Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تدفق الفرز وإكسوم التسلسل من خلايا ريد-ستيرنبرغ من الليمفاوية الكلاسيكي هودجكين

Published: June 10, 2017 doi: 10.3791/54399
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6
1Innovation Laboratory, Center for Molecular Oncology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Flow-Sorting Core Facility, Weill Cornell Medical College, 3Department of Laboratory Medicine, University of Washington, 4Department of Physiology and Biophysics, Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medical College, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College, 6Department of Laboratory Medicine, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

هنا، نحن تصف مجتمعة التدفق الخلوي سايتوميتريك الفرز والمدخلات المنخفضة، الجيل المقبل من بروتوكول بناء مكتبة مصممة لإنتاج عالية الجودة، بيانات كاملة إكسوم من خلايا هودجكين ريد-سترنبيرغ (هرس) من سرطان الغدد الليمفاوية الكلاسيكي هودجكين (تشل).

Abstract

خلايا هودجكين ريد-ستيرنبرج من سرطان الغدد الليمفاوية الكلاسيكي هودجكين توزع بشكل ضئيل ضمن خلفية من الخلايا الليمفاوية الالتهابية وعادة ما تشكل أقل من 1٪ من كتلة الورم. المواد المشتقة من الورم السائب يحتوي على محتوى الورم في تركيز غير كاف للتوصيف. لذلك، يتم وصف مضان تنشيط خلية الفرز باستخدام ثمانية الأجسام المضادة، وكذلك الجانب إلى الأمام مبعثر، هنا كوسيلة للفصل بسرعة والتركيز مع آلاف عالية النقاء من الخلايا هرس من الورم لدراسة لاحقة. وفي الوقت نفسه، لأن البروتوكولات القياسية لتسلسل إكسوم عادة ما تتطلب 100-1،000 نانوجرام من الحمض النووي المدخلات، والتي غالبا ما تكون مرتفعة جدا، حتى مع تدفق الفرز، ونحن نقدم أيضا الأمثل، وانخفاض المدخلات بروتوكول بناء مكتبة قادرة على إنتاج عالية الجودة البيانات من أقل من 10 نانوغرام من الحمض النووي المدخلات. هذا المزيج قادر على إنتاج مكتبات الجيل التالي مناسبة لالتقاط التهجين لكامل هزوم الطعوم أو أكثر تركيزا لوحات المستهدفة، كما هو مطلوب. تسلسل إكسوم من الخلايا هرس، عند مقارنته مع خلايا صحية أو T إنتراتومور، يمكن التعرف على التعديلات الجسدية، بما في ذلك الطفرات، والإدراج والحذف، ونسخة نسخ التعديلات. هذه النتائج توضح البيولوجيا الجزيئية للخلايا هرس وقد تكشف عن سبل للعلاج المخدرات المستهدفة.

Introduction

وقد أدى التقدم في علم الجينوم السرطان نتيجة لتسلسل الجيل القادم إلى اختراقات كبيرة في تحديد الأهداف العلاجية وفي التكهن للعديد من الأورام الدموية وغير الدموية. يتم إدخال استراتيجيات جديدة للعلاج الفردي على أساس التعديلات الجينية محددة في العديد من أنواع الورم (مراجعة في المراجع 1 ، 2 ). على الرغم من التقدم الملحوظ في علم الجينوم اللمفاوية، الجينوم من الخلايا هرس الورم في هيمجكين الكلاسيكيه الكلاسيكي (تشل) لم تستكشف. وقد عرقلت التحقيقات من ندرة الخلايا هرس الأورام ضمن المكروية رد الفعل، مما يجعل من الصعب عزل السكان خلية هرس النقي 3 .

وقد تم تطوير طريقة لعزل خلايا هرس قابلة للحياة من الأورام الأولية من قبل فروم وآخرون. 4 ،المرجع "> 5 ، 6. يستخدم الأسلوب كوكتيل ثمانية الأجسام المضادة، والتي تتكون من CD30، CD15، CD40، CD95، CD45 CD20، CD5، و CD64، لتحديد لا لبس فيه خلايا هرس من تعليق الورم تشل.باستخدام هذه المنهجية، ونحن قادرة على عزل ما لا يقل عن 1000 خلية هرس قابلة للحياة من تعليق خلية جديدة أو مجمدة من خزعات الورم تتكون من ما لا يقل عن 10 7 خلايا (حوالي 10 ملغ من الأنسجة)، والنقاء أكبر من 90٪ عن طريق تحليل التدفق الخلوي ويقدر أن يكون أقل من 80٪ من قبل التحليل الجيني إكسوم من عشر حالات متتالية.

لقد صقلنا تقنية عزل الخلايا الخلوية الخلوية التي خففت كثيرا من العملية، مما يسمح للعزلة السريعة لآلاف الخلايا القابلة للحياة من الخلايا الجذعية الأولية من الأورام تشل الأولية 7 . لقد استخدمنا هذه التقنية لإنتاج ما يعتقد أنه أول تسلسل إكسوم كامل من الخلايا السرطانية في الحالات الأولية من سرطان الغدد الليمفاوية هودجكين. دراساتنا تثبت ثه جدوى عالية الإنتاجية والدراسات على نطاق الجينوم من الحالات تشل الفردية وأدت بالفعل إلى التعرف على التعديلات الجينية الجديدة مع إمكانية تفسير جوانب تشل المرضية.

كما طورنا خط أنابيب للاستفادة من الحمض النووي المستخرج للدراسات الجينية عالية الإنتاجية. من أجل تحقيق نتائج موثوقة من عدد قليل من 1000 خلايا هرس فرزها (الحد الأدنى التي تم الحصول عليها من الحالات المتسلسلة)، كما قمنا بتطوير تعديل الجيل القادم من الحمض النووي إجراء بناء مكتبة 8 التي سمحت لنا لزيادة كفاءة ربط المحول وتوليد مكتبات قسم الحمض النووي دون تضخيم المفرط. هذا الأسلوب يسمح لتحليل العينات السريرية الروتينية والكشف عن الطفرات المتكررة والتغيرات الكروموسومية 7 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تجهيز الأنسجة وتجميدها

  1. جمع الأنسجة العقدة الليمفاوية في الفوسفات مخزنة المالحة (بس) أو روزويل بارك المعهد التذكاري المتوسطة (رمي) وعملية في غضون 24 ساعة من جمع. نقل استئصال الأنسجة العقدة الليمفاوية 9 إلى طبق بتري تحتوي على 10 مل من رمي مع 2٪ مصل العجل الجنين (فس) وتفتتح بدقة مع شفرة مشرط جديدة. استخدام الجزء الخلفي من المكبس حقنة 10 مل لمزيد من طحن / فصل الأنسجة.
  2. نقل السائل إلى أنبوب مخروطي 50 مل من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون. شطف طبق بتري والمرشح مع 10 مل إضافية من رمي 2٪ فس.
  3. الحصول على عدد الخلايا باستخدام إما عداد خلية الآلي أو عدادة الكريات.
    ملاحظة: عموما، على الأقل 2 × 10 7 خلايا من المتوقع من حوالي 5 مم 3 من الأنسجة العقدة الليمفاوية تشل. ومن المتوقع وجود أكثر من 80٪، ولكن قد تختلف حسب العينة.
  4. تدور أسفل الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة و أسبيراتي طاف. وضع أنبوب يحتوي على بيليه الخلية على الجليد.
  5. قبل البرد تجميد المتوسطة على الجليد. ريسوسبيند الخلايا في وسط تجميد الباردة بتركيز 2 × 10 7 / مل و ريسوسبيند أنه بيبتينغ. لا دوامة. احتضان تعليق على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  6. قسامة العينة 1 مل / قارورة كريو (قبل المبردة على الجليد). نقل قارورة إلى -80 درجة مئوية الفريزر لمدة 1-2 أيام ونقلها مرة أخرى إلى النيتروجين السائل.

