Classificação de fluxo e sequenciação Exome das células de Reed-Sternberg do linfoma de Hodgkin clássico

Summary

Aqui, descrevemos uma classificação de células de citometria de fluxo combinado e um protocolo de construção de bibliotecas de próxima geração, de baixa entrada, projetado para produzir dados de alta qualidade e total de exomas das células Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) do linfoma de Hodgkin clássico (CHL).

Abstract

As células de Hodgkin Reed-Sternberg do linfoma de Hodgkin clássico são distribuídas escassamente em um fundo de linfócitos inflamatórios e tipicamente compreendem menos de 1% da massa tumoral. O material derivado do tumor a granel contém conteúdo de tumor em uma concentração insuficiente para caracterização. Portanto, a classificação de células ativadas por fluorescência usando oito anticorpos, bem como a dispersão lateral e frontal, é descrita aqui como um método de separação e concentração rápida com milhares de células HRS de alta pureza do tumor para estudo posterior. Ao mesmo tempo, porque os protocolos padrão para o sequenciamento exoma tipicamente requerem 100-1000 ng de DNA de entrada, que muitas vezes é muito alto, mesmo com a classificação de fluxo, também fornecemos um protocolo de construção de biblioteca otimizado e de baixa entrada capaz de produzir alta qualidade Dados de até 10 ng de DNA de entrada. Esta combinação é capaz de produzir bibliotecas de próxima geração adequadas para a captura de hibridação de todo o mundoIscas xome ou painéis direcionados focados, conforme desejado. Exome seqüenciamento das células HRS, quando comparado contra células T ou B intratumor saudáveis, pode identificar alterações somáticas, incluindo mutações, inserções e deleções, e alterações no número de cópias. Essas descobertas elucidam a biologia molecular das células HRS e podem revelar vias para tratamentos medicamentosos direcionados.

Introduction

Os avanços na genómica do câncer como resultado da sequenciação da próxima geração levaram a avanços significativos na identificação de alvos terapêuticos e na prognóstico para muitas neoplasias hematológicas e não hematológicas. Novas estratégias de tratamento individualizado baseadas em alterações genômicas específicas estão sendo introduzidas rapidamente em muitos tipos de tumores (revisado nas referências ^{1 , 2} ). Apesar do progresso significativo na genômica do linfoma, o genoma das células neoplásicas de HRS no linfoma de Hodgkin clássico (CHL) foi subexplorado. As investigações foram prejudicadas pela escassez de células neoplásicas de HRS dentro de um microambiente reativo, tornando difícil isolar populações de células HRS purificadas ³ .

O método para isolar células HRS viáveis ​​de tumores primários foi desenvolvido por Fromm et al. ^{4 ,}O método utiliza um cocktail de oito anticorpos, composto por CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 e CD64, para identificar inequivocamente células HRS de uma suspensão de tumor CHL. Usando esta metodologia, nós São capazes de isolar pelo menos 1.000 células HRS viáveis ​​de suspensões celulares frescas ou congeladas de biópsias tumorais consistindo em pelo menos 10 ⁷ células (aproximadamente 10 mg de tecido). A pureza é superior a 90% por análise citométrica de fluxo e é estimada como sendo Pelo menos 80% pela análise genômica exoma de dez casos consecutivos.

Nós refinamos uma técnica de isolamento de células citométricas de fluxo que facilitou o processo, permitindo o isolamento rápido de milhares de células HRS viáveis ​​de tumores primários de CHL ⁷ . Utilizamos a técnica para produzir o que se acredita ser a primeira sequência de exomas inteiras das células tumorais em casos primários de linfoma de Hodgkin. Nossos estudos demonstram queE viabilidade de estudos de alto rendimento, em todo o genoma, de casos individuais de CHL e já levaram à identificação de novas alterações genômicas com o potencial de explicar aspectos da patogênese de CHL.

Desenvolvemos ainda um pipeline para utilizar o DNA extraído para estudos genômicos de alto rendimento. A fim de obter resultados confiáveis ​​de cerca de 1.000 células HRS classificadas (o mínimo obtido em casos seqüenciais), desenvolvemos um procedimento de construção de biblioteca de DNA de próxima geração modificado ⁸ que nos permitiu aumentar a eficiência da ligação de adaptador e gerar bibliotecas de fragmentos de DNA Sem amplificação excessiva. Este método permite a análise de amostras clínicas de rotina e a detecção de mutações recorrentes e alterações cromossômicas ⁷ .

Protocol

1. Processamento e congelamento de tecidos

1. Recolher o tecido dos linfonodos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou no meio do Instituto Roswell Park Memorial (RPMI) e processar dentro de 24 h de coleta. Transferir o tecido ganglionar excisado ⁹ para uma placa de Petri contendo 10 mL de RPMI com 2% de soro de vitelo fetal (FCS) e picá-lo finamente com uma lâmina de bisturi fresca. Use a parte traseira de um êmbolo de seringa de 10 mL para moer / dissociar o tecido.
2. Transfira o líquido para um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de células de 100 μm. Enxague a placa de Petri e o filtro com 10 mL adicionais de RPMI 2% FCS.
3. Obtenha uma contagem de células usando um contador de células automatizado ou um hemocitômetro.
   NOTA: Geralmente, pelo menos 2 x 10 ⁷ células seriam esperadas de aproximadamente 5 mm ³ de tecido de linfonodo de CHL. É esperada uma viabilidade superior a 80%, mas pode variar de acordo com a amostra.
4. Gire as células a 400 xg por 10 min e aspiraO sobrenadante. Coloque o tubo contendo pellet celular no gelo.
5. Meio de congelação pré-frio no gelo. Ressuspender as células em meio de congelação a frio a uma concentração de 2 x 10 ⁷ / mL e ressuspendê-la por pipetagem. Não vortex. Incube a suspensão sobre gelo durante 10 min.
6. Alíquota da amostra 1 mL / frasco de cryo (pré-refrigerado no gelo). Transfira os frascos para um congelador de -80 ° C durante 1-2 dias e transfira-os novamente para nitrogênio líquido.

