Summary
在这里，我们描述了一种组合流式细胞分选和低投入的下一代图书馆建设协议，旨在从古典霍奇金淋巴瘤（CHL）的霍奇金Reed-Sternberg（HRS）细胞产生高质量的全外显子数据。
Abstract
经典霍奇金淋巴瘤的霍奇金Reed-Sternberg细胞在炎性淋巴细胞的背景下稀疏分布，通常包含少于肿瘤块的1％。衍生自大块肿瘤的材料含有不足以表征的浓度的肿瘤含量。因此，使用八种抗体以及侧向和前向散射的荧光激活细胞分选在此被描述为一种快速分离和浓缩来自肿瘤的高纯度数千个HRS细胞的方法，用于随后的研究。同时，由于外源序列测序的标准协议通常需要100-1,000 ng的输入DNA，即使使用流分类方法也常常过高，因此我们还提供了优化的低输入库构建协议，能够生产高品质数据少于10 ng的输入DNA。这种组合能够生产适合于全e杂交捕获的下一代文库根据需要，xome诱饵或更专注于目标的面板。当与健康肿瘤T细胞或B细胞比较时，HRS细胞的外显子序列可以鉴定体细胞变异，包括突变，插入和缺失以及拷贝数变化。这些发现阐明HRS细胞的分子生物学，并可能揭示靶向药物治疗的途径。
Introduction
由于下一代测序，癌症基因组学的进展导致了治疗靶点的鉴定和许多血液学和非血液学肿瘤的预后的重大突破。基于特定基因组改变的新的个体化治疗策略正在迅速引入许多肿瘤类型（参考文献1,2 ）。尽管在淋巴瘤基因组学方面取得了显着的进展，经典霍奇金淋巴瘤（CHL）中肿瘤HRS细胞的基因组未被发现。研究受到反应性微环境中肿瘤性HRS细胞稀缺的阻碍，使得难以分离纯化的HRS细胞群体3 。
从原始肿瘤分离可行的HRS细胞的方法由Fromm 等人开发 如图4所示 ，该方法使用由CD30，CD15，CD40，CD95，CD45 CD20，CD5和CD64组成的八抗体混合物，从CHL肿瘤悬浮液中明确鉴定HRS细胞，使用这种方法，我们能够从由至少10 7个细胞（约10毫克组织）组成的肿瘤活组织检查的新鲜或冷冻细胞悬浮液中分离出至少1,000个可行的HRS细胞，通过流式细胞术分析纯度大于90％，估计为至少80％通过exome基因组分析连续十例。
我们已经完善了流式细胞分离技术，大大缓解了该过程，从而能够从原发性CHL肿瘤中快速分离成千上万个可行的HRS细胞。我们已经利用这种技术来产生被认为是霍奇金淋巴瘤初级病例中肿瘤细胞的第一个全部外显子序列。我们的研究证明了这一点高通量，全基因组研究个体CHL病例的可行性，已经导致鉴定新的基因组改变，具有解释CHL发病机理的潜力。
我们进一步开发了一条管道，以利用提取的DNA进行高通量基因组研究。为了从少至1,000个分选的HRS细胞（从顺序病例获得的最小值）获得可靠的结果，我们进一步开发了修改的下一代DNA文库构建程序8 ，其使得我们能够增加衔接子连接效率并产生DNA片段文库没有过多的放大。这种方法允许对常规临床样品的分析和复发性突变和染色体变异的检测7 。
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Protocol
组织加工和冷冻
- 收集磷酸盐缓冲盐水（PBS）或罗斯维尔公园纪念研究所培养基（RPMI）中的淋巴结组织，并收集24小时内的过程。将切除的淋巴结组织9转移到含有10mL具有2％胎牛血清（FCS）的RPMI的培养皿中，并用新鲜的手术刀刀片精细切碎。使用10 mL注射器柱塞的背面进一步研磨/解离组织。
- 将液体转移到一个50毫升锥形管通过一个100微米的细胞过滤器。用额外的10 mL RPMI 2％FCS冲洗培养皿和过滤器。
- 使用自动细胞计数器或血细胞计数器获取细胞计数。
注意：一般来说，预计约5毫米3的CHL淋巴结组织至少有2×10 7个细胞。预计有超过80％的可行性，但可能会因样品而异。 - 将细胞以400 x g的速度旋转10分钟，并将其吸收上清液。将含有细胞沉淀的管放在冰上。
- 在冰上预冷冻冷冻培养基。将细胞以2×10 7 / mL的浓度重悬于冷冻培养基中，并通过移液重悬。不要旋涡将悬浮液在冰上孵育10分钟。
- 将样品1 mL /冷冻小瓶（冰上预冷）等分。将小瓶转移到-80°C冷冻箱中1-2天，然后再次将其转移到液氮中。
2.准备细胞分选细胞悬液
注意：每批抗体必须使用1000微升染色体积中的1000万个细胞进行适当滴定。外周血可用于除了CD30之外的所有抗体，其中加入外周血的KMH2细胞系可用于滴定10 。我们通常从制造商推荐的抗体体积开始，并进行两次两倍稀释和两倍增加（四个数据点）对于每次大量的抗体滴定。例如，如果制造商建议使用10μL体积，我们会使用2,5,10和20μL的体积进行滴定。
- 将水浴设置为37°C。在黑色玻璃小瓶中预混合滴定量的抗体，并加入PBS + 2％BSA，总体积为100μL。
