本文介绍了一种结合流式细胞分选与低起始量下一代测序文库构建的实验方案，旨在从经典型霍奇金淋巴瘤（CHL）的霍奇金-里德-斯特恩伯格（HRS）细胞中获得高质量的全外显子组数据。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
经典霍奇金淋巴瘤中的霍奇金-里德-斯特恩伯格细胞（Hodgkin Reed-Sternberg cells）稀疏分布于炎性淋巴细胞背景中，通常仅占肿瘤质量的不到1%。来源于整体肿瘤的材料中肿瘤含量浓度不足，难以进行有效表征。因此，本文介绍了一种利用八种抗体以及侧向散射和前向散射进行荧光激活细胞分选的方法，可快速分离并高纯度富集数千个HRS细胞用于后续研究。同时，由于外显子组测序的标准流程通常需要100–1,000 ng的输入DNA，这一要求即使经过流式分选仍常过高，我们还提供了一种优化的低输入量文库构建方案，仅需低至10 ng的输入DNA即可生成高质量数据。该组合方法可生成适用于全外显子捕获探针或更聚焦的靶向面板的下一代测序文库。将HRS细胞与肿瘤内健康的T细胞或B细胞进行比较，开展外显子组测序可识别体细胞变异，包括突变、插入与缺失以及拷贝数变异。这些发现有助于阐明HRS细胞的分子生物学机制，并可能揭示靶向药物治疗的新途径。
引言
由于下一代测序技术的发展，癌症基因组学取得了显著进展，从而在多种血液系统及非血液系统肿瘤的治疗靶点识别和预后判断方面实现了重大突破。基于特定基因组改变的新型个体化治疗策略正在多种肿瘤类型中迅速涌现（参见文献综述1,2）。尽管淋巴瘤基因组学已取得显著进展，经典型霍奇金淋巴瘤（CHL）中肿瘤性HRS细胞的基因组仍研究较少。由于肿瘤性HRS细胞存在于反应性微环境中且数量稀少，难以分离出纯化的HRS细胞群体，这限制了相关研究的开展3。
从原发性肿瘤中分离活体HRS细胞的方法由Fromm 等4,5,6建立。该方法采用包含CD30、CD15、CD40、CD95、CD45、CD20、CD5和CD64的八种抗体混合物，明确鉴定经典霍奇金淋巴瘤（CHL）肿瘤悬液中的HRS细胞。利用该技术，我们能够从新鲜或冷冻的肿瘤活检细胞悬液中分离出至少1,000个活体HRS细胞，这些悬液至少含有107个细胞（约10 mg组织）。流式细胞术分析显示纯度超过90%，在连续10例病例的外显子组基因组分析中估计纯度至少为80%。....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 组织处理与冷冻
- 在磷酸盐缓冲液（PBS）或罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基（RPMI）中收集淋巴结组织，并在采集后24小时内进行处理。将切除的淋巴结组织9转移至含有10 mL RPMI（含2%胎牛血清，FCS）的培养皿中，用新的手术刀片将其充分切碎。使用10 mL注射器活塞的尾部进一步研磨/解离组织。
- 通过100 µm细胞滤网将液体转移至50 mL锥形离心管中。用额外的10 mL RPMI（含2% FCS）冲洗培养皿和滤网。
- 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。
注意：通常，从约5 mm3的CHL淋巴结组织中可获得至少2 × 107个细胞。预期细胞活力超过80%，但可能因样本而异。 - 在400 × g条件下离心10分钟，吸除上清液。将含有细胞沉淀的离心管置于冰上。
- 将冻存液预先在冰上冷却。用预冷的冻存液重悬细胞，浓度为2 × 107/mL，并通过移液操作混匀。切勿涡旋震荡。将细胞悬液在冰上孵育10分钟。
- 将样品分装至预冷的冻存管中，每管1 mL。将冻存管转移至-80 °C超低温冰箱中放置1-2天，随后转移至液氮中长期保存。
2. 准备用于细胞分选的细胞悬液
....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
文库扩增及0.8x磁珠纯化后应进行生物分析仪检测。应观察到片段大小在目标范围内呈现“近似正态”的分布（图2a）。若曲线偏离该形态，例如出现明显的“肩峰”，则提示存在高或低分子量的副产物。例如，图2b-2d 展示了含有明显副产物的文库示例，此类文库理想情况下不应进行测序。若文库质量严重受损，且仍有DNA材料可用，或可重新进行文库构建和/或细胞分选以重新开始实验。
有时接头二聚体可能在第一次0.8x磁珠纯化过程中残留。若发生此情况，会在125 - 130 bp附近出现一个尖锐的峰（见图2c）。此时，建议再进行一次额外的0.8x磁珠纯化，并重复生物分析仪检测，以确保成功去除二聚体。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
掌握该技术后的未来应用或发展方向
本方法可用于含有至少 10 ng DNA 的样本进行外显子组测序。在临床背景下，由于材料不足，该限量排除了大多数细针穿刺样本，但包括足够的穿刺活检和切除活检样本。这将能够从更多可能的样本中获取数据。
方案中的关键步骤
适当的冷冻和解离技术对实验成功至关重要。应尽可能完全解离整个样本，包括纤维化区域。使用130 µm喷嘴进行细胞分选似乎对最大化获得大体积HRS细胞及DNA产量至关重要。尽管尚未开展使用多种喷嘴尺寸的严格对照实验，但与100 µm喷嘴相比，使用更大尺寸喷嘴时细胞得率显著提高；而使用85 µm喷嘴分选后，载玻片上几乎未检测到细胞（未发表观察结果）。
修改与故障排除
当用于文库构建的输入DNA质量少于100 ng时，应尽.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目方法的开发由威尔康奈尔医学院病理学与实验室医学系资助。我们感谢三校联合计算生物学与医学培训项目提供的部分资金支持。我们衷心感谢与我们分享宝贵时间与专业知识的科学家们，特别是Maryke Appel、Dan Burgess、Iwanka Kozarewa、Chad Locklear，以及来自威尔康奈尔医学院基因组核心设施的所有成员，包括Jenny Zhang、Xiaobo (Shawn) Liang、Dong Xu、Wei Zhang、Huimin Shang、Tatiana Batson和Tuo Zhang。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养皿或细胞培养皿（无菌） | |||
| RPMI-1640 培养基 | 罗斯威尔公园纪念研究所 | ||
| 胎牛血清（FCS，热灭活） | |||
| 冻存液（RPMI，20% FCS，10% 二甲基亚砜（DMSO））——现配并保持无菌 | |||
| 含 2% FCS 的 RPMI（现配或可储存至 1 个月） | |||
| 带新刀片的手术刀 | |||
| 10 mL 注射器（无针头） | |||
| 冻存管 | |||
| 50 mL 圆锥形离心管，耐压 | |||
| 离心机 | 可容纳 50 mL 圆锥形离心管，并提供 400g 离心力 | ||
| HEPES 缓冲液（1 M，细胞培养级） | |||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | |||