2. Preparando suspensões de células para classificação de células

NOTA: Cada lote de anticorpo deve ser apropriadamente titered usando 10 milhões de células em um volume de coloração de 300 μΛ. O sangue periférico pode ser usado para todos os anticorpos, exceto CD30, para o qual a linha celular KMH2 introduzida no sangue periférico pode ser usada para titulação ¹⁰ . Em geral, começamos com o volume de anticorpo recomendado pelo fabricante e realizamos duas diluições de duas vezes e um aumento de duas vezes (quatro pontos de dados)Por cada quantidade de titulação de anticorpos. Por exemplo, se o fabricante recomenda um volume de 10 μL, realizamos a titulação usando volumes de 2, 5, 10 e 20 μL.

1. Coloque um banho de água a 37 ° C. Premixar a quantidade de anticorpos em um frasco de vidro escuro e adicionar PBS + 2% de BSA para um volume total de coquetel de 100 μL.
   NOTA: Embora nós recomendamos a titulação dos anticorpos, os seguintes volumes podem ser usados ​​como ponto de partida: CD64, 20 μL; CD95, 5 μL; CD30, 20 μL; CD5, 10 μL; CD20, 10 μL; CD15, 20 μL; CD40, 5 μL; E CD45, 10 μL.
2. Transfira o frasco de nitrogênio líquido para um balde de gelo contendo gelo seco para evitar a descongelação. Pré-aqueça 50 ml de meio de descongelação contendo RPMI / 20% de FCS / DNase (100 μg / mL) num tubo cónico de 50 mL num banho de água a 37 ° C.
3. Transfira 45 ml de meio de descongelamento para um tubo fresco e mantenha-o a 37 ° C. Descongelar rapidamente as células segurando um frasco criogênico em um morcego de água a 37 ° CH até que apenas uma porção congelada muito pequena permaneça.
4. Despeje o conteúdo do frasco para dentro do tubo contendo 45 mL de meio de descongelamento. Enxague o frasco criogênico vazio 2 vezes com 1 mL de meio de descongelamento e combine os enxaguamentos.
5. Incubar as células à temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir a digestão com DNase e o reequilíbrio celular. Gire as células a 500 xg durante 10 min e aspirar o sobrenadante.
6. Ressuspender as células em aproximadamente 200 μL do meio de descongelação retido (5 mL) e deixar equilibrar até a temperatura ambiente durante 2-3 minutos. Recomenda-se a recuperação de> 70% das células viáveis ​​congeladas.
   NOTA: Opcionalmente, para maior pureza de células HRS classificadas que podem ser rosetadas por células T anexas, um coquetel de anticorpos não marcados pode ser adicionado nesta etapa (veja o protocolo opcional).
7. Adicionar 100 μL de um coquetel de anticorpos e incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT), protegido da luz. Adicione 3 mL de meio de triagem, centrifugue as células a 500 xgPor 10 min, e aspirar o sobrenadante.
8. Ressuspender as células em 1 mL de meio de triagem e transferi-las para um filtro de tubo de fluxo de 5 mL.
9. Enxaguar tanto o tubo cônico de 50 mL como o filtro celular com 1 mL adicional de meio de triagem e colocar as células em gelo.

3. (Protocolo opcional) Bloqueio de Rosetas de células T

NOTA: As células HRS são rosetadas por células T em seções de tecido e suspensão celular, e essas células T podem potencialmente contaminar a fração HRS classificada. Essas interações são mediadas por CD54 e CD58 na ligação da célula HRS a LFA-1 e CD2 nas células T ^{4 , 11} . Essas interações podem ser bloqueadas com anticorpos não marcados para essas moléculas de adesão.

1. Alíquotas de 100.000 a 500.000 células em 100 μL de RPMI.
2. Incubar a suspensão celular com anticorpos não marcados para CD2, CD54, CD58 e LFA-1 (10 μL cada) em gelo durante 1 h. TA suspensão celular pode agora ser marcada com anticorpos fluorescentes.

4. HRS-, B- e Isolação de células T usando a classificação de células

NOTA: Embora usemos um instrumento de ordem de pesquisa especial usando 5 lances (veja a planilha de Materiais), qualquer classificador com a capacidade de detectar os fluoroquromos utilizados no painel de anticorpos deve ser suficiente. A execução das etapas abaixo requer uma familiaridade com a função do software ¹² e um conhecimento básico das operações de classificador de células. Consulte o manual do software on-line para obter instruções detalhadas.