2. إعداد تعليق خلية لفرز الخلية

ملاحظة: كل لوط من الأجسام المضادة يجب أن يكون بشكل صحيح باستخدام 10 مليون خلية في حجم تلطيخ 300- μ.. ويمكن استخدام الدم المحيطي لجميع الأجسام المضادة باستثناء CD30، الذي خط الخلية KMH2 ارتفعت إلى الدم المحيطي يمكن أن تستخدم لمعايرة 10 . نبدأ عموما مع حجم الموصى بها الصانع من الأجسام المضادة وأداء اثنين من التخفيفات اثنين أضعاف وزيادة اثنين أضعاف (أربع نقاط البيانات)لكل الكثير من المعايرة الأجسام المضادة. على سبيل المثال، إذا كان المصنع يوصي حجم 10 ميكرولتر، ونحن إجراء المعايرة باستخدام 2، 5، 10، و 20 ميكرولتر وحدات التخزين.

  1. تعيين حمام مائي إلى 37 درجة مئوية. بريمكس كمية تيترد من الأجسام المضادة في قارورة زجاجية داكنة وإضافة بس + 2٪ بسا لحجم كوكتيل الكلي من 100 ميكرولتر.
    ملاحظة: على الرغم من أننا نوصي عيار الأجسام المضادة، ويمكن استخدام المجلدات التالية كنقطة انطلاق: CD64، 20 ميكرولتر. CD95، 5 ميكرولتر. CD30، 20 ميكرولتر. CD5، 10 ميكرولتر. CD20، 10 ميكرولتر. CD15، 20 ميكرولتر. CD40، 5 ميكرولتر. و CD45، 10 ميكرولتر.
  2. نقل القارورة من النيتروجين السائل في دلو الثلج التي تحتوي على الجليد الجاف لمنع الذوبان. قبل الحارة 50 مل من ذوبان المتوسطة التي تحتوي على رمي / 20٪ فس / الدناز (100 ميكروغرام / مل) في أنبوب مخروطي 50 مل في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  3. نقل 45 مل من ذوبان المتوسطة إلى أنبوب جديد والحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية. ذوبان الجليد بسرعة الخلايا عن طريق عقد قارورة المبردة في الخفافيش المياه 37 درجة مئويةساعة حتى يبقى جزء صغير جدا المجمدة.
  4. صب محتويات قارورة في أنبوب يحتوي على 45 مل من ذوبان المتوسطة. شطف قارورة المبردة فارغة 2 مرات مع 1 مل من ذوبان المتوسطة والجمع بين الشطف.
  5. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح للهضم الدناز وإعادة توازن الخلية. تدور أسفل الخلايا في 500 x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح طاف.
  6. ريسوسبيند الخلايا في حوالي 200 ميكرولتر من ذوبان المتوسطة عقد الظهر (5 مل) والسماح لها موازنة لدرجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق. استرداد> 70٪ من الخلايا القابلة للحياة المجمدة ومن المتوقع.
    ملاحظة: اختياريا، لمزيد من نقاء الخلايا هرس فرزها التي قد تكون روزيتد من قبل الخلايا التائية المرفقة، كوكتيل من الأجسام المضادة غير المسماة يمكن أن تضاف في هذه الخطوة (انظر البروتوكول الاختياري).
  7. إضافة 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (رت)، محمية من الضوء. إضافة 3 مل من الفرز المتوسطة، وتدور أسفل الخلايا في 500 x جلمدة 10 دقيقة، ونضح طاف.
  8. ريسوسبيند الخلايا في 1 مل من الفرز المتوسطة ونقلها إلى 5 مل أنبوب تدفق أعلى مصفاة.
  9. شطف كل من أنبوب مخروطي 50 مل ومصفاة الخلية مع 1 مل إضافية من فرز الخلايا المتوسطة والمكان على الجليد.

3. (بروتوكول اختياري) T خلية حجب روزيت

ملاحظة: يتم روت الخلايا هرس الخلايا التائية في أقسام الأنسجة وتعليق الخلية، وهذه الخلايا التائية قد يحتمل أن تلوث جزء هرس فرزها. يتم بوساطة هذه التفاعلات CD54 و CD58 على خلية هرس ملزمة ل لفا-1 و CD2 على الخلايا التائية 4 ، 11 . يمكن منع هذه التفاعلات مع الأجسام المضادة غير المسماة لهذه الجزيئات الالتصاق.

  1. قسامة 100،000 إلى 500،000 الخلايا في 100 ميكرولتر من رمي.
  2. احتضان تعليق الخلية مع الأجسام المضادة غير المسماة ل CD2، CD54، CD58، و لفا-1 (10 ميكرولتر لكل منهما) على الجليد لمدة 1 ساعة. تييمكن تعليقه الآن تعليق خلية مع الأجسام المضادة الفلورسنت.

4. HRS-، B-، و T- خلية العزلة باستخدام فرز الخلايا

ملاحظة: على الرغم من أننا استخدمنا أداة ترتيب البحوث الخاصة باستخدام 5 أشعة الليزر (انظر جدول المواد)، أي فارز مع القدرة على الكشف عن فلوروكروميس المستخدمة في لوحة الأجسام المضادة يجب أن تكون كافية. تنفيذ الخطوات أدناه يتطلب الألفة مع برنامج 12 وظيفة والمعرفة الأساسية لعمليات فرز فارز الخلية. يرجى الرجوع إلى دليل البرامج عبر الإنترنت للحصول على تعليمات مفصلة.