注意：虽然我们建议滴定抗体，但以下体积可能用作起始点：CD64，20μL; CD95，5μL; CD30,20μL; CD5，10μL; CD20,10μL; CD15,20μL; CD40，5μL;和CD45，10μL。 - 将小瓶从液氮转移到含有干冰的冰桶中，以防止融化。在37℃水浴中，在50mL锥形管中预热50ml含RPMI / 20％FCS / DNase（100μg/ mL）的解冻培养基。
- 将45 mL解冻培养基转移到新鲜管中，并保持在37°C。通过在37°C水蝙蝠中保存一个低温小瓶快速解冻细胞h，直到只剩下很小的冻结部分。
- 将小瓶内容物倒入含有45 mL解冻介质的管中。用1 mL解冻培养基冲洗空的低温瓶2次，并混合冲洗液。
- 在室温下孵育细胞15分钟以允许DNA酶消化和细胞重新平衡。将细胞以500xg的速度旋转10分钟并吸出上清液。
- 将细胞重悬在大约200μL的解冻介质中（5mL）中，使其平衡至室温2-3分钟。预计恢复> 70％的冷冻活细胞。
注意：任选地，为了更高纯度的可能被附着的T细胞引起的分选的HRS细胞，可以在该步骤添加未标记抗体的混合物（参见任选的方案）。 - 加入100μL抗体混合液，室温（RT）孵育15 min，避光保存。加入3 mL分选培养基，以500 xg的速度旋转细胞10分钟，并吸出上清液。
- 将细胞重悬于1 mL分选培养基中，并将其转移至5 mL流管顶部过滤器。
- 用另外1 mL分选培养基冲洗50mL锥形管和细胞过滤器，并将细胞置于冰上。
3.（可选协议）T Cell Rosette Blocking
注意：HRS细胞在组织切片和细胞悬浮液中被T细胞吞噬，并且这些T细胞可能潜在地污染分选的HRS级分。这些相互作用由CD54和CD58在T细胞4,11上结合LFA-1和CD2的HRS细胞介导。这些相互作用可以用对这些粘附分子的未标记的抗体来阻断。
- 在100μLRPMI中将100,000至500,000个细胞等分。
- 用冰标记的CD2，CD54，CD58和LFA-1（各10μL）的细胞悬浮液孵育1小时。 Ť他现在可以用荧光抗体标记细胞悬浮液。
4.使用细胞分选的HRS-，B-和T细胞分离
注意：虽然我们使用了一个使用5个激光器的特殊研究订单仪器（参见材料电子表格），但任何能够检测抗体面板中使用的荧光染料的分选机应该是足够的。执行以下步骤需要熟悉软件12功能和细胞分选器操作的基本知识。有关详细说明，请参阅在线软件手册。
- 细胞仪设置：
- 打开电脑并登录。打开BSC（和BSC出口）电源，然后打开细胞计数器。等待至少90秒钟，以便启动细胞计数器的内部CPU，然后打开激光控制软件，并验证所有激光器是否通电。启动细胞仪软件13并登录。
- 在细胞仪软件中，点击“Cytometer→查看配置”。当配置子程序的对话框打开时，突出显示130-μm自定义配置，然后单击“设置配置”和“确定”。退出配置子程序。
- 观察细胞仪软件中的对话框，然后单击“使用CS＆T设置”。在仪器中安装一个130-μm的喷嘴，点击流窗口中的红色“X”按钮打开流。让仪器预热至少30分钟。
- 使用所需的方法对仪器进行性能检查（本文所述分拣机附带的性能跟踪软件模块，请参见软件手册（第117-122页）和参考标准（参考标准中使用的材料这个设置）。
- 单击“Cytometer→CST”，确保“Characterize”字段设置为“Chec”k性能“，然后单击”运行“。当软件提示时，将一个参考粒子管加载到样品台上，然后单击”确定“。
- 运行完成后，单击“完成”并关闭软件模块。细胞计数器软件重新连接到细胞仪后，点击出现的对话框中的“使用CS＆T设置”。
- 使用细胞仪软件的自动丢失延迟功能确定正确的丢失延迟（请参见软件手册的第154 - 161页）。
- 在细胞仪软件的“浏览器”窗口中打开“延迟延迟”实验，在样品台上安装一组校准颗粒，然后在“采集仪表板”窗口中单击“加载”。点击“流”窗口中的“甜点”按钮打开自动流监视功能。随时关闭此功能g步。
- 通过点击侧流窗口中的“电压”按钮打开偏转板电压，然后点击紧邻“电压”按钮旁边的“测试排序”按钮打开测试排序。
- 将所有侧面流设置调整为零，除了左侧流。调整左侧流设置，使得在侧面流窗口中可以看到两个流点。单击“光学滤波器”按钮，确认左侧流点将落在侧边窗口黑色区域中的左侧框中。
- 如果需要，调整左侧流设置。再次点击“测试排序”按钮关闭测试排序。在“浏览器”窗口中，点击“+”，展开“拖延延迟”实验的“全局工作表”元素。
- 双击“排序布局_001”打开排序布局，通过目视检查进行验证离开左排序群体具有“P1”，并在“排序布局”窗口中单击“排序”。在“排序布局”窗口中，单击“自动延迟”，然后单击“运行”。
- 运行完成后，单击“退出”。在样品台上安装无菌去离子水管，并在“采集仪表板”窗口中单击“加载”。运行水管至少5分钟，以清除仪器中残留的测试颗粒，然后继续。
