Flow-sortering en Exome Sequencing van de Reed-Sternberg Cellen van Klassieke Hodgkin Lymfoom

Summary

Hier beschrijven we een gecombineerde flow cytometrische celsortering en een laag ingevoerde, volgende generatie bibliotheekconstructieprotocol dat is ontworpen om hoogwaardige, volledige exome data van de Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) cellen van klassiek Hodgkin lymfoom (CHL) te produceren.

Abstract

De Hodgkin Reed-Sternberg cellen van klassiek Hodgkin lymfoom zijn gering verdeeld binnen een achtergrond van ontstekingslymfocyten en omvatten gewoonlijk minder dan 1% van de tumormassa. Materiaal afgeleid van bulk tumor bevat tumor inhoud bij een concentratie onvoldoende voor karakterisering. Daarom wordt de fluorescentie geactiveerde celsortering met behulp van acht antilichamen, evenals zij- en voorwaartse verspreiding hier beschreven als een methode om snel met duizend HRS-cellen uit de tumor voor de volgende studie snel te scheiden en te concentreren. Tegelijkertijd, omdat standaardprotocollen voor exome-sequencing meestal 100-1000 ng input-DNA nodig hebben, dat vaak te hoog is, ook bij het sorteren van vloeistoffen, bieden wij ook een geoptimaliseerd, lage invoer bibliotheekconstructieprotocol dat in staat is hoge kwaliteit te produceren Gegevens van zo weinig als 10 ng input DNA. Deze combinatie kan de volgende generatie bibliotheken produceren die geschikt zijn voor hybridisatie-opname van whole-eXome aasjes of meer gerichte gerichte panelen, zoals gewenst. Exome sequencing van de HRS-cellen, in vergelijking met gezonde T-cellen van T-cellen of B, kunnen somatische veranderingen identificeren, waaronder mutaties, invoegingen en deleties, en kopie-nummerveranderingen. Deze bevindingen verduidelijken de moleculaire biologie van HRS-cellen en kunnen routes voor gerichte geneesmiddelen behandelen.

Introduction

Bevorderingen in kankergenetica als gevolg van volgende generatie sequencing hebben geleid tot significante doorbraken bij de identificatie van therapeutische doelen en in prognosticatie voor veel hematologische en niet-hematologische neoplasma's. Nieuwe geïndividualiseerde behandelingsstrategieën op basis van specifieke genomische veranderingen worden snel ingevoerd in veel tumortypes (onderzocht in referenties ^{1 , 2} ). Ondanks de significante vooruitgang in de lymfoom genomics, was het genoom van de neoplastische HRS-cellen in klassiek Hodgkin lymfoom (CHL) onderzocht. De onderzoeken zijn belemmerd door de schaarste van neoplastische HRS-cellen binnen een reactieve microomgeving, waardoor het moeilijk is om gesuiverde HRS-celpopulaties te isoleren ³ .

De werkwijze voor het isoleren van levensvatbare HRS-cellen uit primaire tumoren werd ontwikkeld door Fromm et al. ^{4 ,}Ref "> 5 ^{, 6.} De methode maakt gebruik van een acht-antilichaamcocktail, bestaande uit CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 en CD64 om ondubbelzinnig HRS-cellen te identificeren uit een CHL tumor suspensie. Zijn in staat om ten minste 1000 levensvatbare HRS-cellen te isoleren uit verse of bevroren cel suspensies van tumorbiopsies bestaande uit ten minste 10 ⁷ cellen (ongeveer 10 mg weefsel). De zuiverheid is meer dan 90% door middel van flowcytometrische analyse en wordt geschat op Minstens 80% door middel van exome genomische analyse van tien opeenvolgende gevallen.

We hebben een flow-cytometrische celisolatie techniek verfijnd die het proces aanzienlijk vergemakkelijkt, waardoor een snelle isolatie van duizenden levensvatbare HRS-cellen uit primaire CHL tumoren ^{7 mogelijk is} . We hebben de techniek gebruikt om te produceren wat wordt aangenomen dat het de eerste hele exome sequentie van de tumorcellen is in primaire gevallen van Hodgkin lymfoom. Onze studies tonen aan datE haalbaarheid van high-throughput, genoom-brede studies van individuele CHL-gevallen en hebben al geleid tot de identificatie van nieuwe genomische veranderingen met het potentieel om aspecten van CHL pathogenese uit te leggen.

We hebben verder een pijpleiding ontwikkeld om het geëxtraheerde DNA te gebruiken voor genomische studies met hoge doorvoer. Om betrouwbare resultaten te verkrijgen van zo weinig als 1.000 gesorteerd HRS cellen (het minimum verkregen uit sequentiële gevallen), ontwikkelden we een gewijzigde volgende generatie DNA bibliotheek constructie procedure ⁸ die ons toestaat om de adapter ligatie efficiëntie te verhogen en DNA fragmenten bibliotheken te genereren Zonder overmatige amplificatie. Deze methode zorgt voor de analyse van routine klinische monsters en de detectie van herhalende mutaties en chromosomale veranderingen ⁷ .

Protocol

1. Weefselverwerking en bevriezing

1. Verzamel lymfeklierenweefsel in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) en verwerk binnen 24 uur van de verzameling. Breng gesneden lymfeklierweefsel ^{9 over} op een Petri-schotel die 10 ml RPMI bevat met 2% foetaal kalfserum (FCS) en fijnmeel het met een vers scalpelblad. Gebruik de achterkant van een 10 ml injectiespuit om het weefsel verder te slijpen / los te maken.
2. Breng de vloeistof over in een 50 ml conische buis door een 100 μm celzeef. Spoel de petri schotel en het filter met nog eens 10 ml RPMI 2% FCS.
3. Verkrijg een celtelling met behulp van een geautomatiseerde celteller of een hemocytometer.
   OPMERKING: In het algemeen zou minstens 2 x ¹⁰⁷ cellen van ongeveer 5 mm ³ CHL lymfeklierenweefsel worden verwacht. Een levensvatbaarheid van meer dan 80% wordt verwacht, maar het kan per steekproef variëren.
4. Spin de cellen bij 400 xg gedurende 10 minuten en aspiraOp de supernatant. Plaats de buis bevattende celpellet op ijs.
5. Pre-chill bevriezing medium op ijs. Resuspendeer de cellen in koudvriesmedium bij een concentratie van 2 x ¹⁰⁷ / ml en resuspendeer het door pipettering. Niet vortex. Incubeer de suspensie op ijs gedurende 10 minuten.
6. Aliquot het monster 1 ml / cryovial (voorgekoeld op ijs). Breng de flesjes gedurende 1 tot 2 dagen in een -80 ° C-vriezer en breng ze opnieuw in vloeibare stikstof.