  1. إعداد عداد الكريات:
    1. تشغيل الكمبيوتر وتسجيل الدخول. السلطة على بسك (ومنافذ بسك)، ومن ثم السلطة على مقياس الكريات. انتظر 90 ثانية على الأقل لوحدة المعالجة المركزية الداخلية من عداد الكريات لبدء، ومن ثم فتح برنامج التحكم بالليزر والتحقق من أن يتم تشغيل جميع الليزر على. إطلاق برنامج عداد الكريات 13 وتسجيل الدخول.
    2. ضمن برنامج عداد الكريات، انقر على "مقياس الكريات → عرض تكوينات." عند فتح مربع الحوار الخاص بالبرنامج الفرعي للتكوين، قم بتمييز التكوين المخصص 130 ميكرون ثم انقر فوق "تعيين التكوين" و "موافق". قم بإنهاء برنامج التكوين الفرعي.
    3. لاحظ مربع الحوار في برنامج عدادات الكريات وانقر على "استخدام إعدادات كس & T". تثبيت فوهة 130 ميكرون في الصك وتحويل تيار على من خلال النقر على زر "X" الأحمر في نافذة تيار. السماح للأداة إلى الاحماء لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    4. قم بتشغيل فحص األداء على األداة باستخدام الطريقة المطلوبة) يتم تضمين وحدة برامج تتبع األداء مع فارز الموصوف هنا، راجع دليل البرامج) ص 117 - 122 (والمعيار المرجعي) راجع مواد المعيار المستخدم في هذا الإعداد).
      1. انقر فوق "عداد الكريات → ست"، تأكد من أن يتم تعيين الحقل "تشاراكتريز" إلى "تشيكk "الأداء" في القائمة المنسدلة، ثم انقر فوق "تشغيل". عند المطالبة بواسطة البرنامج، قم بتحميل أنبوب من الجسيمات المرجعية على مرحلة العينة وانقر على "موافق".
      2. بعد اكتمال تشغيل، انقر فوق "إنهاء" وإغلاق وحدة البرنامج. بعد الانتهاء من برنامج عداد الكريات إعادة الاتصال إلى عداد الكريات، انقر فوق "استخدام إعدادات كس & T" في مربع الحوار الذي يظهر.
    5. حدد التأخير الصحيح للتخفيض باستخدام ميزة تأخير الإفلات التلقائي لبرنامج الكهربية (انظر ص 154 - 161 من دليل البرامج).
      1. افتح تجربة "دروب ديلاي" في نافذة "بروزر" الخاصة ببرنامج مقياس الكريات، وقم بتثبيت أنبوب من جسيمات المعايرة في مرحلة العينة، وانقر على "تحميل" في نافذة "داتابوارد أكيسيتيون داشبوارد". تشغيل ميزة مراقبة تيار تلقائي من خلال النقر على زر "بقعة حلوة" في نافذة "تيار". ترك هذه الميزة في جميع الأوقات لجميع المتابعينز الخطوات.
      2. بدوره على الجهد لوحة انحراف عن طريق النقر على زر "الجهد" في نافذة الجانب تيار، ومن ثم تشغيل الفرز اختبار عن طريق النقر على زر "اختبار فرز" مباشرة بجوار زر "الجهد".
      3. اضبط جميع إعدادات البث الجانبي على الصفر باستثناء تيار الجانب الأيسر. اضبط إعداد دفق الجانب الأيسر بحيث تكون مرئيات تيار مرئية في نافذة البث الجانبي. انقر فوق الزر "فلتر البصرية" وتحقق من أن الجانب الأيسر بقعة تيار تقع داخل المربع الأيسر الذي يظهر في المنطقة السوداء من نافذة تيار الجانب.
      4. اضبط إعداد تيار الجانب الأيسر إذا لزم الأمر. إيقاف فرز الاختبار عن طريق النقر على زر "اختبار نوع" مرة أخرى. في نافذة "المتصفح"، قم بتوسيع عنصر "أوراق العمل العالمية" من تجربة "دروب ديلاي" من خلال النقر على "+".
      5. انقر نقرا مزدوجا على "سورت layout_001" لفتح تخطيط الترتيب، تحقق من الفحص البصريأيون أن السكان الفرز الأيسر لديه "P1" المخصصة له، وانقر على "فرز" في إطار "فرز تخطيط". في نافذة "تصنيف التنسيق"، انقر على "التأخير التلقائي" ثم "تشغيل".
      6. عند اكتمال التشغيل، انقر على "إنهاء". تثبيت أنبوب من الماء منزوع الأيونات معقم على مرحلة العينة وانقر على "تحميل" في نافذة "اقتناء لوحة". تشغيل أنبوب الماء لمدة 5 دقائق على الأقل لمسح جزيئات الاختبار المتبقية من الصك قبل الشروع.
    6. قم بتشغيل ضوابط التعويض) باستخدام حبات التعويض من جدول بيانات المواد أو ما يعادلها (باستخدام إعداد تعويض مضمن في برنامج الفرز) انظر ص 131 - 137 من دليل البرامج للحصول على تفاصيل إضافية (.
      1. أنشئ تجربة جديدة بالنقر على "تجربة جديدة للتجربة". في علامة التبويب "معلمات" من نافذة "حالة الأداة"، حذف المعلمات غير المستخدمة، إن وجدت. انقر على "كومبنسات التجربة"إعداد أيون إنشاء عناصر التحكم في التعويض ".
      2. في نافذة "المتصفح"، قم بتوسيع عينة "عناصر التحكم بالتعويض" بالنقر فوق علامة "+". تشغيل أنابيب التحكم التعويض دون تسجيل البيانات، وإذا لزم الأمر، وضبط الفولتية الكاشف (في علامة التبويب "معلمات" من نافذة "حالة الصك") بحيث السكان حبة ملطخة بشكل إيجابي لكل ملون بين قناة 10،000 و 100،000 و هي ألمع في قناة الكشف الأولية.
      3. اكتب الفولتية اللازمة لكل معلمة لكل أنبوب. تسليط الضوء على "السيطرة غير ملوثين" أنبوب تحت عينة "عناصر التحكم التعويض" من قبل واحد اليسار النقر عليه. تحميل أنبوب التحكم غير ملوثين على مرحلة العينة وانقر على "تحميل" في نافذة "السيطرة اقتناء".
      4. إدخال يدويا الفولتية تحديدها عن طريق تشغيل الضوابط التعويض الفردية في مجالات الجهد للكشف عن جميع المعلمات، وثم انقر فوق "تسجيل" في نافذة "التحكم في الاستحواذ". تشغيل جميع الضوابط التعويض المتبقية، وتسجيل البيانات دون تغيير أي إعدادات كاشف. تركيب أنبوب من الماء المعقم، منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق لمسح أي المواد المتبقية من الصك قبل الشروع.
  2. هرس خلية التباعد:
    1. الحصول على وتسجيل ما لا يقل عن 100،000 الأحداث للابحار الأولي في حين ضبط معدل التدفق للحصول على 3000-4،000 الأحداث / ثانية (انظر الخطوة 4.1).
      ملاحظة: قد يكون من الضروري إضافة إضافية فرز المتوسطة لتخفيف الخلايا إذا كان تركيز الخلية مرتفع جدا. وقف الاستحواذ.
    2. خلايا هرس بوابة باستخدام الخطوات المبينة في الشكل 1
      ملاحظة: في معظم الحالات تشل، بين 0.01٪ و 0.1٪ من الخلايا ستكون خلايا هرس.
  3. B- و T- خلية التباعد:
    1. تحديد الضوابط الجسدية (B والخلايا التائية) عن طريق النابضة من CD20 و CD5، ريسب(الخلايا اللمفاوية عن طريق CD45 / سش)، تليها CD20 مقابل CD5 (انظر الشكل 1 ).
    2. تيارات جمع الهدف إلى أنابيب جمع في ما قبل المبردة اتجاهين أو أربعة في اتجاه جمع الرف. قم بتعبئة أنابيب التدفق أو أنابيب الطرد المركزي 15 مل على الأقل في منتصف الطريق مع وسط جمع.
    3. تعيين هرس ومراقبة السكان إلى أنابيب جمع المناسبة في الإعداد نوع التالية تعليمات البائع. إعادة تشغيل اكتساب الخلية وبدء هذا النوع.
    4. جمع كل الخلايا هرس وتصل إلى 1 مليون ب والخلايا التائية. استهدف مجاري التجميع إلى أنابيب التجميع في رف تجميع رباعي أو ثنائي الاتجاه مبرد مسبقا.