- 使用分拣机软件中的内置补偿设置运行补偿控制（使用材料电子表格或等效物的补偿珠）（有关其他详细信息，请参见软件手册的第131 - 137页）。
- 点击“实验新实验”创建一个新的实验。在“仪器状态”窗口的“参数”选项卡中，删除未使用的参数（如果有）。点击“实验补偿”离子设置创建补偿控制“。
- 在“浏览器”窗口中，点击“+”标志展开“补偿控制”标本。运行补偿控制管，而不记录数据，如有必要，调整检测器电压（在“仪器状态”窗口的“参数”选项卡中），以便每个荧光染料的正染色珠粒数在10,000至100,000之间，最主要的检测渠道是最亮的。
- 记下每个管的每个参数所需的电压。在“补偿控制”样本下单击左侧单击，突出显示“无污染控制”管。将未染色的控制管装载到样品台上，并在“采集控制”窗口中单击“加载”。
- 通过将各个补偿控制运行到所有参数的检测器电压范围内，手动输入确定的电压然后点击“采集控制”窗口中的“记录”。运行所有剩余的补偿控制，记录数据而不更改任何检测器设置。安装一根无菌的去离子水5分钟，以清除仪器中的任何残余物质，然后再继续操作。
- HRS细胞门控：
- 获取和记录至少100,000个事件用于初始门控，同时调整流量以获得3,000-4,000个事件/秒（参见步骤4.1）。
注意：如果细胞浓度过高，可能需要添加额外的分选培养基来稀释细胞。停止收购。 - 使用图1中概述的步骤门HRS细胞
注意：在大多数CHL病例中，0.01％至0.1％的细胞将是HRS细胞。
- 获取和记录至少100,000个事件用于初始门控，同时调整流量以获得3,000-4,000个事件/秒（参见步骤4.1）。
- B-和T细胞门控：
- 通过CD20和CD5的门控识别体细胞控制（B和T细胞）（通过CD45 / SSH门控淋巴细胞），然后是CD20与CD5（参见图1 ）。
- 目标收集流到预冷双向或四向收集架中的收集管。至少一半的采集介质，填充流管或15-mL离心机式管。
- 在按照供应商说明进行的排序设置中，将HRS和控制种群分配到适当的收集管。重新启动细胞采集并开始排序。
- 收集所有HRS细胞和高达100万B和T细胞。将收集流定向到预冷的四通（或双向）收集架中的收集管。
DNA提取
- 通过在1.5mL锥形管中以3,000xg离心10分钟来收集细胞，并用1mL PBS重悬一次以洗涤细胞。
- 再次以3000xg离心10分钟，除去上清液;要小心不要打扰小颗粒。
- 加入150μL裂解缓冲液（或使用的试剂盒的适当体积）到洗涤的细胞中，并通过上下移液混合。
注意：如果需要，可以在-70°C下储存细胞裂解物。 - 通过将过滤柱放置在管内并将溶液从步骤5.5添加到柱中来构建柱组件。以13,000 xg旋转组件3分钟。
- 从组件中取出小柱，并丢弃收集管中的液体。更换收集管中的小柱。
- 向每个装配中加入650μL柱洗涤溶液。以13,000 x g离心1分钟。从收集管中丢弃液体。重复此步骤总共4次洗涤。
- 从收集管中丢弃液体并重新组装小柱组件。以13,000 xg离心2分钟以干燥结合基质。
- 将小柱转移到新的1.5 mL管中，加入25μL10 mM Tris-Cl优选用于随后的超声处理步骤，或加热至65℃的无核酸酶水。在室温下孵育2分钟，并以13,000 xg离心组装1分钟。再次重复25μL，总共50μL。
- 通过上下移液混合DNA洗脱液，并使用荧光测定法14进行定量。
图书馆建设
- 开始前准备：
- 在水位12，强度5，循环/爆破200和温度7下设置超声波发生器。
- 基于通过荧光测定法和实验设计确定的可用DNA量，确定用于文库构建的DNA的量。
注意：请记住，如果DNA的使用太少，并且库的质量受到损害，则为了验证目的留下的材料可能没有什么应用。对于不合标准输入量，输入质量越大，化合物越高所得测序文库的词汇。该协议的一些准则如下：10ng应该产生良好的结果，50ng可能被认为是最大的。 - 确定适配器：将摩尔比基于表1中的数值松散计算。
- 以下列方式计算要使用的适配器数量：
注意：DNA输入的摩尔数， n
一世。 n = 1.54e-12 -12 *输入质量（ng）/（平均碎片大小）
II。 当平均片段大小为200bp时，这简化为：
n = 7.7e-15 *输入质量（ng）
要包括的适配器的摩尔数， a
一世。 a = n * r
适配器库存量在适配器连接步骤中使用， v
一世。 v（以 μL计） = a / [ 10 -12 * 适配器库存浓度（μM ）]
注意：如果适配器浓度较低，为确保必需量的适配器，适配器溶液可用于稀释终端修复试剂以代替水。
实施例：对于100ng平均片段大小为200bp的输入DNA，对于所需的摩尔转化子：插入比为15:1，衔接原料浓度为2μM，适配器的推荐体积为5.8μL。 - 将索引的条形码分配给样品。
