml / min i varje inlopp (Q = 0,12 ml / min i varje odlingsområde), η = 0,0008 Pa.s för odlingsmedium, h = 1 mm, och w = 1 ~ 4 mm, den skjuvspänningen beräknas sträcka sig från 0,0048 Pa (4 mm bred region) till 0,0192 Pa (1 mm bred region). - ICEF-chip, beräkna EF styrka inom var och en av de kulturområden med hjälp av E = I / (ZA eff) (Ohms lag), där I är den elektriska ström som flyter tvärs fluidic kanal, σ är den elektriska konduktiviteten hos odlingsmediet, och A eff är den effektiva tvärsnittsarean hos kanalen.
OBS: Om du använder σ = 1,38 Ω -1 m -1 för odlingsmedium och A eff = 0,22 mm 2 (width = 1 mm och höjd = 0,22 mm), EF styrkan beräknas vara E (mV / mm) = I ( A) × 3,3 × 10 6.- Såsom visas i figur 2D, behandla den ekvivalenta kretsen som fem C-sektionskretsar med fyra (8 + 35 + 8) segment och en (5 + 35 + 5) segment.
OBS: Genom att analysera denna parallella krets enligt Kirchhoffs spänningslag och Ohms lag, strömmar över fem kultursom jag en till I5 från botten till toppen, beräknas till ca 0,49 I (område 1), 0,25 I (område 2), 0,13 I (område 3), 0,08 I (område 4), och 0,05 I (område 5), respektive, där i är den totala likström (dC). Med en pålagd likström av 0,157 mA, EF 254, 130, 67, 41, och 26 mV / mm genereras inom fem kulturområden.
OBS: För en förenklad elektrisk analys av mikroflödessystem nätet, alla fluid segment betraktas som motstånd med resistens i proportion till deras längder.
- Såsom visas i figur 2D, behandla den ekvivalenta kretsen som fem C-sektionskretsar med fyra (8 + 35 + 8) segment och en (5 + 35 + 5) segment.
27, där Q är volymflödet, η är fluidic viskositet, h är höjden av kanalen, och w är bredden av kanalen. 6. Dataanalys
Notera: Dataanalys utförs med hjälp av ImageJ programvara.
- Analysera Produktion av ROS.
- Köra ImageJ programvara. Gå till "Arkiv" → Öppna för att ladda en fluorescerande bild som skall analyseras.
- Gå till "Bild" → "Typ" → "16-bit" för att ändra imålder till en gråskala.
- Rita en polygon för att innesluta en cell. Gå till "Analysera" → "Measure" för att mäta den genomsnittliga fluorescensintensiteten av cellen.
- Upprepa 6.1.3 för att samla intensiteter från minst 50 celler av tre oberoende experiment, och beräkna medelvärdet intensitet med standardfelet för medelvärdet (SEM).
- Upprepa 6.1.1-6.1.4 för varje experimentell betingelse.
- Analysera Cell migration.
- Köra ImageJ programvara. Gå till "Arkiv" → Öppna för att ladda en bild tagen vid tiden = 0 som skall analyseras.
- Rita en polygon för att innesluta en cell. Gå till "Analysera" → "Measure" för att mäta masscentrum av cellen som (x 1, y 1).
- Upprepa 6.2.1- 6.2.2 för att mäta masscentrum av samma cell som (x 2, y 2) från en annan bild ta vid tiden = t.
- Beräkna vandringshastigheten (i ^ m / h) avdenna cell som
. - Upprepa 6.2.1-6.2.4 för att samla vandringshastigheter från minst 50 celler av tre oberoende experiment, och beräkna medelvärdet migrationshastighet med standardfel för medelvärdet (SEM).
- Från 6.2.2 och 6.2.3, beräkna migrerings riktadhet av denna cell som cosinus θ eller
, Där θ är vinkeln mellan vektorn av den applicerade EF (från positiv till negativ) och vektorn från start till slutpositionen för cellen (figur 2G). - Upprepa 6.2.6 för att samla migration riktadhet från minst 50 celler av tre oberoende experiment, och beräkna medelvärdet migration riktadhet med standardfel för medelvärdet (SEM).
- Beräkna medelmigrationshastigheten med SEM och medelmigrations riktadhet med SEM för varje experimentell skick.
OBS: En riktadhetav 1 indikerar att alla celler migrera mot katoden, och en -1 värde indikerar att alla celler migrera mot anoden. Riktad av en grupp av slumpmässigt rörliga celler är nära 0.