5. استخراج الحمض النووي

  1. بيليه الخلايا التي تم جمعها بواسطة الطرد المركزي في 1.5 مل أنابيب مخروطية في 3000 x ج لمدة 10 دقيقة و ريسوسبيند مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لغسل الخلايا.
  2. بيليه مرة أخرى في 3000 x ج لمدة 10 دقيقة وإزالة طاف. كن حذرا جدا عدم الإزعاجبيليه صغيرة.
  3. إضافة 150 ميكرولتر من العازلة تحلل (أو حجم مناسب للعدة المستخدمة) إلى الخلايا غسلها والمزيج من قبل بيبتينغ صعودا وهبوطا.
    ملاحظة: يمكن للمرء تخزين المحللة الخلية في -70 درجة مئوية عند هذه النقطة، إذا لزم الأمر.
  4. بناء تجميع العمود عن طريق وضع عمود التصفية داخل الأنبوب وإضافة المحللة من الخطوة 5.5 إلى العمود. تدور التجمع في 13000 x ج لمدة 3 دقائق.
  5. إزالة مينيكولومن من التجمع وتجاهل السائل في أنبوب جمع. استبدال عمود صغير في أنبوب جمع.
  6. إضافة 650 ميكرولتر من حل غسل العمود إلى كل التجمع. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 13،000 × ز. تجاهل السائل من أنبوب جمع. كرر هذه الخطوة لما مجموعه 4 يغسل.
  7. تجاهل السائل من أنبوب جمع وإعادة تجميع التجمع مينيكولومن. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 13،000 x ج لتجفيف مصفوفة ملزمة.
  8. نقل مينيكولومن إلى أنبوب 1.5 مل جديدة وإضافة 25 ميكرولتر من 10 ملي تريس كل، والتيويفضل خطوة صوتنة لاحقة، أو نوكليس خالية من المياه ساخنة إلى 65 درجة مئوية. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وأجهزة الطرد المركزي التجمع في 13000 x ج لمدة 1 دقيقة. كرر مرة أخرى مع 25 ميكرولتر لما مجموعه 50 ميكرولتر.
  9. مزيج من شطف الحمض النووي عن طريق بيبتينغ صعودا وهبوطا وكمية باستخدام فلوريمتري 14 .

6. بناء المكتبة

  1. التحضير قبل البدء:
    1. إعداد سونيكاتور على مستوى المياه 12، كثافة 5، دورات / انفجار 200، ودرجة الحرارة 7.
    2. استنادا إلى كمية الحمض النووي المتاحة التي يحددها فلوريمتري وعلى التصميم التجريبي، وتحديد كمية من الحمض النووي لاستخدامها لبناء المكتبة.
      ملاحظة: نضع في اعتبارنا أنه إذا تم استخدام الحمض النووي قليلا جدا وجودة المكتبة للخطر، قد يكون هناك تطبيق القليل للمواد التي تركت وراءها لأغراض التحقق من الصحة. بالنسبة لكميات المدخلات دون المستوى المطلوب، كلما زادت كتلة المدخلات، كلما زادت الكمياتكلفة مكتبة التسلسل الناتجة. بعض المبادئ التوجيهية لهذا البروتوكول هي كما يلي: 10 نانوغرام ينبغي أن تسفر عن نتائج جيدة، و 50 نانوغرام يمكن اعتبار الحد الأقصى الخام.
    3. تقرر على المحول: إدراج نسبة المولي استنادا فضفاضة على القيم في الجدول 1 .
    4. حساب مقدار المهايئ لاستخدامه في الأزياء التالية:
      ملاحظة: عدد الشامات من المدخلات الحمض النووي، ن
      أنا. ن = 1.54e-12 -12 * كتلة الإدخال (بالنيوغرام) / (يعني حجم الشظية)
      ثانيا. عندما يكون متوسط ​​حجم الشظية 200 نقطة أساس، وهذا يبسط:
      n = 7.7e-15 * كتلة الإدخال (بالنيغرام)
      عدد الشامات من المحول لتشمل، a
      أنا. a = n * r
      حجم محول الأسهم لاستخدامها في محول خطوة الربط، v
      أنا. v (في μL ) = a / [ 10 -12 * محول الأسهمتركيز (في ميكرومتر )]
      ملاحظة: إذا كان تركيز محول منخفضة، لضمان أن المبلغ اللازم من محول يتم تضمينها، ويمكن استخدام حل محول لتخفيف الكواشف إصلاح نهاية بدلا من الماء.
      مثال: للحصول على 100 نانوغرام من الحمض النووي المدخلات مع حجم شظية متوسط ​​200 نقطة أساس، لمحول المولي المطلوب: إدراج نسبة 15: 1 ومحول تركيز الأسهم من 2 ميكرومتر، وحجم الموصى بها من محول لاستخدام 5.8 ميكرولتر.
    5. تعيين الباركود المفهرسة إلى العينات.
      ملاحظة: يجب ألا تحتوي المكتبات التي سيتم تجميعها معا في تفاعل تهجين أو حارة على خلية تدفق المنظم على أية مؤشرات زائدة عن الحاجة.
  2. بناء مكتبة - القص الحمض النووي:
    1. إضافة كمية كاملة من الحمض النووي لاستخدامها في أنبوب سونيكيشن. إذا كان حجم العينة التي تحتوي على الحمض النووي المدخلات وحدها هو أقل من 50 ميكرولتر، إضافة المخزن المؤقت إب يصل إلى 50 ميكرولتر الحجم الكلي والمزيج.
    2. يصوتن لمدة 30 s.
    3. إزالة الأنبوب وأداء سريع تدور في جهاز طرد مركزي مصغرة فقط بما فيه الكفاية لجمع أي رذاذ من الجزء العلوي من جدران ميكروتوب.
    4. كرر الخطوات من 6.2.2-6.2.3 لما مجموعه سبع جلسات صوت 30 ثانية لما مجموعه 210 ثانية من سونيكيشن.
      ملاحظة : لا تتردد في تجربة تقسيم 210 ثانية في جلسات أقل.
  3. بناء المكتبة - إصلاح نهاية، A- تايلينغ، ومحول ربط:
    ملاحظة: تجنب القيام بأي اختيار حجم قبل خطوة ير التضخيم مكتبة.
    1. اتبع تعليمات الشركة المصنعة 19 لإصلاح نهاية و A- تايلينغ بعد سونيكاتيون من الحمض النووي العينة.
    2. بعد A- تايلينغ، استخدم العدد المناسب من الشامات من محول (المحسوبة في الخطوة 6.1.3) في رد فعل. الجمع بين محول، شظايا الحمض النووي A-تايلد، والانزيم، والعازلة واحتضان بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية لمدة 16 ساعة تقريبا.
  4. ليبراري البناء - مكتبة التضخيم:
    1. إجراء تنظيف حبة من محول ربط رد فعل. بعد إضافة الخرز إلى المنتج ير، انتظر 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وضعه ضد موقف المغناطيسي وإزالة السوائل، وغسل مرتين في 200 ميكرولتر من الايثانول 80٪، وتجفيف حبات طويلة بما فيه الكفاية لإزالة معظم السائل دون الإفراط في التجفيف، وأزل الحمض النووي الخروج من الخرز بواسطة بيبتينغ 25 ميكرولتر من نوكليس خالية من المياه، كما اقترح، على الخرز بينما يبقى أنبوب ضد موقف المغناطيسي.
      ملاحظة: قد يكون من الممكن لتجربة مع الحفاظ على الخرز في البولي ايثيلين جلايكول
      (بيج) حتى بعد التضخيم بدلا من التخلص منها، ولكن هذا لم يتم اختبارها.
    2. وتشمل 0.6 ميكرولتر من 1: 1،000 التخفيف من الصبغة الخضراء لكل 50 ميكرولتر من مزيج الرئيسي ير. بدلا من ذلك، استخدم في الوقت الحقيقي ير متوافق مع صبغ صبغ الاختيار في الحجم المناسب للمعدات.
    3. برنامج تفاعل ير في 98 درجة مئوية ل45 ثانية من أجل تمسخ الأولي، تليها دورة من تمسخ، الصلب، وتمديد في 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، أو اختيار البرنامج المناسب إذا كان استخدام بديل انزيم البلمرة.
      1. تعيين الجهاز لاتخاذ بيانات مضان في 72 درجة مئوية لكل دورة. برنامج تمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة تليها عقد في 4 درجات مئوية لمدة غير محددة من الوقت. الاشعال ير لتضخيم المكتبة محول ليغاتد باستخدام الكواشف في الجدول التكميلي هي: أوليغو 1، آتغاتاسغكاكغاغا و أوليغو 2، كاغكاغاغاكاتاسغاغ
    4. تضخيم المكتبة باستخدام ظروف ير المذكورة أعلاه مع مراعاة قيم شدة مضان في الوقت الحقيقي مع البرنامج قر، ووقف قبل نهاية مرحلة النمو الأسي.
    5. بعد التضخيم، القيام تنظيف حبة القياسية (انظر الخطوة 6.4.1) باستخدام 0.8x حجم رد فعل التضخيم ريكوفإريد، عادة 0.8 × 50 = 40 ميكرولتر من الخرز. إضافة الخرز إلى المنتج ير والانتظار 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. وضعه ضد موقف المغناطيسي وإزالة السوائل، وغسل مرتين في 200 ميكرولتر من الايثانول 80٪، وتجفيف حبات طويلة بما فيه الكفاية لإزالة معظم السائل دون الإفراط في التجفيف، وأزل عن طريق إضافة نوكليس خالية من المياه إلى الخرز الجاف.
    7. تحديد الحمض النووي الناتج باستخدام قياس الفلور. تصور شظايا المكتبة للحجم؛ انظر القسم الخاص بتوقعات مراقبة الجودة لمزيد من التفاصيل.