注意：将汇集到杂交反应或定序器流动池中的通道的库不能包含任何冗余索引。
- 图书馆建设 - DNA剪切：
- 将全部使用的DNA添加到超声处理管中。如果含有单独输入DNA的样品的体积小于50μL，则将缓冲液EB加入总体积为50μL并混合。
- 超声处理30秒。
- 取出管子并在微型离心机中进行快速旋转，足以从微管壁的上部收集任何喷雾。
- 重复步骤6.2.2-6.2.3，总共有三十个超声处理，共超过二十秒超声处理。
注意：随意尝试将210秒分成较少的会话。
- 图书馆建设 - 终端修复，A拖尾和适配器结扎：
注意：避免在库PCR扩增步骤之前进行任何大小选择。- 在样品DNA超声处理后，按照制造商的说明书19进行末端修复和A-tailing。
- A拖尾后，在反应中使用适当数量的适配器（在步骤6.1.3中计算）。将适配器，A尾DNA片段，酶和缓冲液合并，并在20℃下孵育过夜约16小时。
- 库图书馆扩建：
- 对接头连接反应进行珠清洗。向PCR产物中加入珠子后，在室温下等待5分钟。将其放置在磁性支架上并取出液体，在200μL80％乙醇中洗涤两次，将珠子干燥足够长的时间以除去大部分液体，而不会过度干燥，并通过吸取25μL的如所建议的那样，将无核酸酶的水保持在磁珠上，同时保持在磁性支架上。
注意：可能试验保存聚乙二醇中的珠粒
（PEG），直到扩增，而不是丢弃它们，但是这还没有被测试。 - 每50μLPCR主混合物包含0.6μL的1：1,000稀释绿色染料。或者，使用适用于设备的体积中选择的实时PCR兼容的交联染料。
- 在98℃进行PCR反应45s用于初始变性，随后是98℃变性，退火和延伸循环15秒，60℃30秒和72℃30秒的循环，或者如果使用替代物选择适当的程序聚合酶。
- 将机器设置为在每个周期72摄氏度的荧光数据。在72℃下进行1分钟的最终延伸，然后在4℃保持一段无限期的时间。用于在补充表中使用试剂扩增衔接子连接的文库的PCR引物是：Oligo 1，AATGATACGGCGACCACCGAGA和Oligo 2，CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
- 使用上述PCR条件扩增文库，同时使用qPCR软件实时观察荧光强度值，在指数生长期结束之前停止。
- 扩增后，使用0.8倍体积的扩增反应进行标准珠清洗（参见步骤6.4.1）通常为0.8×50 =40μL珠。将小珠加入PCR产物，并在室温下等待5分钟。
- 将其放置在磁性支架上并取出液体，在200μL80％乙醇中洗涤两次，将珠子干燥足够长的时间以除去大部分液体，而不会过度干燥，并通过向干珠中加入无核酸酶的水洗脱。
- 使用荧光测定法定量得到的DNA。可视化库片段大小;有关更多详细信息，请参阅Data QC期望部分。
- 对接头连接反应进行珠清洗。向PCR产物中加入珠子后，在室温下等待5分钟。将其放置在磁性支架上并取出液体，在200μL80％乙醇中洗涤两次，将珠子干燥足够长的时间以除去大部分液体，而不会过度干燥，并通过吸取25μL的如所建议的那样，将无核酸酶的水保持在磁珠上，同时保持在磁性支架上。
外来杂交
- 组合四个库与不同的适配器条形码。
注意：通过荧光测定和通过凝胶的大小的质量用于计算摩尔浓度，然后将文库以等摩尔量组合，总共为1,000-ng质量的合并文库。最好将所有肿瘤 - 正常对保持在一起，而不是将它们分离成单独的池。 - 应用exome捕获协议
8.多路测序
- 在“材料”电子表格16中引用的测序平台上，在单个泳道中进行单个杂交捕获，包含四个多重文库。
注意：对于希望进一步规划和优化其目标读取覆盖深度的高级用户，可以进行其他配置。
9.分析（如果需要，可以用替代管道替代）
- Sn ps：：
- 将原始数据映射到人类参考基因组UCSC hg19，使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA） 17或其他选择的算法。过滤或标记读数，映射质量得分低于20，PCR重复使用Samtools 18或Picard参考“> 19。
- 使用Strelka 20或选择的变体呼叫者，与T细胞体细胞对照相比，检测HRS样本中的体细胞核苷酸变体和小indels。应用snpEff 21来注释Strelka输出。如果需要，使用集成基因组查看器（IGV） 22,23系统地检查变体位点的伪像。
- 复制号码变更：
- 按照以下方式计算肿瘤内图书馆内归一化阅读计数的每个外显子目标间隔“ i ”与正常值的对数转换比率“ ltr ”
注意： c是映射到给定捕获间隔的读数， l是总库大小， t表示肿瘤， n表示正常。 - 过滤间隔不足（ C t + C n <100读）进行进一步分析。使用来自Bioconductor的DNAcopy v.1.0 24进行泛区间分割