1. Configuração do citómetro:
   1. Ligue o computador e faça o login. Ligue as tomadas BSC (e BSC) e, em seguida, ligue o citómetro. Aguarde pelo menos 90 s para a CPU interna do citómetro começar, e abra o software de controle a laser e verifique se todos os laser estão ligados. Inicie o software citométrico ¹³ e faça o login.
   2. Dentro do software do citometro, clique em "Citómetro → Configurações de visualização". Quando a caixa de diálogo do subprograma de configuração for aberta, destaque a configuração personalizada de 130 μm e clique em "configurar configuração" e "OK". Saia do subprograma de configuração.
   3. Observe a caixa de diálogo no software do citometro e clique em "usar as configurações do CS & T". Instale um bocal de 130 μm no instrumento e ligue o fluxo clicando no botão vermelho "X" na janela do fluxo. Deixe o instrumento aquecer durante pelo menos 30 min.
   4. Execute uma verificação de desempenho no instrumento usando o método desejado (um módulo de software de rastreamento de desempenho é incluído com o classificador descrito aqui, consulte o manual do software (pp. 117 - 122) e padrão de referência (consulte os Materiais para o padrão usado em Esta configuração).
      1. Clique em "Citómetro → CST", assegure-se de que o campo "Caracterizar" esteja definido como "ChecK Performance "no menu suspenso e clique em" Executar ". Quando solicitado pelo software, carregue um tubo de partículas de referência no estágio da amostra e clique em" OK ".
      2. Após a conclusão da execução, clique em "Concluir" e feche o módulo de software. Após o software do citómetro ter terminado de se reconectar ao citómetro, clique em "usar as configurações de CS & T" na caixa de diálogo que aparece.
   5. Determine o atraso de queda correto usando o recurso de atraso automático de queda do software do citometro (ver págs. 154 a 161 do manual do software).
      1. Abra o experimento "Drop Delay" na janela "Navegador" do software do citometro, instale um tubo de partículas de calibração no estágio da amostra e clique em "Carregar" na janela "Painel do Aquisição". Ative o recurso de monitoramento automático de fluxo, clicando no botão "Sweet Spot" na janela "Stream". Deixe este recurso em qualquer momento para todos os seguidoresG passos.
      2. Ative a tensão da placa de deflexão clicando no botão "Tensão" na janela de fluxo lateral e depois ative a classificação do teste clicando no botão "Testar classificação" imediatamente adjacente ao botão "Voltagem".
      3. Ajuste todas as configurações de fluxo lateral para zero, exceto para o fluxo do lado esquerdo. Ajuste a configuração do fluxo do lado esquerdo de modo que dois pontos de fluxo sejam visíveis na janela de fluxo lateral. Clique no botão "Filtro óptico" e verifique se o ponto do lado esquerdo do fluxo aparecerá dentro da caixa esquerda que aparece na área preta da janela do fluxo lateral.
      4. Ajuste a configuração do lado esquerdo se necessário. Desative a classificação do teste clicando no botão "Test Sort" novamente. Na janela "Navegador", expanda o elemento "Global Worksheets" do experimento "Drop Delay", clicando no botão "+".
      5. Clique duas vezes em "Ordenar Layout_001" para abrir o layout de classificação, verifique por inspeção visualQue a população de ordenação esquerda tenha "P1" atribuída a ele, e clique em "Classificar" na janela "Ordenar Layout". Na janela "Ordenar Layout", clique em "Atraso automático" e depois em "Executar".
      6. Quando a execução for concluída, clique em "Sair". Instale um tubo de água desionizada estéril no estágio da amostra e clique em "Carregar" na janela "Painel do Aquisição". Corra o tubo de água por pelo menos 5 minutos para limpar as partículas de teste residual do instrumento antes de prosseguir.
   6. Execute controles de compensação (usando contas de compensação da planilha Material ou equivalente) usando uma configuração de compensação integrada no software classificador (consulte as páginas 131 a 137 do manual do software para obter detalhes adicionais).
      1. Crie uma nova experiência clicando em "Experiência nova Experiência". Na guia "Parâmetros" da janela "Status do Instrumento", exclua os parâmetros não utilizados, se houver. Clique em "Experiment CompensatIon Setup Create Compensation Controls ".
      2. Na janela "Navegador", expanda a amostra "Controles de Compensação" clicando no sinal "+". Execute os tubos de controle de compensação sem registrar os dados e, se necessário, ajuste as tensões do detector (na guia "Parâmetros" da janela "Status do Instrumento") para que as populações de grânulos com corantes positivos para cada fluorochrome estejam entre o canal 10.000 e 100.000 e sejam Os mais brilhantes em seu canal de detecção primário.
      3. Anote as tensões necessárias para cada parâmetro para cada tubo. Destaque o tubo "Controle não mantido" sob a amostra "Compensação de controles", soltando um clique esquerdo. Coloque o tubo de controle não manchado no estágio da amostra e clique em "Carregar" na janela "Controle de aquisição".
      4. Digite manualmente as tensões determinadas executando controles de compensação individuais nos campos de tensão do detector para todos os parâmetros, eEm seguida, clique em "Gravar" na janela "Controle de Aquisição". Execute todos os controles de compensação restantes, gravando os dados sem alterar as configurações do detector. Instale um tubo de água destilada estéril durante 5 minutos para limpar qualquer material residual do instrumento antes de prosseguir.
2. HAR-cell gating:
   1. Adquirir e gravar pelo menos 100.000 eventos para gating inicial enquanto ajusta a taxa de fluxo para adquirir 3.000-4.000 eventos / s (veja o passo 4.1).
      NOTA: Pode ser necessário adicionar um meio de classificação adicional para diluir as células se a concentração celular for muito alta. Pare a aquisição.
   2. Coloque as células HRS usando as etapas descritas na Figura 1
      NOTA: Na maioria dos casos de CHL, entre 0,01% e 0,1% das células serão células HRS.
3. Abertura de células B e T:
   1. Identificar controles somáticos (células B e T) pelo gating de CD20 e CD5, respeitar(Gating lymphocytes by CD45 / SSH), seguido de CD20 versus CD5 (ver Figura 1 ).
   2. Fluxos de coleta de destino para tubos de coleta em um rack de coleta pré-refrigerado de duas vias ou quatro vias. Preencha tubos de fluxo ou tubos de estilo centrífugo de 15 mL pelo menos a meio caminho com o meio de coleta.
   3. Atribua HRS e controle as populações aos tubos de coleta adequados na configuração de classificação, seguindo as instruções do fornecedor. Reinicie a aquisição da célula e inicie o ordenamento.
   4. Recolher todas as células HRS e até 1 milhão de células B e T. Aponte os fluxos de coleta aos tubos de coleta em um rack de coleta pré-refrigerado de quatro vias (ou duas vias).