| Pluronic-F68 | Thermo-Fisher | 24040-032 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D4527-10KU | 建议以 5 mg/mL 溶于 RPMI 中，于 -200 °C 保存 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | |||
| 分选缓冲液（PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + Pluronic –F68（1x）） | |||
| CD64-FITC（22） | Beckman Coulter, Miami, FL | 建议起始体积为 20 μL；建议进行滴定 | |
| CD30-PE（BerH83） | BD Biosciences, San Jose, CA | 建议起始体积为 20 μL；建议进行滴定 | |
| CD5-ECD（BL1a） | Beckman Coulter, Miami, FL | 建议起始体积为 10 μL；建议进行滴定 | |
| CD40-PerCP-eFluor 710（1C10） | Ebiosciences, San Diego, CA | 建议起始体积为 5 μL；建议进行滴定 | |
| CD20-PC7（B9E9） | Beckman Coulter, Miami, FL | 建议起始体积为 10 μL；建议进行滴定 | |
| CD15-APC（HI98） | BD Biosciences, San Jose, CA | 建议起始体积为 20 μL；建议进行滴定 | |
| CD45 APC-H7（2D1） | BD Biosciences, San Jose, CA | 可替换为 CD45-Krome Orange（J.33, Beckman Coulter），建议体积为 10 μL；建议进行滴定 | |
| CD95-Pacific Blue（DX2） | Life Technologies, Grand Island, NY | 建议起始体积为 5 μL；建议进行滴定 | |
| CD2（5 μg；克隆号 RPA-2.10） | Biolegend, San Diego, CA | 用于可选方案；建议进行滴定 | |
| CD54（10 μg；克隆号 84H10） | Serotec, Oxford, United Kingdom | 用于可选方案；建议进行滴定 | |
| CD58（10 μg；克隆号 TS2/9） | eBioscience, San Diego, CA | 用于可选方案；建议进行滴定 | |
| LFA-1（12 μg；克隆号 MHM23） | Novus Biologicals, Littleton, CO | 用于可选方案；建议进行滴定 | |
| BD CS&T 微球 | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Accudrop 微球 | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BC Versa Comp 抗体捕获微球 | Beckman Coulter, Miami, FL | 补偿微球 | |
| 配备 5 个激光器的 BD-FACS ARIA 特殊研究订单仪器 | BD Biosciences, San Jose, CA | 任何具备检测抗体组合中荧光染料能力的 BD-FACS Aria 仪器均可满足要求 | |
| Wizard | Promega | A2360 | |
| 10 mM Tris-Cl 缓冲液 | NA | ||
| Qubit dsDNA HS 检测试剂盒 | Life Technologies, Carlsbad, CA | ||
| S2 超声破碎仪 | Covaris, Woburn, MA | 可使用替代产品 | |
| microTUBE | Covaris, Woburn, MA | ||
| 低通量文库制备试剂盒 | Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK8221 | |
| Sybr Green | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9430 | |
| Agencourt AMPure XP 微球 | Beckman Coulter, Miami, FL | ||
| 生物分析仪 | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SeqCap EZ 外显子 v.3.0 | Roche Nimblegen | 6465684001 | |
| HiSeq | Illumina | ||
| TruSeq 风格通用接头 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC 纯化；AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T | |
| TruSeq 风格索引接头 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC 纯化；/5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG | |
| TruSeq 风格 PCR 引物 1 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | AATGATACGGCGACCACCGAGA | |
| TruSeq 风格 PCR 引物 2 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | CAAGCAGAAGACGGCATACGAG | |
| 无核酸酶双链缓冲液 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | ||
| BD FACSDIVA 软件 | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Falcon 管 | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD 流式管 | BD Biosciences, San Jose, CA |
参考文献
- Abrams, J. National Cancer Institute's Precision Medicine Initiatives for the new National Clinical Trials Network. American Society of Clinical Oncology educational book / ASCO. American Society of Clinical Oncology. Meeting. , 71-76 (2014).
- Gagan, J., Van Allen, E. M.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