注意：考虑平均值ltr的绝对值低于0.5的片段为复制中性。如果平均值ltr的符号为正（换句话说，在标准化后肿瘤样本中的读数大于正常样本中的读数），或者拷贝数丢失，则符号可能被指定为拷贝数增益的平均值ltr为负数。
- 按照以下方式计算肿瘤内图书馆内归一化阅读计数的每个外显子目标间隔“ i ”与正常值的对数转换比率“ ltr ”
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Representative Results
在文库扩增和0.8倍珠粒清理后应采用生物分析仪。人们应该看到片段大小的“正常”分布在所需的范围内（ 图2a ）。与该形状的偏差，例如曲线中可见的“肩”表示存在高分子量或低分子量的假象。例如， 图2b -2d显示了包含可理想的未被排序的可见伪像的库的示例。如果图书馆受到严重影响，如果DNA可用和/或细胞分选开始新鲜可能值得重复图书馆建设。
适配器二聚体有时可以通过第一个0.8x的珠粒清洁。如果发生这种情况，它将以125-130 bp为中心的尖峰可见（见图e 2c）。在这种情况下，建议重复额外的0.8倍珠清洁，并重复生物分析仪以确保二聚体的成功去除。
使用本协议中描述的规范，并在“材料”电子表格中列出的测序仪中将每个泳道四个样品的顺序进行多路复用，靶标上的中位深度为50-100倍（在PCR重复读数的生物信息学去除之后）是可以实现的（ 见图3a ）。另外，图书馆没有被过度扩大，导致图书馆有足够的覆盖面，应该会制作干净的副本号码图。在早期工作中，这个图书馆建设协议在三个数量级的输入质量下进行了测试，并发现了不同的结果（参见讨论部分）。使用从1 ng生成的库生成数量图，这是一个次最佳量的输入DNA，造成虚假的拷贝数增益和损失（ 图3b ，底部）。
大约70％的CHL病例携带B2M和A20突变和/或缺失7 。 B2M突变主要涉及翻译起始位点，第一个外显子停止位点和第一个外显子停止位点。 A20突变是拷贝数丢失和indel的混合。突变似乎是克隆的，可用于估计相对肿瘤含量。如果使用T细胞作为体细胞对照，HRS测序将显示对应于T细胞受体α/δ（14q11-12）和β位置（7q32-35）的位置的显着拷贝数增加，以及B细胞受体重链（14q32）和κ轻链位置（2p11）（参见图4 ）。总体测序显示每个病例100到400个体细胞突变的范围。复制数字变化是高度v从案件到案件，有些案件显示出许多分段收益和损失，其他案件只显示了一些改变。
图1：可行HRS，B和T细胞的流分选的多参数选择。人口名称显示在地块上，并显示任何门的父母种群。 （ A ）显示所有细胞：在FSC-H与FSC-A直方图上，绘制包含比例FSC-H和FSC-A增加的群体的SINGLETS门。排除具有较高FSC-A和较低FSC-H的双峰。霍奇金细胞非常大;扩大门，包括高FSC-H和FSC-A事件。 （ B ）排除碎片，死细胞和未分解的RBC，通常FSC-A较低，SSC-H略有增加，而不切除可行的群体（VIABLE gate）。 （ C ）门MONONUCLEAR电池FSC-A对SSC-H以高SSC-H排除粒细胞;注意，门仅用于识别T和B细胞。 （ D ）没有CD20和B细胞（蓝色）的CD5（绿色）阳性鉴定的门T细胞，其没有CD5具有CD20表达。 （ E ）在CD45 / SSH图上绘制一个LARGER门，包括10-20％的淋巴样细胞和所有粒细胞。 （ F ）具有暗到CD64 / FITC自身荧光的门CD30阳性事件。 （ G ）在CD30阳性事件中，门CD40-和CD95阳性事件（CD30 / 40/95 HRS门，红色）。 （ HL ）观察HRS细胞的确证免疫表型特征; HRS细胞通常不表达CD20（图H和L）。由于T细胞玫瑰花结（CD），CD5的表达与CD45相关;大多数情况下会显示CD15的表达，并且对于CD71（ J ）将是明亮的。 CD40和CD95表达通常高于B细胞和T细胞的水平，有效（ K ）。这项研究最初发表在Blood 7 。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：适配器连接和扩增后样品的尺寸分布图。理想情况下，可以重复并且不排序具有可见伪像的库。 （ a ）良好的图书馆;没有可见的文物。 （ b ）曲线不对称显示出一个问题。 （c）显着的衔接子二聚体（128个峰）和高分子量伪影（> 400bp）。二聚体可以用额外的0.8倍珠清洁来清洁。 （ d ）显着的高分子量假象。s / ftp_upload / 54399 / 54399fig2large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