5. Extração de DNA

1. As células coletadas por pastilhas por centrifugação em 1,5 ml de tubos cônicos a 3 000 xg durante 10 min e ressuspender uma vez com 1 mL de PBS para lavar as células.
2. Pellet mais uma vez a 3.000 xg durante 10 min e remover o sobrenadante; Tenha muito cuidado para não incomodarO minúsculo grânulo.
3. Adicione 150 μL de tampão de lise (ou um volume apropriado para o kit usado) nas células lavadas e misture por pipetagem para cima e para baixo.
   NOTA: Um pode armazenar lisado celular a -70 ° C neste ponto, se necessário.
4. Construa um conjunto de colunas colocando a coluna de filtro dentro do tubo e adicione o lisado do passo 5.5 à coluna. Gire a montagem em 13.000 xg por 3 min.
5. Remova a minicoluna da montagem e descarte o líquido no tubo de recolha. Substitua a minicoluna no tubo de recolha.
6. Adicione 650 μL de solução de lavagem em coluna para cada montagem. Centrifugar durante 1 min a 13,000 x g. Descarte o líquido do tubo de recolha. Repita este passo para um total de 4 lavagens.
7. Descarte o líquido do tubo de recolha e volte a montar a montagem da minicoluna. Centrifugar durante 2 min a 13,000 xg para secar a matriz de ligação.
8. Transfira a minicoluna para um novo tubo de 1,5 mL e adicione 25 μL de Tris-Cl 10 mM, queÉ preferido para o passo de sonicação subsequente, ou água livre de nuclease aquecida a 65 ° C. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente e centrifugar a montagem a 13 000 xg durante 1 min. Repita mais uma vez com 25 μL para um total de 50 μL.
9. Misture a eluição do DNA por pipetagem para cima e para baixo e quantificar usando fluorimetria ¹⁴ .