2. Bereiding van cel suspensies voor celsortering

OPMERKING: Elke partij antilichaam moet goed getiteld worden met behulp van 10 miljoen cellen in een 300 μ μg kleuring volume. Perifere bloed kan worden gebruikt voor alle antilichamen behalve CD30, waarvoor de KMH2 cellijn die in perifeer bloed wordt gespoten, gebruikt kan worden voor titratie ¹⁰ . We beginnen over het algemeen met het door de fabrikant aanbevolen volume antilichaam en voeren twee tweevoudige verdunningen en een tweevoudige toename (vier data punten)Voor elke partij antilichaamtitratie. Bijvoorbeeld, als de fabrikant een 10 μl volume aanraagt, voeren we de titratie uit met 2, 5, 10 en 20 μL volumes.

1. Zet een waterbad op 37 ° C. Premix de getijde hoeveelheid antilichamen in een donkere glazen flesje en voeg PBS + 2% BSA toe voor een totaal cocktailvolume van 100 μl.
   OPMERKING: Hoewel we aanraden om de antilichamen te titeren, kunnen de volgende volumes als uitgangspunt worden gebruikt: CD64, 20 μL; CD95, 5 μl; CD30, 20 μl; CD5, 10 μl; CD20, 10 μl; CD15, 20 μl; CD40, 5 μl; En CD45, 10 μl.
2. Breng de flesje van vloeibare stikstof over in een ijsbak met droog ijs om ontdooien te voorkomen. Voorverwarmen 50 ml ontdooimedium met RPMI / 20% FCS / DNase (100 μg / ml) in een 50 ml conische buis in een 37 ° C waterbad.
3. Breng 45 ml ontdooidemperatuur naar een frisse buis en hou het bij 37 ° C. Doe de cellen snel op door een cryogene flesje in een waterbad van 37 ° C te houdenH tot alleen een zeer klein bevroren gedeelte blijft.
4. Giet de inhoud van de flacon in de buis die 45 ml ontdooid medium bevat. Spoel de lege cryogene injectieflacon 2 keer uit met 1 ml ontdooimiddel en combineer de spoelwater.
5. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om DNase-spijsvertering mogelijk te maken en cel-evenwicht te herstellen. Spin de cellen bij 500 xg gedurende 10 minuten en aspirateer het supernatant.
6. Resuspendeer de cellen in ongeveer 200 μl van het ontdooimedium (5 ml), en laat het gedurende 2-3 min tot kamertemperatuur evenwaren. Herstel van> 70% van de bevroren levensvatbare cellen wordt verwacht.
   OPMERKING: Voor een grotere zuiverheid van gesorteerde HRS-cellen die door bijgevoegde T-cellen kunnen worden geroosterd, kan bij deze stap een cocktail van niet-gelabelde antilichamen worden toegevoegd (zie het optionele protocol).
7. Voeg 100 μl van een antilichaamcocktail toe en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT), beschermd tegen licht. Voeg 3 ml sorteermedium toe, draai de cellen op 500 xg afGedurende 10 minuten en aspireren van de supernatant.
8. Resuspendeer de cellen in 1 ml sorteringsmedium en breng ze over op een 5 ml stromingsbuis bovenste zijkant.
9. Spoel zowel de 50 ml conische buis als de celzeef af met een extra 1 ml sorteermedium en plaats cellen op ijs.

3. (Optioneel Protocol) T Cell Rosette Blokkeren

OPMERKING: HRS-cellen worden door T-cellen in weefselsecties en cellesuspensie gerasetteerd, en deze T-cellen kunnen de gesorteerde HRS-fractie potentieel besmetten. Deze interacties worden gemedieerd door CD54 en CD58 op de HRS-cel die bindt aan LFA-1 en CD2 op de T-cellen ^{4 , 11} . Deze interacties kunnen worden geblokkeerd met niet-gelabelde antilichamen tegen deze adhesiemoleculen.

1. Aliquot 100.000 tot 500.000 cellen in 100 μL RPMI.
2. Incubeer de cel suspensie met niet-gelabelde antilichamen tegen CD2, CD54, CD58 en LFA-1 (10 μl elk) op ijs gedurende 1 uur. THij cel suspensie kan nu worden gemerkt met fluorescerende antilichamen.

4. HRS-, B- en T-celisolatie met behulp van celsortering

OPMERKING: Hoewel we een speciaal onderzoeksorderinstrument gebruikten met 5 lasers (zie de materiaalspreadsheet), moet elke sorter met de mogelijkheid om de fluorochromen te detecteren die in het antilichaampaneel gebruikt worden, voldoende zijn. De uitvoering van de onderstaande stappen vereist een vertrouwdheid met software ^12- functie en een basiskennis van cell-sorteringsoperaties. Raadpleeg de online software handleiding voor gedetailleerde instructies.