7. إكسوم التهجين

  1. الجمع بين أربع مكتبات مع رموز شريط محول متميزة.
    ملاحظة: يتم استخدام كتلة من قبل فلوريمتري وحجم بواسطة هلام لحساب مولاريتي، ومن ثم يتم الجمع بين المكتبات في كميات متساوي الأقطاب لمجموع كتلة 1000 نانوغرام من المكتبة المجمعة. فمن الأفضل للحفاظ على جميع أزواج الورم العادي معا بدلا من فصلها إلى برك منفصلة.
  2. تطبيق بروتوكول التقاط إكسوم أوب كلاس = "كريف"> 15 والقيام 8 دورات ير بعد تنظيف الالتقاط. خيارات أخرى من أهداف الالتقاط قد يكون ممكنا.

8. تسلسل المضاعفة

  1. تسلسل التقاط تهجين واحد يحتوي على أربع مكتبات متعددة الإرسال في حارة واحدة على منصة التسلسل المشار إليها في جدول بيانات المواد 16 .
    ملاحظة: تكوينات بديلة ممكنة للمستخدمين المتقدمين الذين يرغبون في مزيد من التخطيط وتحسين الهدف قراءة عمق التغطية.

9 - التحليل (يمكن الاستعاضة عنها بخطوط أنابيب بديلة إذا رغبت في ذلك)

  1. سنبس والإندلس الصغيرة:
    1. بيانات الخريطة الخام إلى الجينوم المرجعي البشري، أوسك hg19، وذلك باستخدام الجحيم ويلر ألينر (بوا) 17 أو خوارزمية بديلة من الاختيار. تصفية أو علامة يقرأ مع نقاط جودة تعيين أقل من 20 و ير التكرارات باستخدام سامتولس 18 أو بيكاردريف "> 19.
    2. كشف المتغيرات النوكليوتيدات الجسدية والصغيرة إندلس في عينات هرس بالمقارنة مع الضوابط الجسدية خلية T باستخدام ستريلكا 20 أو المتصل البديل من الاختيار. تطبيق سنبف 21 للتعليق على الإخراج ستريلكا. إذا رغبت في ذلك، فحص منهجي موقع البديل عن التحف باستخدام عارض الجينوم المتكاملة (إيغف) 22 ، 23 .
  2. نسخ عدد التعديلات:
    1. حساب نسبة سجل تحويل " لتر " لكل الفاصل الزمني إكسوم الهدف " ط " من داخل المكتبة التعداد قراءة العادي في الورم ضد تلك من الطبيعي بالطريقة التالية:
      معادلة
      ملاحظة: c هو عدد من يقرأ تعيين لفاصل التقاط معين، ل هو إجمالي حجم المكتبة، ر يدل على الورم، و n يدل على وضعها الطبيعي.
    2. تصفية الفواصل مع عدم كفاية التغطية ( C t + C ن <100 يقرأ) لمزيد من التحليل. إجراء تجزئة الفاصل الزمني باستخدام دناكوبي v.1.0 24 من الموصل الحيوي في R.
      ملاحظة: النظر في الشرائح التي تكون فيها القيمة المطلقة للمتوسط لتر أقل من 0.5 لتكون محايدة للنسخ. ويمكن تصنيف الأجزاء المتبقية كمكاسب عدد النسخ، إذا كانت علامة متوسط لتر إيجابية (وبعبارة أخرى، هناك أكثر بكثير يقرأ في عينة الورم مما كانت عليه في العينة العادية بعد التطبيع)، أو نسخ عدد الخسائر، إذا كانت علامة من متوسط لتر سالب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وينبغي أن تؤخذ مؤامرة بيواناليزر بعد التضخيم مكتبة و 0.8 حبة تنظيف حبة. ينبغي للمرء أن يرى توزيع "عادي مثل" من أحجام الشظايا في النطاق المطلوب ( الشكل 2A ). الانحرافات من هذا الشكل، مثل "الكتف" واضحة في المنحنى، تشير إلى وجود عالية أو منخفضة الوزن الجزيئي قطعة أثرية. على سبيل المثال، يعرض الشكل 2b -2d أمثلة للمكتبات التي تحتوي على القطع الأثرية المرئية التي من المفترض ألا تكون متسلسلة. إذا تعرضت مكتبة للخطر بشكل كبير، قد يكون من المفيد تكرار بناء المكتبة إذا كان الحمض النووي متوفرا و / أو الفرز الخلية لبدء جديدة.