6. Construção de bibliotecas

1. Preparação antes do início:
   1. Configure o sonicador no nível de água 12, Intensidade 5, Ciclos / explosão 200 e Temp 7.
   2. Com base na quantidade de DNA disponível determinada pela fluorimetria e no desenho experimental, determine a quantidade de DNA a ser usada para a construção da biblioteca.
      NOTA: Tenha em mente que, se muito pouco DNA for usado e a qualidade da biblioteca estiver comprometida, pode haver pouca aplicação para o material que é deixado para fins de validação. Para quantidades de insumos de qualidade inferior, quanto maior a massa de entrada, maior será o compLexidade da biblioteca de sequenciação resultante. Algumas diretrizes para este protocolo são as seguintes: 10 ng devem produzir bons resultados, e 50 ng podem ser considerados um máximo aproximado.
   3. Decida sobre o adaptador: insira uma relação molar baseada vagamente nos valores da Tabela 1 .
   4. Calcule a quantidade de adaptador para usar da seguinte maneira:
      NOTA: Número de moles de entrada de DNA, n
      Eu. N = 1,54e-12 ^-12 * massa de entrada (em ng) / (tamanho médio do fragmento)
      Ii. Quando o tamanho médio do fragmento é de 200 pb, isso simplifica:
      N = 7.7e-15 * massa de entrada (em ng)
      Número de moles de adaptador para incluir, um
      Eu. A = n * r
      Volume do material adaptador para usar no passo de ligação do adaptador, v
      Eu. V (em μL ) = um / [ 10 ^-12 * adaptador de estoqueConcentração (em μM )]
      NOTA: se a concentração do adaptador for baixa, para garantir que a quantidade necessária de adaptador esteja incluída, a solução do adaptador pode ser usada para diluir os reagentes de reparo final em vez de água.
      Exemplo: Para 100 ng de DNA de entrada com um tamanho médio de fragmento de 200 pb, para um adaptador molar desejado: proporção de inserção de 15: 1 e uma concentração de estoque de adaptador de 2 μM, o volume de adaptador recomendado para usar é de 5,8 μL.
   5. Atribua códigos de barras indexados às amostras.
      NOTA: As bibliotecas que serão reunidas em uma reação de hibridação ou uma pista na célula de fluxo de um seqüenciador não devem conter nenhum índice redundante.
2. Construção da biblioteca - cisalhamento do DNA:
   1. Adicione a quantidade total de DNA a ser utilizada em um tubo de sonicação. Se o volume de amostra contendo o DNA de entrada sozinho for inferior a 50 μL, adicione Buffer EB até um volume total de 50 μL e misture.
   2. Sonicate para 30 s.
   3. Remova o tubo e execute uma rotação rápida em uma mini centrífuga apenas o suficiente para coletar qualquer spray da parte superior das paredes do microtube.
   4. Repita as etapas 6.2.2-6.2.3 para um total de sete sessões de sonicação de 30 s para um total de 210 s de sonicação.
      NOTA : Sinta-se livre para experimentar com a divisão dos 210 s em menos sessões.
3. Construção da biblioteca - Reparação final, A-tailing e ligadura do adaptador:
   NOTA: Evite fazer qualquer seleção de tamanho antes do passo de amplificação de PCR da biblioteca.
   1. Siga as instruções do fabricante ¹⁹ para o reparo final e A-tailing após a sonicação do DNA da amostra.
   2. Após A-tailing, use o número apropriado de moles de adaptador (calculado no passo 6.1.3) na reação. Combine o adaptador, fragmentos de DNA de cola em A, enzima e tampão e incube durante a noite a 20 ° C durante aproximadamente 16 h.
4. LibConstrução de Rary - Amplificação da biblioteca:
   1. Execute uma limpeza de talão da reação de ligação do adaptador. Após a adição de pérolas ao produto de PCR, aguarde 5 min à temperatura ambiente. Coloque-o contra um suporte magnético e remova os líquidos, lave duas vezes em 200 μL de etanol a 80%, retire as contas o suficiente para remover a maioria do líquido sem secagem excessiva e elute o DNA das contas, pipeteando 25 μL de Água livre de nuclease, como sugerido, sobre as contas enquanto o tubo permanece contra um suporte magnético.
      NOTA: pode ser possível experimentar com a preservação das pérolas em polietilenoglicol
      (PEG) até depois da amplificação em vez de descartá-los, mas isso não foi testado.
   2. Inclua 0,6 μL de uma diluição 1: 1000 de corante verde por 50 μL de mistura mestre de PCR. Alternativamente, use um corante intercolando compatível com PCR em tempo real de escolha no volume apropriado para o equipamento.
   3. Programe a reação de PCR a 98 ° C para45 s para a desnaturação inicial, seguido de um ciclo de desnaturação, recozimento e extensão a 98 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 30 s, ou escolha o programa apropriado se estiver usando uma alternativa Enzima polimerase.
      1. Defina a máquina para levar dados de fluorescência a 72 ° C para cada ciclo. Programe uma extensão final a 72 ° C durante 1 min seguido por uma retenção a 4 ° C por um período indeterminado. Os iniciadores de PCR para a amplificação da biblioteca ligada por adaptador usando reagentes na tabela suplementar são: Oligo 1, AATGATACGGCGACCACCGAGA e Oligo 2, CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
   4. Amplifique a biblioteca usando as condições de PCR descritas acima, observando os valores de intensidade de fluorescência em tempo real com o software qPCR, parando antes do final da fase de crescimento exponencial.
   5. Após a amplificação, faça uma limpeza de talão padrão (veja o passo 6.4.1) utilizando 0.8x o volume da reação de reação de amplificaçãoGeralmente 0,8 x 50 = 40 μL de pérolas. Adicione as contas ao produto de PCR e aguarde 5 min à temperatura ambiente.
   6. Coloque-o contra um suporte magnético e remova os líquidos, lave duas vezes em 200 μL de etanol a 80%, retire as contas o suficiente para remover a maior parte do líquido sem secar e elute adicionando água isenta de nuclease às esferas secas.
   7. Quantificar o DNA resultante usando fluorimetria. Visualize os fragmentos da biblioteca para o tamanho; Consulte a seção sobre expectativas de QC de dados para obter mais detalhes.

7. Exome Hybridization

1. Combine quatro bibliotecas com códigos de barras de adaptador distintos.
   NOTA: A massa por fluorimetria e o tamanho por gel são usados ​​para calcular a molaridade e, em seguida, as bibliotecas são combinadas em quantidades equimolares para um total de uma massa de 1.000 ng de biblioteca agrupada. É melhor manter todos os pares tumor-normal em conjunto, em vez de separá-los em pools separados.
2. Aplicar o protocolo de captura exome Up class = "xref"> 15 e fazer 8 ciclos de PCR após a limpeza da captura. Outras opções de alvos de captura podem ser possíveis.

8. Seqüenciamento multiplexado

1. Seqüência de uma única captura de hibridização contendo quatro bibliotecas multiplexadas em uma única faixa na plataforma de seqüenciamento referenciada na planilha de materiais ¹⁶ .
   NOTA: configurações alternativas são possíveis para usuários avançados que desejam planejar e otimizar a profundidade de cobertura de leitura alvo.

9. Análise (Pode ser Substituído com Pipeline Alternativo (s) se desejado)

1. Snps e pequenos indels:
   1. Mapeie dados brutos para o genoma de referência humano, UCSC hg19, utilizando Burrows-Wheeler Aligner (BWA) ¹⁷ ou um algoritmo de escolha alternativo. Filtrar ou marcar lê com um índice de qualidade de mapeamento abaixo de 20 e duplicatas de PCR usando Samtools ¹⁸ ou PicardRef "> 19.
   2. Detectar variantes de nucleotídeos somáticos e indiais pequenos em amostras de HRS em comparação com os controles somáticos de células T usando Strelka ²⁰ ou um variante de escolha. Aplique snpEff ²¹ para anotar a saída Strelka. Se desejar, inspecione sistematicamente os loci variantes para artefatos usando o Visor Integrado do Genoma (IGV) ^{22 , 23} .
2. Alterações do número de cópias:
   1. Calcule a relação log-transformada " ltr " para cada intervalo de destino " i " de contagens de leitura normalizadas intra-biblioteca no tumor contra as do normal da seguinte maneira:
      
      NOTA: c é o número de mapeamentos de leitura para um determinado intervalo de captura, l é o tamanho total da biblioteca, t indica tumor e n indica normal.
   2. Filtra intervalos com cobertura insuficiente ( C _t + C _n <100 leituras) para análise posterior. Conduzir a segmentação pan-interval com DNAcopy v.1.0 ²⁴ de Bioconductor em R.
      NOTA: Considere os segmentos onde o valor absoluto do ltr médio é inferior a 0,5 para ser neutro em cópias. Os segmentos remanescentes podem ser designados como ganhos de números de cópias, se o sinal do ltr médio for positivo (em outras palavras, há significativamente mais leituras na amostra de tumor do que na amostra normal após a normalização) ou as perdas de número de cópias, se o sinal Do ltr médio é negativo.

Representative Results

Um plano de bioanalyzer deve ser tomado após a ampliação da biblioteca e a limpeza do talão de 0,8x. Deveria ver uma distribuição "normal-like" de tamanhos de fragmentos no intervalo desejado ( Figura 2a ). Desvios dessa forma, como um "ombro" visível na curva, indicam a presença de um artefato de alto ou baixo peso molecular. Por exemplo, a Figura 2b -2d mostra exemplos de bibliotecas que contêm artefactos visíveis que de preferência não devem ser seqüenciados. Se uma biblioteca estiver comprometida de forma significativa, pode valer a pena repetir a construção da biblioteca se o DNA estiver disponível e / ou a classificação das células para começar de novo.

Um dímero adaptador pode às vezes transpor-se através da primeira limpeza de talão de 0.8x. Se isso ocorrer, será visível como um pico afiado centrado em torno de 125 - 130 pb (veja FigurE 2c). Neste caso, é aconselhável repetir uma limpeza de contas de 0,8x adicional e repetir o bioanalizador para assegurar a remoção bem sucedida do dímero.

Usando as especificações descritas neste protocolo e multiplexando o seqüenciamento no nível de quatro amostras por pista no seqüenciador listado na planilha de Materiais, uma profundidade de cobertura média de 50 a 100x em todo o alvo (após a remoção de bioinformática de duplicados de PCR lê) É viável (ver Figura 3a ). Além disso, as bibliotecas que não foram ampliadas e que resultaram em bibliotecas com cobertura adequada devem produzir lotes de números de cópias limpas. Durante o início do trabalho, este protocolo de construção da biblioteca foi testado em três ordens de grandeza de massa de entrada, e os resultados variáveis ​​foram descobertos (veja a seção Discussão). Copiar lotes de números gerados usando uma biblioteca gerada a partir de 1 ng, uma quantidade sub-ótima de DNA de entrada, Resultou em ganhos e perdas de números de cópias espúrios ( Figura 3b , inferior).

Aproximadamente 70% dos casos de CHL carregam mutações B2M e A20 e / ou deleções ⁷ . As mutações B2M envolvem predominantemente um site de início de tradução, um primeiro site de parada de exões e um primeiro site de parada de exões. As mutações A20 são uma mistura de perda de número de cópias e indels. As mutações parecem ser clonais e podem ser usadas para estimar o conteúdo relativo do tumor. Se as células T são usadas como controles somáticos, a seqüência HRS mostrará ganhos significativos de números de cópias nas posições correspondentes às posições de receptor de células T alfa / delta (14q11 - 12) e beta (7q32 - 35), bem como perdas significativas no Corrente pesada do receptor de célula B (14q32) e posições da cadeia leve kappa (2p11) (ver Figura 4 ). A seqüência geral mostra um intervalo de 100 a 400 mutações somáticas por caso. A variação do número de cópias é altamente vPossível de caso a caso, com alguns casos mostrando inúmeros ganhos e perdas segmentares e outros casos mostrando apenas algumas alterações.

Figura 1: Compartimento multiparamétrico para classificação de fluxo de células HRS, B e T viáveis. Os nomes das populações são apresentados em parcelas e indicam a população-mãe de qualquer portão. ( A ) mostra todas as células: no histograma FSC-H versus FSC-A, desenhe um portão SINGLETS que inclua populações com FSC-H proporcional e FSC-A aumenta. Excluir dupletos com FSC-A alto e FSC-H inferior. As células de Hodgkin são muito grandes; Expanda o portão para incluir eventos altos de FSC-H e FSC-A. ( B ) Excluir detritos, células mortas e RBCis não-lisados ​​que normalmente apresentam FSC-A mais baixo e ligeiros aumentos em SSC-H sem cortar populações viáveis ​​(porta VIABLE). ( C ) Porta células MONONUCLEAR emFSC-A vs. SSC-H para excluir granulócitos com SSC-H elevado; Note que o portão é usado apenas para a identificação de células T e B. ( D ) Gate T CELLS identificado positivamente pelo CD5 (verde) sem CD20 e B CELLS (azul), que tem expressão CD20 sem CD5. ( E ) Desenhe um portão mais GRANDE na trama CD45 / SSH, incluindo 10 a 20% das células linfóides e todas as células granulocíticas. ( F ) Portar eventos positivos para CD30 com autofluorescência DC64 / FITC fraca para negativa. ( G ) Entre os eventos positivos CD30, o portão CD40 e os eventos positivos para CD95 (portão CD30 / 40/95 HRS, vermelho). ( HL ) Observe as características imunofenotípicas confirmantes em células HRS; As células HRS geralmente não expressam CD20 (parcelas H e L). A expressão de CD5 está correlacionada com CD45 devido a roseting de células T (I); A maioria dos casos mostrará expressão do CD15 e será brilhante para CD71 ( J ). A expressão de CD40 e CD95 está geralmente acima do nível de células B e T, resp. Ectively ( K ). Esta pesquisa foi originalmente publicada no Blood ⁷ . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Gráficos de Distribuição de Tamanho de Amostras após Ligação e Amplificação do Adaptador. Idealmente, as bibliotecas com artefatos visíveis devem ser repetidas e não seqüenciadas. (A) Biblioteca bem formada; Sem artefatos visíveis. ( B ) A assimetria na curva revela um problema. (C) Dímero de adaptador significativo (pico em 128) e um artefato de alto peso molecular (> 400 pb). O dímero pode ser limpo com uma limpeza adicional de contas de 0,8x. ( D ) Artefato significativo de alto peso molecular.S / ftp_upload / 54399 / 54399fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Medições de controle de qualidade bioinformática para bibliotecas de alta qualidade feitas a partir de 10 ng de DNA de entrada em comparação com bibliotecas de qualidade inferior feitas a partir de 1 ng de DNA de entrada. A magnitude e a distribuição da única profundidade de leitura das expectativas de cobertura. (A) Uma média de cobertura de pelo menos 50 é esperada ao usar 10-100 ng de DNA de entrada. ( B ) Cada um dos 2 painéis mostra resultados de análise de variação de número de cópias comparando dados entre 2 bibliotecas sequenciadas. Os segmentos de sonda exônica (eixo x) versus a mudança de número de cópia em uma escala de log ₂ (eixo dos e) são plotados para um único cromossomo representativo (chr 6). Comparando dados de uma biblioteca de baixa entrada de 10 ng de intratumoralO DNA das células T a uma biblioteca de entrada normal de 100 ng do DNA das células T intratumoral do mesmo caso não mostrou resultados falso-positivos significativos; Isto é, as bibliotecas de entradas baixas e de entrada normal são neutras para a cópia (superior). Numerosas alterações no número de cópias segmentadas falso-positivas foram chamadas quando os dados de uma biblioteca de baixa entrada de 1 ng do DNA de células T intratumoral foram comparados com uma biblioteca de entrada normal de 100 ng do DNA de células T intratumoral do mesmo caso (parte inferior). Esta pesquisa foi originalmente publicada no Blood ⁷ . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Ganhos e Perdas de Número de Cópia Recorrente, com Células Tumorais (HRS Primária e Linhas Celulares) Comparadas Contra Células T Intratumor Saudáveis ​​de Primary CasEs. Se as células T são usadas como controle somático contra as populações de células HRS e células celulares derivadas de células B, os ganhos recorrentes podem ser observados nos receptores de células T alfa / delta e beta. Da mesma forma, as perdas recorrentes são detectáveis ​​em cadeias pesadas e kappa de imunoglobulina. Esta pesquisa foi originalmente publicada no Blood ⁷ . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Massa de entrada de DNA (n)	1-10 ng	25 ng	100 ng
Adaptador: inserir relação molar (r)	65: 1	25: 1	15: 1

Tabela 1: DNA InColoque a massa e o adaptador correspondente: Insira a relação molar. Os valores nesta tabela podem ser usados ​​como um guia para calcular a quantidade de adaptador de oligo para adicionar durante o passo de ligação do adaptador da construção da biblioteca.

Discussion

Futuras aplicações ou direções depois de dominar esta técnica

Este trabalho permite a sequenciação exoma de amostras contendo pelo menos 10 ng de DNA. No contexto clínico, este limite exclui a maioria das amostras de aspiração com agulhas finas devido ao material insuficiente, mas inclui biópsias básicas adequadas e amostras de biópsia excisional. Isso permitirá a aquisição de dados de um conjunto maior de possíveis amostras.

Passos críticos dentro do protocolo

As técnicas adequadas de congelamento e dissociação são fundamentais para o sucesso da experiência. Toda a amostra deve ser dissociada, incluindo seções fibróticas, tanto quanto possível. Utilizar um bico de 130 μm para tipos de células parece ser crítico para maximizar o rendimento das grandes células e DNA de HRS. Embora não tenham sido realizados experimentos controlados rigorosos com múltiplos tamanhos de bocal, aumenta significativamenteNos rendimentos das células foram observados usando o bico maior em comparação com os 100 μm, e praticamente nenhuma célula foi detectada no tipo de gaxeta de 85 μm (observação não publicada).

Modificações e solução de problemas

Ao trabalhar com menos de 100 ng de massa de DNA de entrada para a construção da biblioteca, deve-se tomar cuidado para reduzir todas as etapas desnecessárias de processamento e limpeza, especialmente antes da amplificação por PCR, uma vez que cada molécula única perdida resulta em uma redução da complexidade da biblioteca final . O protocolo recomenda deliberadamente a eluição de extratos em 50 μL porque este valor é compatível com a sonicação e o reparo final usando o equipamento recomendado. Desta forma, não é necessário reduzir o volume de eluição usando um evaporador centrífugo ou uma coluna para o passo de sonicação ou para reduzir o volume de sonicação para o passo de reparo final. Modificações adicionais neste protocolo são possíveis; Por exemplo, novos kits de construção de biblioteca podem melhorar a eficiência da ligação de adaptadores. Pode-se solucionar / otimizar, comparando as curvas de amplificação da biblioteca mediada pelo adaptador usando amplificação em tempo real em bibliotecas feitas com kits diferentes da mesma quantidade e qualidade do DNA de entrada.

Limitações da técnica

Pelo menos 10 ng de DNA de HRS purificado (aproximadamente 1.000 células ordenadas após perdas nas etapas de triagem e extração) parece ser a quantidade mínima para resultados de alta qualidade. Em experimentos piloto, o DNA de uma única amostra de células T purificadas foi usado pela primeira vez para fazer bibliotecas abrangendo uma série de massas de entrada. 100 ng (a quantidade recomendada padrão) do DNA de entrada foi comparado às bibliotecas geradas usando este protocolo de baixa entrada para 10 ng e 1 ng de DNA de entrada. A biblioteca gerada a partir de 10 ng de DNA de entrada não teve diferenças significativas da biblioteca de entrada de 100 ng em magnitude e distribuição deCobertura em todo o alvo, ou na fração de duplicação de PCR. No entanto, a biblioteca gerada com 1 ng de DNA de entrada resultou em uma fração duplicada de PCR significativamente maior e uma diminuição correspondente (aproximadamente 3 vezes) na cobertura média ao longo do alvo. Além disso, a biblioteca de 1 ng também exibiu desvio da uniformidade na cobertura, o que criou alterações de número de cópias falsas positivas em relação à biblioteca de 100 ng, ao contrário da biblioteca de entrada de 10 ng, que foi neutra em cópia na mesma avaliação. Por este motivo, tenha cautela usando menos de 10 ng de DNA de entrada usando este método.

Significado da técnica em relação aos métodos existentes / alternativos

Seguir o protocolo permitirá a sequenciação exoma completa de células HRS a partir de amostras primárias de linfoma de Hodgkin. As amostras de linfonodos CHL que contêm pelo menos 2 x 10 ⁷ células são adequadas para este procedimento. Isso não estava disponível anteriormente para pesquisaErs, que dependeram de técnicas como a microdissecção de captura a laser e a amplificação do genoma integral. Prevê-se que as abordagens genômicas para casos de LCR primários continuarão a ser valiosas para uma maior compreensão da patogênese da LCH. Os dados também apontam para a heterogeneidade significativa do nível do genoma dentro desta entidade da doença, com potencialmente pelo menos dois subconjuntos definidos que acompanham vagamente a estratificação morfológica entre a esclerose nodular e a celular celular mista. Finalmente, acredita-se que os dados do nível do genoma levará ao desenvolvimento de terapia direcionada para casos de LCR recidivados / refratários difíceis de tratar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri or Cell Culture Dish (sterile)
RPMI-1640 Media	Roswell Park Memorial Institute
Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated)
Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile
RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month)
scalpel with fresh blade
10 mL syringe (no needle)
Cryogenic vials
50 mL conical centrifuge tubes, force
Centrifuge			capable of handling 50 mL conical centrifuge tubes and providing 400g
Hepes buffer(1 M, cell culture grade)
phosphate buffered saline (PBS)
Pluoronic-F68	Thermo-Fisher	24040-032
DNAase-I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D4527-10KU	store as 5 mg/mL in RPMI in -200 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)
Sort Media (PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + Pluoronic –F68 (1x))
CD64-FITC (22)	Beckman Coulter, Miami, FL		20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD30-PE (BerH83)	BD Biosciences, San Jose, CA		20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD5-ECD (BL1a)	Beckman Coulter, Miami, FL		10 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10)	Ebiosciences, San Diego, CA		5 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD20-PC7 (B9E9)	Beckman Coulter, Miami, FL		10 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD15-APC (HI98)	BD Biosciences, San Jose, CA		20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD45 APC-H7 (2D1)	BD Biosciences, San Jose, CA		Can be substituted with 10 μL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested
CD95-Pacific Blue (DX2)	Life Technologies, Grand Island, NY		5 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD2 (5 μg; clone RPA-2.10)	Biolegend, San Diego, CA		For optional protocol; Titering is suggested
CD54 (10 μg; clone 84H10)	Serotec, Oxford, United Kingdom		For optional protocol; Titering is suggested
CD58 (10 μg; clone TS2/9)	eBioscience, San Diego, CA		For optional protocol; Titering is suggested
LFA-1 (12 μg; clone MHM23)	Novus Biologicals, Littleton, CO		For optional protocol; Titering is suggested
BD CS&T Beads	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Accudrop Beads	BD Biosciences, San Jose, CA
BC Versa Comp antibody capture beads	Beckman Coulter, Miami, FL		Compensation Beads
BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers	BD Biosciences, San Jose, CA		any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient
Wizard	Promega	A2360
10 mM Tris-Cl buffer	NA
Qubit dsDNA HS Assay kit	Life Technologies, Carlsbad, CA
S2 Sonicator	Covaris, Woburn, MA		Alternatives may be substituted
microTUBE	Covaris, Woburn, MA
Low-Throughput Library Preparation Kit	Kapa Biosystems, Wilmington, MA	KK8221
Sybr Green	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9430
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter, Miami, FL
Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SeqCap EZ Exome v.3.0	Roche Nimblegen	6465684001
HiSeq	Illumina
TruSeq-style Universal adapter	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T
TruSeq-style index adapter	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq-style PCR primer 1	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		AATGATACGGCGACCACCGAGA
TruSeq-style PCR primer 2	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
Nuclease Free Duplex Buffer	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa
BD FACSDIVA software	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Falcon Tubes	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Flow Tubes	BD Biosciences, San Jose, CA