图3：从1ng输入DNA制备的低质量图书馆，由10ng输入DNA制成的高质量图书馆的生物信息质量控制测量。覆盖期望的独特读取深度的幅度和分布。 （ a ）使用10-100ng输入DNA时，预计中位数至少为50。 （ b ）2个面板中的每一个描绘了比较2个测序库之间的数据的拷贝数变异分析结果。对于单个代表性染色体（chr 6）绘制了对数2刻度（y轴）上的超声探针片段（x轴）与拷贝数变化。比较来自肿瘤内的10ng低输入文库的数据来自同一病例的肿瘤内T细胞DNA的100ng正常输入文库的T细胞DNA显示没有显着的假阳性结果;也就是说，低输入和正常输入的库是复制中立的（顶部）。将来自肿瘤内T细胞DNA的1ng低输入文库的数据与来自同一病例（底部）的肿瘤内T细胞DNA的100ng正常输入文库进行比较时，将许多假阳性节段拷贝数改变。这项研究最初发表在Blood 7 。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：与原发性Cas的健康肿瘤内T细胞相比，肿瘤细胞（原发性HRS和细胞系）的复发数增益与损失ES。如果使用T细胞作为针对B细胞衍生的HRS和细胞系群体的体细胞控制，可以在T细胞受体α/δ和β中看到反复增益。同样，免疫球蛋白重链和κ链可以检测到复发性损失。这项研究最初发表在Blood 7 。 请点击此处查看此图的较大版本。
| DNA输入质量（n） | 1-10ng | 25 ng | 100 ng |
| 适配器：插入摩尔比（r） | 65：1 | 25：1 | 15：1 |
表1：DNA In放Mass和相应适配器：插入摩尔比。该表中的值可用作计算在库构建的适配器连接步骤期间添加的适配器oligo的量的指南。
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Discussion
掌握此技术后的未来应用或方向
该工作允许从含有至少10ng DNA的样品进行外显子测序。在临床情况下，由于材料不足，此限制不包括大多数细针抽吸样品，但包括足够的核心活检和切除活检样本。这将使得能够从更大的可能样本集中获取数据。
协议中的关键步骤
适当的冷冻和解离技术对于实验的成功至关重要。整个样品应尽可能分离，包括纤维化部分。使用130微米的喷嘴进行细胞分选似乎对于最大化HRS细胞和DNA的产量至关重要。虽然没有进行具有多个喷嘴尺寸的严格的对照实验，但显着增加使用较大的喷嘴观察到的细胞产量相对于100-μm，并且在85μm喷嘴排列（未发表的观察）上，实际上没有检测到细胞。
修改和故障排除
当使用少于100ng质量的输入DNA进行图书馆建设时，应注意减少所有不必要的处理和清除步骤，特别是在PCR扩增之前，因为每个丢失的独特分子导致最终文库的复杂性降低。该方案故意推荐洗脱提取物50μL，因为该值与使用推荐设备的超声和末端修复兼容。以这种方式，不需要使用用于超声处理步骤的离心蒸发器或柱来降低洗脱体积，或者减少用于末端修复步骤的超声处理体积。此协议的其他修改是可能的;例如，新的图书馆建设套件可以提高适配器的连接效率。可以通过比较适配器介导的文库扩增曲线来进行故障排除/优化，使用实时扩增在不同试剂盒中使用相同数量和质量的输入DNA制备的文库。
技术的局限性
至少10ng纯化的HRS DNA（在分选和提取步骤中损失后约1,000个分选细胞）似乎是高质量结果的最小量。在试验实验中，首先使用来自纯化T细胞的单个样品的DNA来制备跨越一定范围的输入质量的文库。将输入DNA的100ng（标准推荐量）与使用该低输入方案产生的10ng和1ng输入DNA产生的文库进行比较。从10ng输入DNA产生的文库与100ng输入文库在幅度和分布上没有显着差异覆盖目标，或PCR重复部分。然而，使用1ng输入DNA产生的文库导致显着更高的PCR重复级分，并且在靶标上的平均覆盖率相应降低（约3倍）。此外，1ng文库也表现出与覆盖均匀性的偏差，相对于100ng文库，产生了假阳性拷贝数变更，与10ng输入文库不同，该文库在同一评估中为拷贝中性。因此，使用这种方法使用少于10ng的输入DNA警告。
技术对现有/替代方法的重要意义
根据该方案将允许来自原发性霍奇金淋巴瘤样品的HRS细胞的全部外显子测序。含有至少2×10 7个细胞的CHL淋巴结样品适用于该程序。以前没有可用的研究他们依靠激光捕获显微切割和全基因组扩增等技术。据预测，对于进一步了解CHL发病机制，原发性CHL病例的基因组方法将继续有价值。数据还指出了这一疾病实体中重要的基因组水平的异质性，潜在的至少两个定义的子集松散地遵循结节性硬化症和混合细胞性CHL之间的形态分层。最后，相信基因组水平的数据将导致难治性复发/难治性CHL病例的靶向治疗的发展。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
该项目方法的开发由威尔康奈尔医学院病理与实验室医学系资助。我们承认计算生物学和医学三部门培训计划的部分资助。我们要感谢与我们分享他们时间和知识的科学家，特别是玛丽亚·安德尔;丹·伯吉斯伊万卡·科扎雷瓦乍得Locklear以及来自威尔康奈尔医学院基因组学核心设施的所有人，包括张珍珍，肖波（肖恩）梁，董旭，魏章，惠民尚，塔蒂亚娜·贝森和托章。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri or Cell Culture Dish (sterile) | |||
| RPMI-1640 Media | Roswell Park Memorial Institute | ||
| Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated) | |||
| Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile | |||
| RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month) | |||
| scalpel with fresh blade | |||
| 10 mL syringe (no needle) | |||
| Cryogenic vials | |||
| 50 mL conical centrifuge tubes, force | |||
| Centrifuge | capable of handling 50 mL conical centrifuge tubes and providing 400g | ||
| Hepes buffer(1 M, cell culture grade) | |||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Pluoronic-F68 | Thermo-Fisher | 24040-032 | |
| DNAase-I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D4527-10KU | store as 5 mg/mL in RPMI in -200 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | |||
| Sort Media (PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + Pluoronic –F68 (1x)) | |||
| CD64-FITC (22) | Beckman Coulter, Miami, FL | 20 μL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD30-PE (BerH83) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 μL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD5-ECD (BL1a) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 μL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) | Ebiosciences, San Diego, CA | 5 μL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD20-PC7 (B9E9) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 μL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD15-APC (HI98) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 μL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD45 APC-H7 (2D1) | BD Biosciences, San Jose, CA | Can be substituted with 10 μL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested | |
| CD95-Pacific Blue (DX2) | Life Technologies, Grand Island, NY | 5 μL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) | Biolegend, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD54 (10 μg; clone 84H10) | Serotec, Oxford, United Kingdom | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD58 (10 μg; clone TS2/9) | eBioscience, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| LFA-1 (12 μg; clone MHM23) | Novus Biologicals, Littleton, CO | For optional protocol; Titering is suggested | |
| BD CS&T Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Accudrop Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BC Versa Comp antibody capture beads | Beckman Coulter, Miami, FL | Compensation Beads | |
| BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers | BD Biosciences, San Jose, CA | any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient | |
| Wizard | Promega | A2360 | |
| 10 mM Tris-Cl buffer | NA | ||
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | ||
| S2 Sonicator | Covaris, Woburn, MA | Alternatives may be substituted | |
| microTUBE | Covaris, Woburn, MA | ||
| Low-Throughput Library Preparation Kit | Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK8221 | |
| Sybr Green | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9430 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter, Miami, FL | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SeqCap EZ Exome v.3.0 | Roche Nimblegen | 6465684001 | |
| HiSeq | Illumina | ||
| TruSeq-style Universal adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T | |
| TruSeq-style index adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG | |
| TruSeq-style PCR primer 1 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | AATGATACGGCGACCACCGAGA | |
| TruSeq-style PCR primer 2 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | CAAGCAGAAGACGGCATACGAG | |
| Nuclease Free Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | ||
| BD FACSDIVA software | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Falcon Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Flow Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA |
References
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