1. Cytometer setup:
   1. Zet de computer aan en log in. Schakel de BSC (en BSC-uitgangen) in en zet de cytometer aan. Wacht tenminste 90 s voor de interne CPU van de cytometer om te starten en open vervolgens de lasercontrole software en controleer of alle lasers zijn ingeschakeld. Start de cytometer software ¹³ en login.
   2. Klik in de cytometersoftware op "Cytometer → View Configurations." Wanneer het dialoogvenster voor het configuratie-subprogramma wordt geopend, markeer de 130-μm aangepaste configuratie en klik op "Set Configuration" en "OK." Verlaat het configuratie-subprogramma.
   3. Controleer het dialoogvenster in de cytometer software en klik op "Gebruik CS & T instellingen." Installeer een 130 μm spuitmond in het instrument en zet de stroom aan door op de rode "X" knop in het stroomvenster te klikken. Laat het instrument gedurende minstens 30 minuten opwarmen.
   4. Voer een prestatiecontrole uit op het instrument met behulp van de gewenste methode (een software voor prestatie-tracking software is bijgeleverd met de sorteerder die hier wordt beschreven, zie de softwarehandleiding (blz. 117-122) en referentiestandaard (raadpleeg de materialen voor de standaard die wordt gebruikt in Deze instelling).
      1. Klik op "Cytometer → CST," zorg ervoor dat het veld "Karakteriseren" is ingesteld op "ChecK Performance "in het vervolgkeuzemenu en klik op" Run. "Wanneer u wordt gevraagd door software, laad u een tube van referentie deeltjes op het monster stadium en klikt u op" OK ".
      2. Nadat de run is voltooid, klikt u op "Finish" en sluit de software module. Nadat de cytometersoftware opnieuw is aangesloten op de cytometer, klikt u op 'CS & T-instellingen gebruiken' in het dialoogvenster dat verschijnt.
   5. Bepaal de juiste drop delay met behulp van de automatische drop delay functie van de cytometer software (zie pag. 154 - 161 van de software handleiding).
      1. Open het experiment "Drop Delay" in het venster "Browser" van de cytometer software, installeer een buis kalibratie deeltjes in het monster stadium en klik op "Load" in het venster "Acquisition Dashboard". Zet de automatische stream monitoring functie aan door op de "Sweet Spot" knop in het "Stream" venster te klikken. Verlaat deze functie te allen tijde voor alle followinG stappen.
      2. Schakel de spanningspanningsspanning in door de knop "Spanning" in het zijstroomvenster te klikken en toetssoorting aan te zetten door op de knop "Sorteer op de toets" direct naast de "Spanning" knop te klikken.
      3. Stel alle zijinstellingen op nul, behalve de linkerkantstroom. Stel de instelling voor de linkerkantiestroom zodanig aan dat er twee stroompunten zichtbaar zijn in het zijstroomvenster. Klik op de knop "Optische filter" en controleer of de linker zijstromingspunt in het linker vakje valt dat in het zwarte gedeelte van het zijstroomvenster verschijnt.
      4. Stel indien nodig de linker zijstroominstelling aan. Schakel de testsortering uit door op de knop "Test Sorteren" te klikken. In het venster 'Browser' breid je het 'Global Worksheets'-element uit van het experiment' Drop Delay 'door op de knop' + 'te klikken.
      5. Dubbelklik op "Sorteer Layout_001" om de sorteerlay-out te openen, controleer het met visuele inspectieIon dat de linker sorteerpopulatie "P1" heeft toegewezen en klik op "Sorteer" in het venster "Sorteren". Klik in het venster 'Sorteren layout' op 'Automatische vertraging' en vervolgens op 'Uitvoeren'.
      6. Wanneer de run is voltooid, klikt u op 'Exit'. Installeer een buis steriel gedeïoniseerd water op het monster stadium en klik op "Load" in het venster "Acquisition Dashboard". Doe de buis water gedurende ten minste 5 minuten om de resterende testdeeltjes uit het instrument te verwijderen voordat u verder gaat.
   6. Voer compensatiecontroles uit (met behulp van compensatiekralen uit de spreadsheet Materialen of gelijkwaardig) met behulp van een ingebouwde compensatie-instelling in de sorteringssoftware (zie pag. 131 - 137 van de softwarehandleiding voor meer informatie).
      1. Maak een nieuw experiment door op "Experiment New Experiment" te klikken. In het tabblad 'Parameters' van het venster 'Instrumentstatus' verwijder u, indien niet, ongebruikte parameters. Klik op "Experiment CompensatIon Setup Creëer compensatiecontroles. "
      2. In het venster 'Browser' breid je het 'Compensation Controls' -voorbeeld uit door op het '+' teken te klikken. Voer compensatiebeheersbuizen uit zonder de gegevens op te nemen en pas de detectorspanningen aan (in het tabblad "Parameters" van het venster "Instrument Status") zodat de positiefgekleurde kraalpopulaties voor elk fluorochroom tussen kanaal 10.000 en 100.000 liggen en zijn De helderste in hun primaire detectiekanaal.
      3. Schrijf de benodigde spanningen voor elke parameter voor elke buis neer. Markeer de "Unstained Control" -buis onder het "Compensation Controls" -voorbeeld door enkel te klikken op de linkerzijde. Laad de onbedekte controlebuis op de monstertrap en klik op "Load" in het venster "Acquisition Control".
      4. Voer de vastgestelde spanningen handmatig in door de afzonderlijke compensatiecontroles in de detectorspanningsvelden voor alle parameters te gebruiken, enKlik dan op 'Record' in het venster 'Acquisitiebeheer'. Voer alle resterende compensatiecontroles uit, controleer de gegevens zonder de instellingen van de detector te wijzigen. Installeer een buis steriel gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten om het resterende materiaal uit het instrument te verwijderen voordat u verder gaat.
2. HRS-celgat:
   1. Acquireer en record ten minste 100.000 gebeurtenissen voor de eerste gating terwijl de stromingssnelheid wordt aangepast om 3.000-4.000 gebeurtenissen / s te verwerven (zie stap 4.1).
      OPMERKING: Het kan nodig zijn extra sorteermedium toe te voegen om de cellen te verdunnen indien de celconcentratie te hoog is. Stop de overname.
   2. Gate HRS-cellen met behulp van de stappen die in Figuur 1 zijn omschreven
      OPMERKING: in de meeste CHL-gevallen zijn tussen 0,01% en 0,1% van de cellen HRS-cellen.
3. B- en T-celgaten:
   1. Identificeer somatische controles (B- en T-cellen) door de gating van CD20 en CD5, respeCtively (gate lymfocyten door CD45 / SSH), gevolgd door CD20 versus CD5 (zie Figuur 1 ).
   2. Doelcollectie stroomt naar verzamelbuizen in een voorgekoelde tweerichtings- of vierweginvoerrek. Vul de vloeibare buizen of 15 ml centrifugestijlbuizen tenminste halverwege met inzamelingsmedium.
   3. HRS toewijzen en besturingspopulaties toewijzen aan de juiste collectiebuizen in de sorteerinstelling volgens de instructies van de leverancier. Start de celverwerving opnieuw en start het sorteren.
   4. Verzamel alle HRS-cellen en maximaal 1 miljoen B- en T-cellen. Doel de verzamelstromen naar verzamelbuizen in een voorgekoelde vierweg (of twee-weg) verzamelrek.

5. DNA-extractie

1. Pellet verzamelde cellen door centrifugeren in 1,5 ml conische buizen bij 3.000 xg gedurende 10 minuten en één keer opnieuw met 1 ml PBS opnieuw wassen om de cellen te wassen.
2. Pellet nog eens bij 3.000 xg gedurende 10 minuten en verwijder de supernatant; Wees voorzichtig om niet te storenDe kleine pellet
3. Voeg 150 μL lysisbuffer (of een geschikt volume voor de gebruikte kit) toe aan de gewassen cellen en meng door pipettering omhoog en omlaag.
   OPMERKING: Men kan cellysaat bij -70 ° C op dit moment opslaan, indien nodig.
4. Construeer een kolomsamenstel door de filterkolom in de buis te plaatsen en voeg het lysaat van stap 5.5 naar de kolom toe. Spin de montage bij 13.000 xg gedurende 3 minuten.
5. Verwijder de minicolumn uit de montage en verwijder de vloeistof in de collectiebuis. Vervang de minicolumn in de collectiebuis.
6. Voeg bij elke montage 650 μL kolomwasoplossing toe. Centrifuge gedurende 1 minuut bij 13.000 x g. Gooi de vloeistof uit de verzamelbuis. Herhaal deze stap voor in totaal 4 wasjes.
7. Gooi de vloeistof uit de verzamelbuis en monteer de minicolumn assembly. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 13.000 xg om de bindingsmatrix te drogen.
8. Breng de minicolumn over naar een nieuwe 1,5 ml buis en voeg 25 μl 10 mM Tris-Cl toe, welkeHeeft de voorkeur aan de volgende sonicatiestap, of Nuclease-Free Water verwarmd tot 65 ° C. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer de montage bij 13.000 xg gedurende 1 minuut. Herhaal opnieuw met 25 μL voor een totaal van 50 μl.
9. Meng de DNA-elutie door pipettering omhoog en omlaag en kwantificeer met behulp van fluorimetrie ¹⁴ .

6. Bibliotheekbouw

1. Voorbereiding voor aanvang:
   1. Zet de sonicator op waterniveau 12, intensiteit 5, cycli / burst 200 en temp 7 op.
   2. Op basis van de beschikbare DNA-hoeveelheid, bepaald door fluorimetrie en op het experimentele ontwerp, bepaalt u de hoeveelheid DNA die u wilt gebruiken voor bibliotheekconstructie.
      OPMERKING: Houd er rekening mee dat als er te weinig DNA wordt gebruikt en de kwaliteit van de bibliotheek is gecompromitteerd, kan er weinig toepassing zijn op materiaal dat achtergelaten wordt voor validatie doeleinden. Voor substandaard invoerhoeveelheden, hoe groter de invoermassa, hoe hoger de compLexiteit van de resulterende sequencing bibliotheek. Enkele richtlijnen voor dit protocol zijn als volgt: 10 ng moet goede resultaten opleveren en 50 ng kan een ruw maximum worden beschouwd.
   3. Beslis op de adapter: plaats de molaire verhouding los op de waarden in tabel 1 .
   4. Bereken de hoeveelheid adapter die op de volgende manier gebruikt moet worden:
      OPMERKING: Aantal mol DNA-invoer, n
      ik. N = 1,54e-12 ^-12 * invoermassa (in ng) / (gemiddelde fragmentgrootte)
      ii. Wanneer de gemiddelde fragmentgrootte 200 bp is, vereenvoudigt dit om:
      N = 7,7e-15 * invoermassa (in ng)
      Aantal mol adapter inclusief, a
      ik. A = n * r
      Volume van adapter voorraad om te gebruiken in adapter ligatie stap, v
      ik. V (in μL ) = a / [ 10 ^-12 * adapter voorraadConcentratie (in μM )]
      OPMERKING: als de adapterconcentratie laag is, om ervoor te zorgen dat de benodigde hoeveelheid adapter is inbegrepen, kan de adapteroplossing gebruikt worden om de eindreparatiereagens in plaats van water te verdunnen.
      Voorbeeld: Voor 100 ng input DNA met een gemiddelde fragmentgrootte van 200 bp, voor een gewenste molaire adapter: voeg de verhouding van 15: 1 en een adapter voorraadconcentratie van 2 μM toe, het aanbevolen volume van de adapter die u wilt gebruiken is 5,8 μL.
   5. Geef geïndexeerde barcodes toe aan de monsters.
      OPMERKING: Bibliotheken die samen worden samengevoegd tot een hybridiseringsreactie of een baan op de stromingscel van een sequencer mogen geen overbodige indices bevatten.
2. Bibliotheekconstructie - DNA scheren:
   1. Voeg de volledige hoeveelheid DNA toe die gebruikt moet worden voor een sonicatiebuis. Als het volume van het monster dat alleen het input DNA bevat minder dan 50 μL is, voegt u Buffer EB tot een 50 μL totaal volume toe en meng.
   2. Sonicate voor 30 s.
   3. Verwijder de buis en voer een snelle draai in een mini centrifuge net genoeg om elke spuit uit het bovenste gedeelte van de muren van de microtube te verzamelen.
   4. Herhaal stappen 6.2.2-6.2.3 voor een totaal van zeven 30's sonication sessies voor in totaal 210 s van sonication.
      OPMERKING : Voel je vrij om te experimenteren met het verdelen van de 210 s in minder sessies.
3. Bibliotheekconstructie - Eindreparatie, A-tailing en adapterligatie:
   OPMERKING: Vermijd om het even welke grootteselectie te maken voor de bibliotheek PCR versterking stap.
   1. Volg de instructies van de fabrikant ¹⁹ voor eindreparatie en A-tailing na de sonicatie van het monster DNA.
   2. Gebruik de juiste hoeveelheid mol adapter (berekend in stap 6.1.3) na de A-tailing in de reactie. Combineer de adapter, A-tailed DNA fragmenten, enzym en buffer en incubeer gedurende ongeveer 16 uur 's nachts bij 20 ° C.
4. libRary bouw - Bibliotheek versterking:
   1. Voer een kraalopruiming uit van de adapterligatie-reactie. Na het toevoegen van kralen aan het PCR-product wacht 5 minuten bij kamertemperatuur. Plaats het tegen een magnetische stand en verwijder de vloeistoffen, doe er twee keer in 200 μl 80% ethanol, droog de kralen lang genoeg om het grootste deel van de vloeistof te verwijderen zonder te drogen, en eluteer het DNA van de kralen door 25 μl pipetiseren Nuclease-vrij water, zoals gezegd, op de kralen terwijl de buis tegen een magnetische stand blijft.
      OPMERKING: het kan mogelijk zijn om te experimenteren met het behoud van de kralen in polyethyleenglycol
      (PEG) tot na de versterking in plaats van ze te verwijderen, maar dit is niet getest.
   2. Inclusief 0,6 μl van een 1: 1.000 verdunning van groene kleurstof per 50 μl PCR master mix. Als alternatief gebruik een realtime PCR-compatibele intercolerende kleurstof in de juiste hoeveelheid voor de apparatuur.
   3. Programmeer de PCR-reactie bij 98 ° C voor45 s voor de initiële denaturatie, gevolgd door een cyclus van denaturatie, gloeien en verlenging bij 30 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 30 s, of het geschikte programma kiezen bij gebruik van een alternatief Polymerase enzym.
      1. Stel de machine in om de fluorescentiedata bij elke cyclus bij 72 ° C te nemen. Programmeer een laatste extensie bij 72 ° C gedurende 1 minuut gevolgd door een greep bij 4 ° C voor onbepaalde tijd. De PCR primers voor de amplificatie van de adapter geligeerde bibliotheek met behulp van reagentia in de aanvullende tabel zijn: Oligo 1, AATGATACGGCGACCACCGAGA en Oligo 2, CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
   4. Versterk de bibliotheek met behulp van de hierboven beschreven PCR-condities terwijl de fluorescentie-intensiteitswaarden in real time met de qPCR-software worden nageleefd, net voor het einde van de exponentiële groeifase.
   5. Na amplificatie, doe een standaard kralenopruiming (zie stap 6.4.1) met behulp van 0,8x het volume van de amplificatiereactie recovEred, typisch 0,8 x 50 = 40 ul kralen. Voeg de kralen toe aan het PCR-product en wacht 5 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Plaats het tegen een magnetische stand en verwijder de vloeistoffen, doe twee keer in 200 μl 80% ethanol, droog de kralen lang genoeg om het grootste deel van de vloeistof te verwijderen zonder te drogen en elute door nuclease-vrij water aan de droge kralen toe te voegen.
   7. Kwantificeer het resulterende DNA met behulp van fluorimetrie. Visualiseer de bibliotheekfragmenten voor grootte; Zie de sectie over Data QC verwachtingen voor meer details.

7. Exome Hybridisatie

1. Combineer vier bibliotheken met aparte adapter barcodes.
   OPMERKING: Massa door fluorimetrie en grootte per gel worden gebruikt om de marge te berekenen, en vervolgens worden bibliotheken gecombineerd in equimolaire hoeveelheden voor een totaal van een 1.000 ng massa samengevoegde bibliotheek. Het is het beste om alle tumor-normale paren samen te houden in plaats van ze te scheiden in aparte zwembaden.
2. Pas het exome capture protocol toe Up class = "xref"> 15 en doe 8 PCR cycli na de opvangopruiming. Andere keuzes van vastleggingsdoelstellingen kunnen mogelijk zijn.

8. Multiplexed Sequencing

1. Volg een enkele hybridisatie-opname die vier gemultiplexeerde bibliotheken bevat in een enkele baan op het sequencingplatform dat wordt verwezen in de Materials Spreadsheet ¹⁶ .
   OPMERKING: Alternatieve configuraties zijn mogelijk voor geavanceerde gebruikers die hun dekkingsdiepte van de dekking verder willen plannen en optimaliseren.