محول ديمر قد تحمل في بعض الأحيان من خلال أول حبة 0.8x تنظيف حبة. إذا حدث هذا، فإنه سيكون مرئيا كما ذروة حادة تتمحور حول 125 - 130 نقطة أساس (انظر الشكل(ه) 2 ج). في هذه الحالة، فإنه من المستحسن أن تكرار تنظيف حبة 0.8x إضافية وتكرار بيواناليزر لضمان الإزالة الناجحة لل ديمر.

باستخدام المواصفات الموضحة في هذا البروتوكول وتعدد تسلسل على مستوى أربع عينات لكل حارة في المنظم المدرجة في جدول بيانات المواد، وعمق متوسط ​​التغطية من 50 - 100X عبر الهدف (بعد إزالة المعلوماتية الحيوية من ير مكررة يقرأ) (انظر الشكل 3 أ ). وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي للمكتبات التي لم تكن مفرطة في التجميع والتي أسفرت عن مكتبات ذات تغطية كافية أن تنتج نسخا نظيفة من أرقام المؤامرات. خلال العمل المبکر، تم اختبار بروتوکول بناء المکتبات علی ثلاثة أوامر من حجم کتلة الإدخال، وتم اکتشاف نتائج متغیرة (انظر قسم المناقشة). نسخ عدد المؤامرات ولدت باستخدام مكتبة ولدت من 1 نانوغرام، وهو مبلغ دون الأمثل من الحمض النووي المدخلات، أسفرت عن مكاسب عدد النسخ الزائفة والخسائر ( الشكل 3B ، أسفل).

حوالي 70٪ من حالات تشل تحمل B2M و A20 الطفرات و / أو الحذف 7 . وتشمل الطفرات B2M في الغالب موقع البداية متعدية، أول موقع توقف اكسون، وأول موقع توقف اكسون. A20 الطفرات هي مزيج من خسائر عدد النسخ و إندلس. الطفرات تبدو وكأنها نسلي ويمكن استخدامها لتقدير محتوى الورم النسبي. إذا تم استخدام الخلايا التائية كضوابط جسدية، فإن تسلسل هرس سيظهر مكاسب عدد نسخ كبيرة في المواقف المقابلة ألفا مستقبلات الخلايا التائية ألفا / دلتا (14q11 - 12) ومواقع بيتا (7q32 - 35)، فضلا عن خسائر كبيرة في (14q32) وسلسلة ضوء كابا (2p11) (انظر الشكل 4 ). ويبين التسلسل الكلي مجموعة من 100 إلى 400 طفرات جسدية في كل حالة. نسخ عدد الاختلاف هو غاية vمن حالة إلى أخرى، مع بعض الحالات تظهر العديد من المكاسب والخسائر القطاعية وغيرها من الحالات التي تظهر سوى عدد قليل من التعديلات.

شكل 1
الشكل 1: مولتيباراميتر غابينغ لتدفق الفرز من هرس قابلة للحياة، B، والخلايا التائية. يتم عرض أسماء السكان على المؤامرات وتشير إلى السكان الأم لأي بوابة. ( A ) يظهر جميع الخلايا: في الرسم البياني فسك-H مقابل فسك-A، رسم بوابة سينغليتس التي تضم السكان مع النسبي فسك-H و فسك-A الزيادات. استبعاد دوبلتس التي لديها عالية فسك-A وانخفاض فسك-H. خلايا هودجكين كبيرة جدا. توسيع البوابة لتشمل عالية فسك-H و فسك-A الأحداث. ( ب ) استبعاد الحطام، والخلايا الميتة، وكرات الدم الحمراء غير المؤمن التي عادة ما يكون أقل فسك-A وزيادات طفيفة في سك-H دون قطع السكان قابلة للحياة (بوابة فيابل). ( C ) بوابة مونوكلير الخلايا علىفسك-A مقابل سك-H لاستبعاد المحببات مع ارتفاع سك-H؛ لاحظ أن البوابة تستخدم فقط لتحديد T و B الخلايا. ( D ) بوابة T سيلس تحديدها إيجابيا من قبل CD5 (الأخضر) دون CD20 و B سيلس (الأزرق)، والتي لديها CD20 التعبير دون CD5. ( E ) رسم بوابة أكبر على مؤامرة CD45 / سش، بما في ذلك 10-20٪ من الخلايا اللمفاوية وجميع الخلايا المحببة. ( F ) بوابة الأحداث CD30 إيجابية مع قاتمة إلى السلبية CD64 / فيتس التألق الذاتي. ( G ) بين CD30 الأحداث الإيجابية، بوابة CD40- والأحداث إيجابية CD95 (CD30 / 40/95 هرس بوابة والأحمر). (هل) مراقبة الميزات المناعية المؤكدة على الخلايا هرس. خلايا هرس عموما لا تعبر عن CD20 (المؤامرات H و L). يرتبط التعبير عن CD5 مع CD45 بسبب T- خلية رذاذ (I). فإن معظم الحالات تظهر التعبير عن CD15 وسوف تكون مشرقة ل CD71 ( J ). CD40 و CD95 التعبير عموما فوق مستوى الخلايا B و T، ريسب إكتيفيلي ( K ). وقد نشر هذا البحث أصلا في الدم 7 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: قطع توزيع حجم العينات بعد ربط ربط والتضخيم. من الناحية المثالية، ينبغي أن تتكرر المكتبات مع القطع الأثرية مرئية وليس التسلسل. ( أ ) مكتبة جيدة التشكيل؛ لا التحف مرئية. ( ب ) عدم التكافؤ في المنحنى يكشف عن مشكلة. (ج) ديمر محول كبير (الذروة في 128) وارتفاع الوزن الجزيئي قطعة أثرية (> 400 نقطة أساس). قد يتم تنظيف ديمر مع تنظيف حبة 0.8x إضافية. ( د ) كبيرة عالية الوزن الجزيئي قطعة أثرية.s / ftp_upload / 54399 / 54399fig2large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: قياسات مراقبة الجودة المعلوماتية الحيوية للمكتبات ذات الجودة العالية المصنوعة من 10 نانوغرام من دنا الإدخال مقارنة بالمكتبات منخفضة الجودة المصنوعة من 1 نانوجرام من دنا الإدخال. حجم وتوزيع عمق قراءة فريدة من توقعات التغطية. ( أ ) من المتوقع أن يكون متوسط ​​عمق التغطية 50 على الأقل عند استخدام 10-100 نانوغرام من الحمض النووي المدخلات. ( ب ) يصور كل من الفريقين نتائج تحليل تغير عدد النسخ التي تقارن بين بيانات المكتبتين المتسلسلتين. يتم رسم قطاعات مسبار إكسوني (المحور السيني) مقابل تغيير عدد النسخ على مقياس لوغ 2 (المحور الصادي) لكروموسوم ممثل واحد (شر 6). مقارنة البيانات من 10 نانوغرام منخفضة المدخلات مكتبة من إنتراتومورالدنا الخلايا التائية إلى 100 نانوغرام مكتبة المدخلات العادية من دنا الخلايا التائية إنتراتومورال من نفس الحالة لم تظهر نتائج إيجابية كاذبة كبيرة. وهذا هو، منخفضة المدخلات والمكتبات المدخلات العادية هي محايدة نسخة (أعلى). تم استدعاء العديد من التعديلات الإيجابية عدد خاطئة كاذبة عدد النسخ عندما تم مقارنة البيانات من مكتبة 1 نانوغرام منخفضة المدخلات من دنا T- إنتراتومورال الخلية إلى 100 نانوغرام مكتبة المدخلات العادية من داخل الخلية T- دنا خلية من نفس الحالة (القاع). وقد نشر هذا البحث أصلا في الدم 7 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل (4): تكرار المكاسب والخسائر في عدد النسخ، مع خلايا الورم (هرس الأولية وخطوط الخلايا) مقارنة مع خلايا T صحية إنتراتومور من كاس الأوليةوفاق. إذا تم استخدام الخلايا التائية باعتبارها السيطرة الجسدية ضد الخلايا المستمدة من خلية هرس وخلايا الخلايا B، ويمكن رؤية المكاسب المتكررة في مستقبلات الخلايا التائية ألفا / دلتا وبيتا. وبالمثل، يمكن الكشف عن الخسائر المتكررة في السلاسل المناعية الثقيلة وكابا. وقد نشر هذا البحث أصلا في الدم 7 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