- Analysera Cell Alignment.
- Köra ImageJ programvara. Gå till "Arkiv" → "Öppna" för att ladda en bild som ska analyseras.
- Behandla cellen som en ellips och dra en linje för att indikera den långa axeln av en cell. Gå till "Analysera" → "Measure" för att mäta vinkeln β mellan linjen och den horisontella EF riktning.
- Upprepa 6.3.2 för att samla β från minst 50 celler av tre oberoende experiment, och beräkna medelvärdet cosinus β med standardfel för medelvärdet (SEM).
- Upprepa 6.3.1-6.3.3 för varje experimentell betingelse.
OBS: A cos β av en indikerar att alla celler inrikta sig parallellt med den pålagda EF, och ett 0 värde indikerar att alla celler rikta perpendicularly till tillämpad EF.
. 
, Där θ är vinkeln mellan vektorn av den applicerade EF (från positiv till negativ) och vektorn från start till slutpositionen för cellen (figur 2G). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
The Chemical-skjuvspänning (CSS) Chip
CSS-chip är tillverkad av tre PMMA ark, vardera med en tjocklek 1 mm, bundna tillsammans via två dubbelsidiga tejper, som var och tjockleken 0,07 mm (figur 1A och 1B). Den "julgran" struktur genererar fem relativa koncentrationerna av 0, 1/8, 1/2, 7/8, och en i de fem kulturområden. Genom att utforma odlingsområdet som en triangel, en skjuvspänning gradienten, med en magnitud relaterade volymflödet, fluidic viskositet, och dimensionen av fluidic kanal, är skapad inom vart och ett av områdena. Detta chip fästes sedan, via en annan 0,07 mm tjock dubbelhäftande tejp, till en petriskål för odling av lungcancer CL1-5 celler och produktionen av ROS observerades som svar på olika kemiska koncentrationer och skjuvspänningar. Produktionen av ROS i lungcancerceller är starkt relaterad till lung cancermetastas och utveckling, och vissa kemikalier och skjuvspänning visades vara involverade i ROS generation 23.
Först, för att studera effekten av H2O 2, en kemisk stimulus, på produktionen av ROS, inkuberades celler med kontinuerlig strömning av H 2 O 2 lösningar vid 0, 25, 100, 175, och 200 ^ M. Såsom visas i figur 1C, ökade fluorescensintensiteten när koncentrationen av H2O 2 ökade, vilket tyder på att H 2 O 2 stimulerade produktionen av ROS. Därefter för att undersöka effekten av skjuvspänning på produktionen av ROS, exponerades cellerna för en skjuvspänning gradient av 0,0048 Pa till 0,0192 Pa. Figur 1D visar att fluorescensintensiteten ökas som skjuvspänningen ökas (de skjuvspänningar var den högsta och lägst i de främre och bakre områden, respektive), föreslårning att högre skjuvspänning inducerade mer ROS produktion. Också, var detta CSS chip som används för att studera produktionen av ROS som svar på olika koncentrationer av α-tokoferol, var en antioxidant av en form av vitamin E. Celler stimuleras av skjuvspänning plus α-tokoferol av 0, 3,2, 12,5, 21,9 och 25 | j, g / ml. Såsom visas i figur 1E, för α-tokoferol koncentrationer som är lägre än 21,9 | ig / ml, minskade fluorescensintensiteten när koncentrationen ökade, vilket tyder på effekten av α-tokoferol i att minska produktionen av ROS. Emellertid, som koncentrationen ökade till 25 ^ g / ml, medelintensiteten ökade också, vilket tyder på att denna höga koncentration av α-tokoferol inte eliminera mycket ROS jämfört med lägre koncentrationer.
The Chemical-elektriska fält (CEF) Chip
CEF-chip är framställt av en 1 mm tjock PMMA och ett 0,22 mm dubbelhäftande tejp med fluidic kanaler mönstrade på det (figur 2A och 2B). På samma sätt skapar "julgran" struktur fem relativa koncentrationerna av 0, 1/8, 1/2, 7/8, och en i de fem kulturområden. Dessutom är dessa fem parallella områden ansluten vinkelrätt för att bilda en fluidbana som är analogt med en elektrisk krets. Det elektriska fältet som genereras inom en kultur område är relaterat till den ledningsförmågan hos fluidet, varvid tvärsektionsarean hos kanalen, och den likström (DC), som passerar genom området. Enligt Kirchhoffs spänningslag och Ohms lag, strömmarna i de fem kulturområden är 0,49 I, 0,25 I, 0,13 I, 0,08 I, och 0,05 jag, respektive, där jag är den applicerade DC (figur 2C). Detta chip är fäst, via 0,22 mm tjock dubbelhäftande tejp, till en petriskål för odling av lungcancer CL1-5 celler för att observera cellmigrering och production av ROS som svar på olika kemiska koncentrationer och elektriska fält.
Först, var detta chip som används för att studera produktionen av ROS som svar på olika koncentrationer av honokiol, olika styrkor av EF och kombinerade behandlingar av båda. Honokiol, en liten molekyl polyphenolen isolerats från släktet Magnolia, befanns ha angiogeneshämmande, antiinflammatoriska och antitumöregenskaper i prekliniska studier 28. Såsom visas i figur 2D, producerat ROS var nästan densamma för EF lägre än 67 mV / mm, men ökades med ökande EF över detta värde. Figur 2E visar att enligt kombinerade behandlingar av elektriska fält och honokiol, ROS nivå stannade nästan densamma, vilket indikerar att honokiol hämmade produktionen av exogena ROS (dvs.., ROS relaterade till EF stimulus), särskilt under högre EF. Migrations cell under en enda eller samexisterande kemisk/ elektriska stimuli undersöktes också med hjälp av denna CEF chip. Som ses i figur 2F, utan tillsats av honokiol, ökade vandringshastigheten som EF hållfastheten ökas. Efter tillsats av honokiol av olika koncentrationer, minskade migreringshastighet i allmänhet, vilket tyder på att honokiol reducerad cellmigration möjligen via inhibering av produktionen av ROS. Migreringen riktadhet visas i figur 2G. I närvaro av EF endast, lungcancerceller uppvisade framträdande riktad migrering mot anoden (med negativa värden). Efter tillsats honokiol olika koncentrationer, fanns en liten minskning av migrations riktadhet för alla EF-stimulerade områden.
Figur 1: The Chemical-skjuvspänning (CSS) chip som används för att studera effekterna av kemikalier och skjuvspänningar på lungcancerceller 2.3
(A) Tre skikt av PMMA substrat binds samman via två dubbelsidiga tejper att bilda CSS chip. (B) Den integrerade CSS chip. (C) Topp: Fluorescent och ljus-fält bilder av CL 1-5 celler efter behandling med olika koncentrationer av H2O 2. Skalstreck = 50 | im. Nederst: Mean fluorescensintensitet med SEM ritas på olika koncentrationer av H2O 2. (D) Överst: Fluorescerande bilder av CL 1-5 celler under olika skjuvspänningar. Skalstreck = 50 | im. Nederst: Mean fluorescensintensitet med SEM ritas på olika skjuvspänningar. (E) Överst: Lysrör och ljusfält bilder av CL 1-5 celler efter stimuleras med skjuvspänning med olika koncentrationer av α-tokoferol. Skalstreck = 50 | im. Nederst: Mean fluorescensintensitet med SEM ritas på olika koncentrationer av α-tokoferol. Data presenteras här wsom ursprungligen publicerades i 23 referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: The Chemical-elektriska fältet (CEF) chip som används för att studera effekterna av kemikalier och elektriska fält på lungcancerceller 22.
(A) Ett skikt av PMMA är bunden på en odlingsskål via en dubbelhäftande tejp för att bilda den CEF chip. (B) Den fluidiska mönstret i CSS chip. (C) Den ekvivalenta elektriska kretsen av mikroflödessystem chip. (D) Vänster: Lysrör och ljusfält bilder av CL 1-5 celler efter behandling med olika styrkor av EF. Skalstreck = 50 | im. Höger: Genomsnittlig fluorescerandeintensitet med SEM ritas på olika styrkor av EF. (E) Vänster: Lysrör och ljusfält bilder av CL 1-5 celler efter behandling med kombinerad honokiol och EF. Skalstreck = 50 | im. Höger: Genomsnittlig fluorescensintensitet med SEM ritas på kombinerad honokiol och EF. (F) Migrations andelen CL1-5 celler efter behandling med EF endast (markerade som kontroll) och kombinerade honokiol och EF (markerad som honokiol). (G) Migreringen riktadhet av CL1-5 celler efter behandling med EF endast (markerade som kontroll) och kombinerade honokiol och EF (markerad som honokiol). Data som presenteras här publicerades ursprungligen i referens 22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PMMA-baserade chips tillverkas med hjälp av laserablation och skrift som är billigare och enklare metoder i jämförelse med PDMS-baserade chips som kräver mer komplicerade mjuk litografi. Efter att utforma en mikroflödessystem chip, kan tillverkning och montering ske inom bara fem minuter. Det finns några viktiga steg att uppmärksamhet bör ägnas åt att utföra experimentet. Den första är "montera" fråga. Adaptrarna ska vara limmade på rätt sätt till den översta lagret av chipet. Lim kan läcka in fluidic kanaler om för mycket används, och vätska kan läcka ut ur chipet om alltför lite lim används. Även i montering av PMMA substrat och dubbelsidiga band, är det viktigt att utöva påtryckningar för att pressa hela chip tätt för att förhindra vätskeläckage. Den andra är den "bubbla" fråga. För att avlägsna bubblor, är 1 x PBS kontinuerligt strömma in i fluidkanalen för en eller två minuter vid en flödeshastighet av 20 | il / min och sedan chipet är placed inuti en inkubator över natten under 5% CO2 vid 37 ° C. Om det finns bubblor kvar inom fluidic kanaler, kommer flödet att vara olikformig, vilket icke-homogen kemisk koncentration och EF distribution. Den tredje är "cellbelastning" fråga. Antalet celler laddade in i odlingsområdena bör vara väl kontrollerad. Om cellantalet är för låg, bör många experimentella körningar genomföras för att samla in tillräckligt med data för statistisk ändamål. Om cellantalet är för hög, kommer det att vara svårt att skilja enskilda celler och kvantifiera deras migration.
I CSS-chip, en "julgran" struktur i kombination med en triangulär kulturområde genererar olika kemiska koncentrationer i fem områden, var och en med en skjuvspänning gradient. Fluidic skjuvspänningar var kända för att påverka den bifogade filen, morfologin, migreringen och aktiviteten hos celler. Skjuvspänningar så låga som 0,25 till 0,6 Pa kan samverka cellvidhäftningOch ännu högre värden av spänningar (0,5 -10 Pa) rapporterades att avlägsna vidhäftande celler 29. Laminära skjuvspänningar som sträcker sig från 0,8 till 1,5 Pa-inducerad celljustering i flödesriktningen 30, och till och med lägre värden (0,1-1 Pa) var kända för att påverka cellulär morfologi och permeabilitet 29. Dessutom glatta muskelceller som utsätts för skjuvspänningar av 2-120 Pa upplevde en nedgång i antalet celler 31. Lu et al. rapporterade konstruktion och tillverkning av mikroflödes skjuvning anordningar för kvantitativ analys av celladhesion 27. Skjuvspänningen inom fluidic kanal modifierades genom att ändra dimensionerna på kanalen. Chin et al. beskrev en hemodynamisk Lab-on-a-chip-system för att styra flödeshastigheten av odlingsmediet i mikro-kanalen för att efterlikna flödesprofilen av blodet i kärlet 32. Skjuvspänningen inom fluidic kanal modifierades genom att ändra flödeshastigheten för mediet. iSE två enheter, trots en skjuvspänning av några värden kan genereras, var bara ett enda värde som finns inom ett kulturområde på en gång. Som jämförelse har den föreliggande CSS chip fördelen att tillhandahålla en skjuvspänning gradient i ett triangulärt område, vilket ökar den experimentella genomströmning speciellt för användning som screening syfte.
I CEF-chip, odlings områden i "julgran" struktur är vinkelrätt anslutna för att bilda en fluidbana som är analogt med en elektrisk krets. Vid en tillämpad likström, är fem EF hållfast genereras inuti odlingsområden med vardera med ett flöde av en specifik kemisk koncentration. Konventionellt electrotactic Experimenten utfördes på petriskålar där problem med oprecisa EFS medelavdunstnings, stor cell / reagensförbrukningen och ökad Joule uppvärmning kan uppstå. Slutna, miniatyr mikroflödessystem enheter vinna effektivt dessa nackdelar. Till exempel, för att studera electrotaxis of humana blod minnes-T-celler, Lin et al. rapporterade en plast mikroflödessystem enhet som innehåller två identiska, sida vid sida mikrokanaler, två modifierade pipettspetsar tjänade som medel reservoarer och två platinaelektroder för EF programmet 15. För att öka genomströmningen var PMMA-baserade electrotactic chips tillverkas för att ge flera EF styrkor i en enda enhet 12,33. Även mikroflödessystem enheter kan generera kontrollerbar kemisk och elektrisk stimuli samtidigt är av stort intresse. Li et al. fabricerade en PDMS-baserade mikroflödessystem enhet för att generera en eller samexisterar kemiska gradienter / EF för att undersöka kemotaktiska eller electrotactic migration av T-celler 14. Kao et al. Använde en liknande mikroflödessystem enhet för att modulera kemotaxi av lungcancerceller med hjälp av EF 12. I dessa två enheter, var en Y-form struktur appliceras för att skapa en stabil koncentrationsgradient i en enda tillämpad EF. Hou et al. rapporterade en flerkanalig-dubbel-elektriskt fält chip för att studera samtidigt effekten av kemikalier och EF på lungcancerceller 21. Denna enhet kunde ge 8 kombinationer av elektriska / kemiska stimuli (2 elektriska x 4 kemiska) i ett experiment. Även genomströmningen ökade, var detta chip kapacitet begränsade till (1) endast en EF hållfasthet (plus en nolla som kontroll), och (2) fyra sprutpumpar krävs för att pumpa kemikalier i fyra oberoende kanaler. Som jämförelse har den föreliggande CEF chip fördelen att generera fem EF styrkor tillsammans med fem kemiska koncentrationer via en enda uppsättning elektroder och 2 sprutpumpar.
Även om dessa chips är lätt att tillverkas, har de vissa begränsningar. För det första kan endast fem "särskilda" koncentrationer och fem "särskilda" EF styrkor genereras. För det andra, bredden hos fluidkanalen kan inte vara mindre än 1 mm på grund av fokuseringen avCO 2 laserstråle. Men genom att exakt styrning av kemiska koncentrationen i inloppet och den elektriska ström som passerar genom fluidkanalen, eventuella koncentrationer och EF styrkor kan uppnås på odlingsområden. Sammanfattningsvis nuvarande CSS och CEF chips kan tillhandahålla celler med styr enda eller samexisterande kemisk / elektrisk / skjuvspänning stimuli. I en enda CSS-chip, kan fem olika kemiska koncentrationer i kombination med en skjuvspänning gradient alstras. Dessutom, i en enda CEF-chip, fem olika kemiska koncentrationer i kombination med fem EF styrkor kan skapas. Genom att öka de grenar av den "julgran" struktur, kan genomströmningen av dessa marker ökas ytterligare. Dessa marker är visat sig vara ett enkelt, tidsbesparande, tillförlitlig och hög genomströmning plattform för studier av cellulära beteende under kemisk / elektrisk / skjuvspänning stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Cell culture medium |
| Trypsin | Gibco | 25300-054 | detach cell from the dish |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | Cell culture medium |
| 10 cm cell culture Petri dish | Nunc | 150350 | Cell culture |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Cell Counting Equipment |
| PMMA | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| Adaptor | Customized | Customized | Microfluidic chip |
| 0.07/0.22 mm double-sided tape | 3M | 8018/9088 | Microfluidic chip |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | Salt bridge |
| 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate | Sigma | D6883 | Intracellular ROS measurement |
| Indium tin oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | Heater |
| Proportional-integral-derivative controller | JETEC Electronics Co. | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| Thermal coupler | TECPEL | TPK-02A | Temperature controller |
| CO2 laser scriber | Laser Tools & Technics Corp. | ILS2 | Microfluidic chip fabrication |
| Syringe pumps | New Era | NE-300 | Pumping medium and chemicals into the chip |
| Power supply | Major Science | MP-300V | Supplying direct currents |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 | Monitoring cell migration |
| Inverted fluorescent microscope | Nikon | TS-100 | Monitoring cell migartion and fluorescencent signals |
| DSLR camera | Canon | 60D | Recording bright-field images |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi1 | Recording fluorescent images |
| super glue | 3M Scotch | 7004 | Attaching adaptors to PMMA substrates |
| AutoCAD | Autodesk Inc. | Designing microfluidic chips | |
| DMSO | Sigma | D8418 | Dissolving DCFDA |
| ImageJ | National Institutes of Health | Quantifying fluorescent intensities and cell migration |
References
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
- Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- Adler, J.
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107 (2014).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
- Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
- Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
- Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
- Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
- Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117 (2012).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007 (2014).
- Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15 (2016).
- Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108 (2013).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
- Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
- Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
- Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
- Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
- Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
- Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