9. Analyse (kan worden vervangen door alternatieve pipeline (s) indien gewenst)

1. Snps en kleine indels:
   1. Kaart rauwe data naar het menselijk referentiegenoom, UCSC hg19, met behulp van Burrows-Wheeler Aligner (BWA) ¹⁷ of een alternatief algoritme van keuze. Filter of markering leest met een mapping kwaliteitscore onder 20 en PCR duplicaten met Samtools ¹⁸ of PicardRef "> 19.
   2. Bepaal somatische nucleotidevarianten en kleine indelen in HRS-monsters in vergelijking met de T-cel somatische controles met behulp van Strelka ²⁰ of een variant beller van keuze. Pas snpEff ^{21 toe} om de Strelka-uitvoer te annoteren. Indien gewenst, inspecteer variant loci voor artefacten met behulp van de Integrated Genome Viewer (IGV) ^{22 , 23} .
2. Kopieernummer veranderingen:
   1. Bereken de log-getransformeerde ratio " ltr " voor elk exome-doelinterval " i " van intra-bibliotheek genormaliseerde leescijfers in de tumor tegen die van de normale op de volgende manier:
      
      OPMERKING: c is het aantal leadschappen naar een bepaald capture interval, l is de totale bibliotheekgrootte, t wijst op tumor en n is normaal.
   2. Filterintervallen met onvoldoende dekking ( C _t + C _n <100 leest) voor verdere analyse. Doe pan-interval segmentatie met behulp van DNAcopy v.1.0 ²⁴ van Bioconductor in R.
      OPMERKING: Beschouw segmenten waar de absolute waarde van de gemiddelde ltr lager is dan 0,5 om copy-neutral te zijn. Resterende segmenten kunnen worden aangewezen als kopie-nummerwinsten, als het teken van de gemiddelde ltr positief is (met andere woorden, er zijn significant meer in het tumormonster dan in het normale monster na normalisatie) of kopieergetallenverliezen, als het teken Van de gemiddelde ltr is negatief.

Representative Results

Een bioanalyzer plot moet worden genomen na bibliotheek amplificatie en 0,8x kraal opruimen. Men zou een "normaal" verspreiding van fragmentgroottes moeten zien in het gewenste bereik ( figuur 2a ). Afwijkingen van deze vorm, zoals een zichtbare "schouder" in de kromme, geven de aanwezigheid aan van een artefact met een hoge of lage molecuulgewicht. Bijvoorbeeld , Figuur 2b -2d toont voorbeelden van bibliotheken die zichtbare artefacten bevatten die ideaal zouden moeten worden gesorteerd. Als een bibliotheek aanzienlijk gecompromitteerd is, kan het de moeite waard zijn om de bibliotheekconstructie te herhalen als er DNA beschikbaar is en / of het sorteren van de cellen om fris te beginnen.

Een adapter dimer kan soms door de eerste 0,8x kraalopruiming overdragen. Als dit gebeurt, zal het zichtbaar zijn als een scherpe piek die rond 125 - 130 bp wordt gecentreerd (zie figuurE 2c). In dit geval is het raadzaam om een ​​extra 0,8x kraalopruiming te herhalen en de bioanalysator te herhalen om de succesvolle verwijdering van de dimer te waarborgen.

Door gebruik te maken van de specificaties die in dit protocol worden beschreven en de sequencing te multiplexeren op het niveau van vier monsters per baan in de sequencer die in de Spreadsheet van de Materialen staat, wordt een median diepte van de dekking van 50-100x over het doel bereikt (nadat de bioinformatica verwijdering van PCR-duplicaat leest) Is haalbaar (zie figuur 3a ). Daarnaast moeten bibliotheken die niet oververversteld zijn en dat resulteerde in bibliotheken met een adequate dekking, schone kopie nummer plots produceren. Tijdens het vroege werk werd dit bibliotheekconstructieprotocol getoetst over drie orders van grootte van de invoermassa, en variabele resultaten werden ontdekt (zie de discussie sectie). Kopieer getal plots gegenereerd met behulp van een bibliotheek gegenereerd van 1 ng, een suboptimale hoeveelheid input DNA, Resulteerde in onjuiste kopie nummer winsten en verliezen ( Figuur 3b , onder).

Ongeveer 70% van de gevallen van CHL dragen B2M en A20 mutaties en / of deleties ⁷ . B2M mutaties omvatten overwegend een translatie startplaats, een eerste exon stopplaats en een eerste exon stopplaats. A20 mutaties zijn een mix van kopie nummer verliezen en indels. De mutaties lijken clonaal te zijn en kunnen gebruikt worden om relatieve tumorinhoud te schatten. Als T-cellen als somatische controles worden gebruikt, zal HRS-sequentie significante kopie-aantal winsten aantonen in de posities die overeenkomen met T-celreceptor alfa / delta (14q11-12) en bètaposities (7q32-35), evenals significante verliezen in de B-celreceptor zware keten (14q32) en kappa lichte ketenposities (2p11) (zie Figuur 4 ). Totale sequentie toont een bereik van 100 tot 400 somatische mutaties per geval. Kopieernummervariatie is zeer vGevarieerd van geval tot geval, met enkele gevallen waarin talloze segmentale winsten en verliezen zijn en andere gevallen die slechts enkele wijzigingen aantonen.

Figuur 1: Multiparameter Gating voor Flow-sortering van levensvatbare HRS-, B- en T-cellen. Bevolking namen worden op plots weergegeven en geven de ouderpopulatie van elke poort aan. ( A ) toont alle cellen: Teken in het FSC-H versus FSC-A histogram een ​​SINGLETS-poort die populaties omvat met proportionele FSC-H en FSC-A-verhogingen. Gebruik dubbele dubbeltjes die hoge FSC-A en FSC-H hebben. Hodgkin-cellen zijn zeer groot; Breid de poort uit om hoge FSC-H en FSC-A evenementen op te nemen. ( B ) Exclusief puin, dode cellen en onbelichte RBC's die normaal gesproken lager FSC-A hebben en lichte stijgingen in SSC-H zonder levensvatbare populaties te elimineren (VIABLE gate). ( C ) Gate MONONUCLEAR cellen aanFSC-A versus SSC-H om granulocyten uit te sluiten met hoge SSC-H; Let op dat de poort alleen gebruikt wordt voor de identificatie van T- en B-cellen. ( D ) Gate T CELLS positief geïdentificeerd door CD5 (groen) zonder CD20 en B CELLS (blauw), die CD20 expressie zonder CD5 hebben. ( E ) Teken een grotere poort op het CD45 / SSH plot, inclusief 10-20% van de lymfoïde cellen en alle granulocytische cellen. ( F ) Gate CD30-positieve gebeurtenissen met dim naar negatieve CD64 / FITC autofluorescentie. ( G ) Onder CD30 positieve gebeurtenissen, gate CD40- en CD95-positieve gebeurtenissen (CD30 / 40/95 HRS poort, rood). ( HL ) Let op de bevestigende immunofenotypische eigenschappen op HRS-cellen; HRS-cellen spreken in het algemeen geen CD20 (plots H en L) uit. De expressie van CD5 is gecorreleerd met CD45 door T-cel rozet (I); De meeste gevallen zullen CD15 uitdrukking geven en zal helder zijn voor CD71 ( J ). CD40 en CD95 expressie is over het algemeen boven het niveau van B en T cellen resp Ectief ( K ). Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Blood ⁷ . Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Grootteverdeling Plots van Monsters na Adapter Ligation en Amplification. Ideaal gezien moeten bibliotheken met zichtbare artefacten worden herhaald en niet sequentieerd. (A) Goed gevormde bibliotheek; Geen zichtbare artefacten. ( B ) Asymmetrie in de kromme laat een probleem zien. (C) Significante adapter dimer (piek bij 128) en een artefact met hoog molecuulgewicht (> 400 bp). De dimer kan worden gereinigd met een extra 0,8x kraalopruiming. ( D ) significant artefact met hoog molecuulgewichtS / ftp_upload / 54399 / 54399fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Bioinformatic Quality Control Measurements voor bibliotheken van hogere kwaliteit gemaakt van 10 ng Input DNA In vergelijking met lagere kwaliteit bibliotheken gemaakt van 1 ng Input DNA. De omvang en de verdeling van de unieke leesdiepte van de dekking verwachtingen. (A) Een median diepte van de dekking van ten minste 50 wordt verwacht bij gebruik van 10-100 ng input DNA. ( B ) Elk van de 2 panelen geeft afbeeldingen van de kopieergetalvariatieanalyse af, die gegevens vergelijken tussen 2 opeenvolgende bibliotheken. Exonische sondesegmenten (x-as) versus kopie-nummerverandering op een log _2- schaal (y-as) zijn opgesteld voor een enkel representatief chromosoom (chr 6). Vergelijking van gegevens van een 10 ng lage invoer bibliotheek van intratumoraleT-cel DNA naar een 100 ng normale invoer bibliotheek van intratumoraal T-cel DNA uit dezelfde zaak vertoonde geen significante valse positieve resultaten; Dat wil zeggen, lage invoer en normale invoer bibliotheken zijn kopie-neutraal (bovenaan). Verschillende vals positieve segmentale kopie-nummerveranderingen werden genoemd wanneer gegevens uit een 1 ng lage-invoer bibliotheek van intratumoraal T-cel DNA werden vergeleken met een 100 ng normale-ingangsbibliotheek uit intratumoraal T-cel DNA uit hetzelfde geval (bodem). Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Blood ⁷ . Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Recurrente kopie nummerwinsten en -verliezen, met tumorcellen (primaire HRS en cellijnen) vergeleken tegen gezonde Intratumor T-cellen uit primaire casuses. Als T-cellen worden gebruikt als de somatische controle tegen B-cel afgeleid HRS en cellijn populaties, kunnen terugkerende winsten worden gezien in T-cel receptoren alfa / delta en beta. Op dezelfde manier zijn terugkerende verliezen detecteerbaar in immunoglobuline zware en kappa ketens. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Blood ⁷ . Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

DNA-invoermassa (n)	1-10 ng	25 ng	100 ng
Adapter: voeg de molverhouding (r) in	65: 1	25: 1	15: 1

Tabel 1: DNA InZet massa en de overeenkomstige adapter: voeg de molar ratio in. De waarden in deze tabel kunnen worden gebruikt als een handleiding voor het berekenen van de hoeveelheid adapter oligo die moet worden toegevoegd tijdens de adapterligatie stap van de bibliotheekconstructie.

Discussion

Toekomstige toepassingen of aanwijzingen na het masteren van deze techniek

Dit werk laat exome sequencing toe van monsters die tenminste 10 ng DNA bevatten. In de klinische context sluit deze limiet de meeste fijne aspiratiemonsters weg van onvoldoende materiaal, maar bevat ook adequate kernbiopsies en excisie-biopsiemonsters. Dit zal de aanschaf van gegevens van een grotere reeks mogelijke monsters mogelijk maken.

Kritieke stappen binnen het protocol

Behoorlijke bevriezing en dissociatie technieken zijn cruciaal voor het succes van het experiment. Het gehele monster moet zo veel mogelijk gedissocieerd worden, inclusief fibrotische delen. Het gebruik van een 130 μm spuitmond voor celsoorten lijkt kritisch te zijn om de opbrengst van de grote HRS-cellen en DNA te maximaliseren. Terwijl streng gecontroleerde experimenten met meerdere mondstukgroottes niet werden uitgevoerd, wordt er aanzienlijk gestegenIn celopbrengsten werden waargenomen met behulp van de grotere mondstuk vergeleken met de 100 μm, en er werden vrijwel geen cellen gedetecteerd op de glijpost 85 μm spuitvorm (ongepubliceerde waarneming).

Wijzigingen en probleemoplossing

Bij het werken met minder dan 100 ng massa input DNA voor bibliotheekconstructie, moet erop worden gezorgd om alle onnodige verwerkings- en opruimingsstappen te verminderen, vooral voor PCR-amplificatie, aangezien elk verloren uniek molecuul resulteert in een vermindering van de complexiteit van de eindbibliotheek . Het protocol adviseert opzettelijk elutie-extracten in 50 μL omdat deze waarde compatibel is met zowel sonicatie als eindreparatie met gebruikmaking van de aanbevolen apparatuur. Op deze wijze is het niet nodig om het elutievolume te verminderen met behulp van een centrifugale verdamper of een kolom voor de sonicatietrap of om het sonicatievolume voor de eindreparatie stap te verminderen. Aanvullende wijzigingen in dit protocol zijn mogelijk; Bijvoorbeeld, nieuwe bibliotheekconstructies kunnen de efficiëntie van de adapterligatie verbeteren. Men zou kunnen oplossen / optimaliseren door middel van adapter-gemedieerde bibliotheekversterkingscurven met behulp van real-time versterking op bibliotheken gemaakt met verschillende kits uit dezelfde hoeveelheid en kwaliteit van input DNA.

Beperkingen van de techniek

Tenminste 10 ng gezuiverd HRS-DNA (ongeveer 1.000 gesorteerde cellen na verliezen in de sorteer- en extractiestap) lijkt de minimale hoeveelheid te zijn voor hoogwaardige resultaten. In proefexperimenten werd DNA uit een enkel monster van gezuiverde T-cellen voor het eerst gebruikt om bibliotheken te maken die een bereik van inputmassages bestrijken. 100 ng (de standaard aanbevole hoeveelheid) van het input-DNA werd vergeleken met bibliotheken die gegenereerd werden met gebruik van dit low-input protocol voor 10 ng en 1 ng input DNA. De bibliotheek gegenereerd uit 10 ng input DNA had geen significante verschillen van de 100 ng invoer bibliotheek in omvang en distributie vanDekking over het doel, of in PCR duplicatie fractie. De bibliotheek die gegenereerd werd door gebruik te maken van 1 ng input DNA resulteerde echter in een significant hogere PCR duplicaatfractie en een overeenkomstige afname (ongeveer 3 keer) in gemiddelde dekking over het doel. Bovendien vertoonde de 1 ng bibliotheek ook afwijking van uniformiteit in de dekking, waardoor foute positieve kopie nummer veranderingen ten opzichte van de 100 ng bibliotheek, in tegenstelling tot de 10 ng invoer bibliotheek, die in dezelfde beoordeling kopie-neutraal waren. Wees daarom voorzichtig met gebruik van minder dan 10 ng input DNA met deze methode.

Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / alternatieve methoden

Na het protocol zal de volledige exome-sequentiebepaling van HRS-cellen van primaire Hodgkin-lymfoommonsters mogelijk zijn. CHL-lymfeknoopmonsters die tenminste 2 x ¹⁰⁷ cellen bevatten, zijn geschikt voor deze procedure. Dit was niet eerder beschikbaar voor onderzoekErs, die vertrouwden op technieken zoals laser-opname microdissectie en volledige genoom versterking. Het wordt voorspeld dat genomische benaderingen bij primaire CHL-gevallen verder waardevol zijn voor het verder begrijpen van CHL pathogenese. Gegevens wijzen ook op significante genome-niveau heterogeniteit binnen deze ziekte-entiteit, met mogelijk ten minste twee gedefinieerde subsets die lucifisch volgend morfologische stratificatie tussen nodulaire sclerose en gemengde celulariteit CHL volgen. Tenslotte wordt aangenomen dat genoom-niveau data zal leiden tot de ontwikkeling van gerichte therapie voor moeilijk te behandelen herhalende / refractaire CHL-gevallen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri or Cell Culture Dish (sterile)
RPMI-1640 Media	Roswell Park Memorial Institute
Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated)
Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile
RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month)
scalpel with fresh blade
10 mL syringe (no needle)
Cryogenic vials
50 mL conical centrifuge tubes, force
Centrifuge			capable of handling 50 mL conical centrifuge tubes and providing 400g
Hepes buffer(1 M, cell culture grade)
phosphate buffered saline (PBS)
Pluoronic-F68	Thermo-Fisher	24040-032
DNAase-I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D4527-10KU	store as 5 mg/mL in RPMI in -200 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)
Sort Media (PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + Pluoronic –F68 (1x))
CD64-FITC (22)	Beckman Coulter, Miami, FL		20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD30-PE (BerH83)	BD Biosciences, San Jose, CA		20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD5-ECD (BL1a)	Beckman Coulter, Miami, FL		10 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10)	Ebiosciences, San Diego, CA		5 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD20-PC7 (B9E9)	Beckman Coulter, Miami, FL		10 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD15-APC (HI98)	BD Biosciences, San Jose, CA		20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD45 APC-H7 (2D1)	BD Biosciences, San Jose, CA		Can be substituted with 10 μL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested
CD95-Pacific Blue (DX2)	Life Technologies, Grand Island, NY		5 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD2 (5 μg; clone RPA-2.10)	Biolegend, San Diego, CA		For optional protocol; Titering is suggested
CD54 (10 μg; clone 84H10)	Serotec, Oxford, United Kingdom		For optional protocol; Titering is suggested
CD58 (10 μg; clone TS2/9)	eBioscience, San Diego, CA		For optional protocol; Titering is suggested
LFA-1 (12 μg; clone MHM23)	Novus Biologicals, Littleton, CO		For optional protocol; Titering is suggested
BD CS&T Beads	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Accudrop Beads	BD Biosciences, San Jose, CA
BC Versa Comp antibody capture beads	Beckman Coulter, Miami, FL		Compensation Beads
BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers	BD Biosciences, San Jose, CA		any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient
Wizard	Promega	A2360
10 mM Tris-Cl buffer	NA
Qubit dsDNA HS Assay kit	Life Technologies, Carlsbad, CA
S2 Sonicator	Covaris, Woburn, MA		Alternatives may be substituted
microTUBE	Covaris, Woburn, MA
Low-Throughput Library Preparation Kit	Kapa Biosystems, Wilmington, MA	KK8221
Sybr Green	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9430
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter, Miami, FL
Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SeqCap EZ Exome v.3.0	Roche Nimblegen	6465684001
HiSeq	Illumina
TruSeq-style Universal adapter	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T
TruSeq-style index adapter	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq-style PCR primer 1	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		AATGATACGGCGACCACCGAGA
TruSeq-style PCR primer 2	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
Nuclease Free Duplex Buffer	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa
BD FACSDIVA software	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Falcon Tubes	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Flow Tubes	BD Biosciences, San Jose, CA