دنا كتلة الإدخال (n) 1-10 نغ 25 نغ 100 نغ
محول: إدراج نسبة المولي (ص) 65: 1 25: 1 15: 1

الجدول 1: الحمض النووي فيوضع كتلة والمطابقة المقابلة: إدراج نسبة المولي. القيم في هذا الجدول يمكن استخدامها كدليل لحساب كمية المحول أوليغو لإضافة أثناء خطوة ربط المحول من بناء المكتبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التطبيقات أو الاتجاهات المستقبلية بعد اتقان هذه التقنية

هذا العمل يسمح تسلسل إكسوم من العينات التي تحتوي على 10 نانوغرام على الأقل من الحمض النووي. في السياق السريري، هذا الحد يستبعد معظم عينات طموح إبرة غرامة بسبب عدم كفاية المواد، ولكنه يتضمن خزعات الأساسية الكافية وعينات خزعة استئصال. وهذا سيمكن من الحصول على البيانات من مجموعة أكبر من العينات الممكنة.

خطوات حاسمة داخل البروتوكول

تقنيات التجميد والتفكك السليم ضرورية لنجاح التجربة. وينبغي فصل العينة بأكملها، بما في ذلك أقسام متليفة، قدر الإمكان. استخدام فوهة ميكرون 130 لأنواع الخلايا يبدو حاسما لتحقيق أقصى قدر من العائد من خلايا هرس كبيرة والحمض النووي. في حين لم يتم تنفيذ تجارب صارمة تسيطر عليها مع أحجام فوهة متعددة، زيادات كبيرةفي لوحظت غلة الخلية باستخدام فوهة أكبر مقارنة مع 100 ميكرون، وعمليا لم يتم الكشف عن خلايا على الشريحة آخر 85 ميكرون نوع فوهة (الملاحظة غير منشورة).

التعديلات وتحري الخلل وإصلاحه

عند العمل مع أقل من 100 نانوغرام من الجماهير من الحمض النووي المدخلات لبناء المكتبة، ينبغي توخي الحذر للحد من جميع خطوات المعالجة والتنظيف لا لزوم لها، وخاصة قبل تضخيم ير، لأن كل جزيء فريد المفقود يؤدي إلى الحد من تعقيد المكتبة النهائية . بروتوكول عمدا يوصي التصفية مقتطفات في 50 ميكرولتر لأن هذه القيمة متوافقة مع كل من سونيكاتيون ونهاية إصلاح باستخدام المعدات الموصى بها. وبهذه الطريقة، فإنه ليس من الضروري للحد من حجم شطف باستخدام المبخر الطرد المركزي أو عمود للخطوة سونيكيشن أو للحد من صوت صوت خطوة خطوة الإصلاح. تعديلات إضافية على هذا البروتوكول ممكنة. على سبيل المثال، يمكن أن مجموعات جديدة بناء مكتبة تحسين كفاءة ربط المحول. يمكن للمرء استكشاف الأخطاء وإصلاحها / تحسين من خلال مقارنة المنحنيات بوساطة مهايئ مكتبة بوساطة باستخدام التضخيم في الوقت الحقيقي على المكتبات المصنوعة من مجموعات مختلفة من نفس الكمية ونوعية الحمض النووي المدخلات.

قيود التقنية

ويبدو أن ما لا يقل عن 10 نانوغرام من الحمض النووي المنقى (ما يقرب من 1000 خلية مرتبة بعد الخسائر في خطوات الفرز والاستخراج) هو الحد الأدنى من النتائج العالية الجودة. في التجارب التجريبية، تم استخدام الحمض النووي من عينة واحدة من الخلايا T المنقى لأول مرة لجعل المكتبات التي تغطي مجموعة من كتل الإدخال. تم مقارنة 100 نانوغرام (الكمية الموصى بها القياسية) من دنا المدخلات إلى المكتبات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول منخفضة المدخلات لمدة 10 نانوغرام و 1 نانوغرام من الحمض النووي المدخلات. المكتبة التي تم إنشاؤها من 10 نانوجرام من الحمض النووي المدخلات لم يكن هناك اختلافات كبيرة من مكتبة المدخلات 100 نانوغرام في حجم وتوزيعوالتغطية عبر الهدف، أو في جزء الازدواجية ير. ومع ذلك، فإن المكتبة التي تم إنشاؤها باستخدام 1 نانوجرام من الحمض النووي المدخلات أدى إلى ارتفاع كبير ير جزء مكررة وانخفاض المقابل (حوالي 3 أضعاف) في متوسط ​​التغطية عبر الهدف. وعلاوة على ذلك، عرضت مكتبة 1 نانوغرام أيضا الانحراف عن التوحيد في التغطية، التي خلقت كاذبة إيجابية تعديلات عدد النسخ فيما يتعلق مكتبة 100 نانوغرام، على عكس مكتبة المدخلات 10 نانوغرام، والتي كانت محايدة نسخة في نفس التقييم. لهذا السبب، توخي الحذر باستخدام أقل من 10 نانوغرام من الحمض النووي المدخلات باستخدام هذه الطريقة.

أهمية هذه التقنية فيما يتعلق بالطرق القائمة / البديلة

وبعد بروتوكول تسمح تسلسل إكسوم الكامل من الخلايا هرس من عينات هودجكين سرطان الغدد الليمفاوية الأولية. عينات العقدة الليمفاوية تشل التي تحتوي على الأقل 2 × 10 7 خلايا مناسبة لهذا الإجراء. ولم يكن هذا متاحا من قبل للبحثإرس، الذين اعتمدوا على تقنيات مثل الليزر تسليخ مجهري والتضخيم الجينوم كله. ومن المتوقع أن النهج الجينومية لحالات تشل الأولية سوف تستمر لتكون قيمة لمزيد من فهم المرضية تشل. وتشير البيانات أيضا إلى عدم التجانس على مستوى الجينوم كبير داخل هذا الكيان المرض، مع احتمال وجود اثنين على الأقل من مجموعات فرعية محددة التي تتبع فضفاضة الطبقية المورفولوجية بين التصلب العقيدية الخلوية الخلوية تشل. وأخيرا، يعتقد أن البيانات على مستوى الجينوم سيؤدي إلى تطوير العلاج المستهدف لحالات تشل المنكسرة / المقاومة للحرارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقد تم تمويل تطوير هذا المشروع المشروع من قبل قسم علم الأمراض والطب المخبري من كلية طب وايل كورنيل. ونحن نعترف برنامج التدريب المؤسسي الثلاثي في ​​علم الأحياء الحاسوبية والطب للتمويل الجزئي. نود أن نشكر العلماء الذين تقاسموا وقتهم ومعرفتهم معنا، وخاصة ماريك أبيل؛ دان بورغيس؛ إيوانكا كوزاريوا؛ تشاد لوكلار؛ والجميع من المؤسسة الأساسية لعلم الجينوم في كلية طب وايل كورنيل، بما في ذلك جيني تشانغ، وشياوبو (شون) ليانغ، ودونغ شو، وي تشانغ، وهويمين شانغ، وتاتيانا باتسون، وتوو تشانغ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Petri or Cell Culture Dish (sterile)
RPMI-1640 Media Roswell Park Memorial Institute
Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated)
Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile
RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month)
scalpel with fresh blade
10 mL syringe (no needle)
Cryogenic vials
50 mL conical centrifuge tubes, force
Centrifuge capable of handling 50 mL conical centrifuge tubes and providing 400g
Hepes buffer(1 M, cell culture grade)
phosphate buffered saline (PBS)
Pluoronic-F68 Thermo-Fisher 24040-032
DNAase-I Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D4527-10KU store as 5 mg/mL in RPMI in -200 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)
Sort Media (PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + Pluoronic –F68 (1x))
CD64-FITC (22) Beckman Coulter, Miami, FL 20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD30-PE (BerH83) BD Biosciences, San Jose, CA 20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD5-ECD (BL1a) Beckman Coulter, Miami, FL 10 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) Ebiosciences, San Diego, CA 5 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD20-PC7 (B9E9) Beckman Coulter, Miami, FL 10 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD15-APC (HI98) BD Biosciences, San Jose, CA 20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD45 APC-H7 (2D1) BD Biosciences, San Jose, CA Can be substituted with 10 μL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested
CD95-Pacific Blue (DX2) Life Technologies, Grand Island, NY 5 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) Biolegend, San Diego, CA For optional protocol; Titering is suggested
CD54 (10 μg; clone 84H10) Serotec, Oxford, United Kingdom For optional protocol; Titering is suggested
CD58 (10 μg; clone TS2/9) eBioscience, San Diego, CA For optional protocol; Titering is suggested
LFA-1 (12 μg; clone MHM23) Novus Biologicals, Littleton, CO For optional protocol; Titering is suggested
BD CS&T Beads BD Biosciences, San Jose, CA
BD Accudrop Beads BD Biosciences, San Jose, CA
BC Versa Comp antibody capture beads Beckman Coulter, Miami, FL Compensation Beads
BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers BD Biosciences, San Jose, CA any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient
Wizard Promega A2360
10 mM Tris-Cl buffer NA
Qubit dsDNA HS Assay kit Life Technologies, Carlsbad, CA
S2 Sonicator Covaris, Woburn, MA Alternatives may be substituted
microTUBE Covaris, Woburn, MA
Low-Throughput Library Preparation Kit Kapa Biosystems, Wilmington, MA KK8221
Sybr Green Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9430
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter, Miami, FL
Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SeqCap EZ Exome v.3.0 Roche Nimblegen 6465684001
HiSeq Illumina
TruSeq-style Universal adapter Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T
TruSeq-style index adapter Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq-style PCR primer 1 Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa AATGATACGGCGACCACCGAGA
TruSeq-style PCR primer 2 Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
Nuclease Free Duplex Buffer Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa
BD FACSDIVA software BD Biosciences, San Jose, CA
BD Falcon Tubes BD Biosciences, San Jose, CA
BD Flow Tubes BD Biosciences, San Jose, CA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abrams, J. National Cancer Institute's Precision Medicine Initiatives for the new National Clinical Trials Network. American Society of Clinical Oncology educational book / ASCO. American Society of Clinical Oncology. Meeting. , 71-76 (2014).
  2. Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome medicine. 7, 80 (2015).
  3. Matsuki, E., Younes, A. Lymphomagenesis in Hodgkin lymphoma. Seminars in cancer biology. 34, 14-21 (2015).
  4. Fromm, J. R., Kussick, S. J., Wood, B. L. Identification and purification of classical Hodgkin cells from lymph nodes by flow cytometry and flow cytometric cell sorting. Am J Clin Pathol. 126 (5), 764-780 (2006).
  5. Fromm, J. R., Thomas, A., Wood, B. L. Flow cytometry can diagnose classical hodgkin lymphoma in lymph nodes with high sensitivity and specificity. Am J Clin Pathol. 131 (3), 322-332 (2009).
  6. Roshal, M., Wood, B. L., Fromm, J. R. Flow cytometric detection of the classical hodgkin lymphoma: clinical and research applications. Advances in hematology. 2011, 387034 (2011).
  7. Reichel, J., et al. Flow sorting and exome sequencing reveal the oncogenome of primary Hodgkin and Reed-Sternberg cells. Blood. 125 (7), 1061-1072 (2015).
  8. Kozarewa, I. A Modified Method for Whole Exome Resequencing from Minimal Amounts of Starting DNA. PLoS ONE. 7 (3), e32617 (2012).
  9. Brunicardi, F. C. Schwartz's Principles of Surgery. , 10th ed, McGraw-Hill Education / Medical. (2014).
  10. Kantor, A. B., Roederer, M. FACS analysis of leukocytes. Handbook of Experimental Immunology. 2, Blackwell Scientific. (1996).
  11. Sanders, M. E. Molecular pathways of adhesion in spontaneous rosetting of T-lymphocytes to the Hodgkin's cell line L428. Cancer Res. 48 (1), 37-40 (1988).
  12. Biosciences. FACSDiva Software v6.0. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/in/instruments/software/facsdiva/resources/overview.jsp (2007).
  13. Biosciences. FACSAria II User's Guide. Part No. 644832, Revision A. , (2009).
  14. Life Technologies. Qubit 3.0 Fluorometer, Catalog Number Q33216. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33216 (2017).
  15. Roche Nimblegen. SeqCap EZ Library SR User's Guide ver. 4.1. , (2013).
  16. Illumina. HiSeq High-Throughput Sequencing System. , Available from: http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.html (2016).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  18. Li, H. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. The Broad Institute. Picard Tools. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2016).
  20. Saunders, C. T. Strelka: accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
  21. Cingolani, P., et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly (Austin). 6 (2), 80-92 (2012).
  22. Dobin, A. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  23. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  24. DNA copy number data analysis. v.R package version 1.34.0. , Available from: https://omictools.com/dnacopy-tool (2013).

Tags

علم الوراثة، العدد 124، الكلاسيكي هودجكين سرطان الغدد الليمفاوية، كل، ريد-سترنبرغ، فاكس، إكسوم، الجيل المقبل من مكتبة التسلسل، تدفق خلية الفرز
تدفق الفرز وإكسوم التسلسل من خلايا ريد-ستيرنبرغ من الليمفاوية الكلاسيكي هودجكين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reichel, J. B., McCormick, J.,… More

Reichel, J. B., McCormick, J., Fromm, J. R., Elemento, O., Cesarman, E., Roshal, M. Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma. J. Vis. Exp. (124), e54399, doi:10.3791/54399 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter