Flödessortering och Exome-sekvensering av Reed-Sternberg-cellerna av klassisk Hodgkin-lymfom

Summary

Här beskriver vi ett kombinerat flödescytometriskt cellsorteringssystem och ett lågpresenterat, nästa generations bibliotekskonstruktionsprotokoll som är utformat för att producera högkvalitativa, hel-exome data från Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) -cellerna av klassiskt Hodgkin-lymfom (CHL).

Abstract

Hodgkin Reed-Sternberg-cellerna av klassiskt Hodgkin-lymfom fördelas sparsamt inom en bakgrund av inflammatoriska lymfocyter och innefattar typiskt mindre än 1% av tumörmassan. Material som härrör från bulktumör innehåller tumörinnehåll vid en koncentration som inte är tillräcklig för karakterisering. Därför beskrivs fluorescensaktiverad cellsortering med användning av åtta antikroppar, såväl som sido- och framåtskridande, som ett förfarande för att snabbt separera och koncentrera sig med hög renhet tusentals HRS-celler från tumören för efterföljande studie. Samtidigt, eftersom standardprotokoll för exome-sekvensering vanligtvis kräver 100-1 000 ng ingångsd DNA, vilket ofta är för högt, även med flödessortering, tillhandahåller vi också ett optimerat bibliotek med låg ingångsbibliotek som kan producera högkvalitativ Data från så lite som 10 ng ingångsd DNA. Denna kombination kan producera nästa generations bibliotek som är lämpliga för hybridiseringsinspelning av hel-eXome beten eller mer fokuserade riktade paneler, efter önskemål. Exome-sekvensering av HRS-cellerna, jämfört med friska intratumor T- eller B-celler, kan identifiera somatiska förändringar, inklusive mutationer, insertioner och deletioner och kopieringstaländringar. Dessa resultat belyser molekylärbiologin hos HRS-celler och kan avslöja vägar för riktade läkemedelsbehandlingar.

Introduction

Framsteg i cancergenom som ett resultat av nästa generations sekvensering har lett till betydande genombrott vid identifieringen av terapeutiska mål och i prognostikering för många hematologiska och icke-hematologiska neoplasmer. Nya individuella behandlingsstrategier baserade på specifika genomförändringar introduceras snabbt i många tumortyper (ses i referenser ^{1 , 2} ). Trots betydande framsteg i lymfom genomik hade genomet hos neoplastiska HRS-celler i klassiskt Hodgkin-lymfom (CHL) undersökts. Undersökningarna har hindrats av brist på neoplastiska HRS-celler inom en reaktiv mikromiljö, vilket gör det svårt att isolera renade HRS-cellpopulationer ³ .

Metoden för isolering av livskraftiga HRS-celler från primära tumörer utvecklades av Fromm et al. ^{4 ,}Ref "> 5 ^{, 6.} Metoden använder en åtta antikroppscocktail, bestående av CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 och CD64 för att entydigt identifiera HRS-celler från en CHL-tumorsuspension. Kan isolera minst 1000 livskraftiga HRS-celler från friska eller frysta cellsuspensioner från tumörbiopsier som består av minst 10 ⁷ celler (cirka 10 mg vävnad). Renheten är större än 90% genom flödescytometrisk analys och uppskattas vara Minst 80% genom genom-genom-analys av tio på varandra följande fall.

Vi har förfinat en flödescytometrisk cellisoleringsteknik som kraftigt underlättat processen, vilket möjliggör snabb isolering av tusentals livskraftiga HRS-celler från primära CHL-tumörer ⁷ . Vi har använt tekniken för att producera vad som anses vara den första hel-exom-sekvensen av tumörcellerna i primära fall av Hodgkin-lymfom. Våra studier visar attE genomförbarhet av hög genomströmning genom genomgående studier av enskilda CHL-fall och har redan lett till identifiering av nya genomiska förändringar med potential att förklara aspekter av CHL-patogenes.

Vi vidareutvecklade en pipeline för att utnyttja det extraherade DNA-materialet för genom genomgångna genomströmningsstudier. För att uppnå tillförlitliga resultat från så få som 1000 sorterade HRS-celler (det minsta som erhölls från sekventiella fall) utvecklade vi vidare en modifierad nästa generations DNA-biblioteksbyggnadsprocedur ⁸ som gjorde det möjligt för oss att öka adapterligeringseffektiviteten och att generera DNA-fragmentbibliotek Utan överdriven amplifiering. Denna metod möjliggör analys av rutinmässiga kliniska prover och detektering av återkommande mutationer och kromosomala förändringar ⁷ .

Protocol

1. Vävnadsbehandling och frysning

1. Samla lymfkörtelvävnad i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) och bearbeta inom 24 h samling. Överför utklippt lymfkörtelvävnad ⁹ till en petriskål innehållande 10 ml RPMI med 2% fetalt kalvserum (FCS) och finhackat det med ett nytt skalpellblad. Använd baksidan av en 10 ml sprutskolv för att ytterligare slipa / dissociera vävnaden.
2. Överför vätskan till ett 50 ml koniskt rör genom en 100 μm cellfilm. Skölj petriskålen och filtret med ytterligare 10 ml RPMI 2% FCS.
3. Hämta en cellräkning med antingen en automatiserad cellräknare eller en hemocytometer.
   OBS: Generellt skulle minst 2 x 107 celler förväntas från ungefär 5 mm ³ av CHL-lymfkörtelvävnad. En lönsamhet på över 80% förväntas, men det kan variera med prov.
4. Snurra ner cellerna vid 400 xg i 10 minuter och aspiraTe supernatanten. Placera röret som innehåller cellpelleten på is.
5. Förkyl frysmedium på is. Resuspendera cellerna i kallt frysmedium vid en koncentration av 2 x 107 / ml och resuspendera den genom pipettering. Vortex inte. Inkubera suspensionen på is under 10 minuter.
6. Aliquot provet 1 mL / cryo-flaska (förkyld på is). Överför injektionsflaskorna till en -80 ° C frys i 1-2 dagar och överför dem igen till flytande kväve.

2. Framställning av celluppslamningar för cellsortering

ANMÄRKNING: Varje parti antikropp måste riktigt titreras med 10 miljoner celler i en 300-μl färgningsvolym. Perifert blod kan användas för alla antikroppar utom CD30, för vilken KMH2-cellinjen spikad i perifert blod kan användas för titrering ¹⁰ . Vi börjar vanligtvis med den tillverkarrekommenderade volymen antikropp och utför två dubbla utspädningar och en tvåfaldig ökning (fyra datapunkter)För varje massa antikropptitrering. Om tillverkaren exempelvis rekommenderar en 10-volymvolym utför vi titrering med 2, 5, 10 och 20 μl volymer.

1. Sätt ett vattenbad till 37 ° C. Förblanda den titerade mängden antikroppar i en mörk glasflaska och tillsätt PBS + 2% BSA för en total cocktailvolym av 100 pl.
   OBS! Även om vi rekommenderar att titrering av antikropparna kan följande volymer användas som utgångspunkt: CD64, 20 pl; CD95, 5 | il; CD30, 20 pl; CD5, 10 | il; CD20, 10 | il; CD15, 20 pl; CD40, 5 | il; Och CD45, 10 pl.
2. Överför injektionsflaskan från flytande kväve till en ishink som innehåller torris för att förhindra upptining. Förvärm 50 ml upptining medium innehållande RPMI / 20% FCS / DNas (100 | ig / ml) i ett 50 ml koniskt rör i ett 37 ° C vattenbad.
3. Överför 45 ml upptining medium till ett friskt rör och håll det vid 37 ° C. Tina cellerna snabbt genom att hålla en kryogen flaska i en 37 ° C vattenflaskaH tills endast en mycket liten frusen del kvarstår.
4. Häll in flaskans innehåll i röret innehållande 45 ml upptining medium. Skölj den tomma kryogena ampullen två gånger med 1 ml tinasmedium och kombinera sköljningarna.
5. Inkubera cellerna vid rumstemperatur i 15 minuter för att tillåta DNase-digestion och cellutjämning. Snurra ner cellerna vid 500 xg i 10 min och aspirera supernatanten.
6. Resuspendera cellerna i ca 200 μl av upptinningsmediet hållet tillbaka (5 ml) och låt det jämviktas till rumstemperatur i 2-3 minuter. Återvinning av> 70% frysta levande celler förväntas.
   ANMÄRKNING: För en större renhet av sorterade HRS-celler som kan rosettas av bifogade T-celler kan en cocktail av omärkta antikroppar tillsättas vid detta steg (se det frivilliga protokollet).
7. Tillsätt 100 μl av en antikroppscocktail och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur (RT), skyddad mot ljus. Tillsätt 3 ml sorteringsmedium, snurra ner cellerna vid 500 xgI 10 min och aspirera supernatanten.
8. Resuspendera cellerna i 1 ml sorteringsmedium och överför dem till en 5 ml flödesrörets övre sil.
9. Skölj både det 50 ml koniska röret och cellens sil med ytterligare 1 ml sorteringsmedium och placera celler på is.

3. (Valfritt protokoll) T Cell Rosette Blockering

OBS! HRS-celler rosetteras av T-celler i vävnadssektioner och cellsuspension, och dessa T-celler kan potentiellt förorena den sorterade HRS-fraktionen. Dessa interaktioner medieras av CD54 och CD58 på HRS-cellen som är bindande till LFA-1 och CD2 på T-cellerna ^{4 , 11} . Dessa interaktioner kan blockeras med omärkta antikroppar mot dessa adhesionsmolekyler.

1. Aliquot 100 000 till 500 000 celler i 100 | il RPMI.
2. Inkubera cellsuspensionen med omärkta antikroppar mot CD2, CD54, CD58 och LFA-1 (10 | il vardera) på is under 1 timme. THan cell suspension kan nu märkas med fluorescerande antikroppar.

4. HRS-, B- och T-cellisolering med hjälp av cellsortering

OBS! Även om vi använde ett speciellt forskningsordningsinstrument med 5 lasrar (se materialets kalkylblad), bör alla sorter med förmåga att detektera fluorokromerna som används i antikroppspanelen vara tillräckliga. Genomförandet av stegen nedan kräver en förtrogenhet med programvaran ¹² funktion och en grundläggande kunskap om cell sorteringsoperationer. Vänligen se manualen för online-mjukvaran för detaljerade instruktioner.

1. Cytometer inställning:
   1. Slå på datorn och logga in. Sätt på BSC (och BSC uttag) och sätt sedan på cytometern. Vänta minst 90 s för att cytometerns interna CPU ska starta och öppna sedan laserkontrollprogrammet och kontrollera att alla lasrar är påslagen. Starta cytometerprogrammet ¹³ och logga in.
   2. Inom cytometerprogrammet klickar du på "Cytometer → View Configurations." När dialogrutan för konfigurationsunderprogrammet öppnas markerar du 130-μm anpassad konfiguration och klickar på "Ange konfiguration" och "OK". Avsluta konfigurationsunderprogrammet.
   3. Observera dialogrutan i cytometerprogramvaran och klicka på "använd CS & T-inställningar." Installera ett 130 μm munstycke i instrumentet och sätt på strömmen genom att klicka på den röda "X" -knappen i strömfönstret. Låt instrumentet värmas upp i minst 30 minuter.
   4. Kör en prestandakontroll på instrumentet med den önskade metoden (en mjukvarumodul med prestanda-spårning ingår i sorteringen som beskrivs här, se programvaruhandboken (s. 117-122) och referensstandard (se Materialen för den standard som används i Denna inställning).
      1. Klicka på "Cytometer → CST," se till att fältet "Karakterisera" är inställt på "ChecK Prestanda "på rullgardinsmenyn och klicka på" Kör ". När du uppmanas av programvara, ladda ett rör av referenspartiklar till provsteget och klicka på" OK ".
      2. När körningen är klar klickar du på "Slutför" och stänger programmodulen. När cytometerprogrammet har slutförts igen med cytometern, klicka på "använd CS & T-inställningar" i dialogrutan som visas.
   5. Bestäm rätt droppfördröjning med hjälp av den automatiska droppfördröjningsfunktionen hos cytometerprogramvaran (se sid. 154 - 161 i programvaruhandboken).
      1. Öppna experimentet "Drop Delay" i "Browser" -fönstret i cytometerprogramvaran, installera ett rör med kalibreringspartiklar i provsteget och klicka på "Ladda" i fönstret "Acquisition Dashboard". Slå på den automatiska strömövervakningsfunktionen genom att klicka på "Sweet Spot" -knappen i "Stream" -fönstret. Lämna den här funktionen hela tiden för alla efterföljandeG steg.
      2. Slå på spänningsplattans spänning genom att klicka på "Spänning" -knappen i sidströmsfönstret och slå sedan på testsortering genom att klicka på "Test Sort" -knappen direkt intill "Spänning" -knappen.
      3. Justera alla sidströmsinställningar till noll med undantag för vänstra sideströmmen. Justera inställningen för vänster sideström så att två strömfläckar är synliga i sidströmmen. Klicka på knappen "Optisk filter" och verifiera att den vänstra sidströmsfältet faller i den vänstra rutan som visas i det svarta området i sidströmmen.
      4. Justera inställningen för vänster sidoström vid behov. Stäng av test sortering genom att klicka på knappen "Test Sortera" igen. I "Browser" -fönstret, expandera "Global Worksheets" -elementet i experimentet "Drop Delay" genom att klicka på "+".
      5. Dubbelklicka på "Sorter Layout_001" för att öppna sorteringslayouten, verifiera genom visuell inspektionJon att den vänstra sortpopulationen har "P1" tilldelad den och klicka på "Sortera" i fönstret "Sortera layout". I fönstret "Sortera layout" klickar du på "Automatisk fördröjning" och sedan "Kör".
      6. När körningen är klar klickar du på "Avsluta". Installera ett rör sterilt avjoniserat vatten på provsteget och klicka på "Ladda" i fönstret "Acquisition Dashboard". Kör röret med vatten i minst 5 minuter för att rensa resterande testpartiklar från instrumentet innan du fortsätter.
   6. Kör kompensationskontroller (med hjälp av kompensationspärlor från materialets kalkylblad eller motsvarande) med hjälp av en inbyggd kompensationsinställning i sorteringsprogramvaran (se sid. 131 - 137 i programvaruhandboken för ytterligare detaljer).
      1. Skapa ett nytt experiment genom att klicka på "Experiment New Experiment." På fliken "Parametrar" i fönstret "Instrumentstatus", radera oanvända parametrar, om några. Klicka på "Experiment CompensatIon Setup Skapa kompensationskontroller. "
      2. I fönstret "Browser", expandera "Kompensationskontroll" -provet genom att klicka på "+" -tecknet. Kör kompenseringskontrollrör utan att registrera data, och vid behov justera detektorspänningarna (i fliken "Parametrar" i fönstret "Instrumentstatus") så att positivt färgade vulstpopulationer för varje fluorokrom ligger mellan kanal 10 000 och 100 000 och är Den ljusaste i sin primära detekteringskanal.
      3. Skriv ner de spänningar som behövs för varje parameter för varje rör. Markera "Unstained Control" -röret under "Kompensationskontroll" -provet genom att enkelt klicka på det med vänster. Ladda det obestämda kontrollröret på provsteget och klicka på "Ladda" i fönstret "Förvärvskontroll".
      4. Ange manuellt de bestämda spänningarna genom att köra individuella kompenseringskontroller i detektorspänningsfälten för alla parametrar, ochKlicka sedan på "Spela in" i fönstret "Förvärvskontroll". Kör alla återstående kompenseringskontroller, registrera data utan att ändra inställningar för detektor. Installera ett rör sterilt avjoniserat vatten i 5 minuter för att rensa eventuellt kvarvarande material från instrumentet innan du fortsätter.
2. HRS-cellgating:
   1. Förvärva och spela in minst 100 000 händelser för inledande gating medan flödeshastigheten anpassas för att förvärva 3000-4000 händelser / s (se steg 4.1).
      OBS! Det kan vara nödvändigt att lägga till ytterligare sorteringsmedium för att späda ut cellerna om cellkoncentrationen är för hög. Sluta förvärvet.
   2. Gate HRS-celler med hjälp av stegen som skisseras i Figur 1
      OBS! I de flesta CHL-fall kommer mellan 0,01% och 0,1% av cellerna att vara HRS-celler.
3. B- och T-cellgating:
   1. Identifiera somatiska kontroller (B och T-celler) genom gating av CD20 och CD5 respCtively (gating lymfocyter av CD45 / SSH), följt av CD20 kontra CD5 (se Figur 1 ).
   2. Målsamling strömmar till insamlingsrör i ett förkylt tvåvägs eller fyrvägsuppsamlingsställ. Fyll antingen flödesrör eller 15 ml centrifugeringsrör åtminstone halvvägs med uppsamlingsmedium.
   3. Tilldela HRS och kontrollera populationer till lämpliga uppsamlingsrör i sorteringsinställningen enligt leverantörsinstruktioner. Starta om celluppköp och starta sorteringen.
   4. Samla alla HRS-celler och upp till 1 miljon B- och T-celler. Mäta uppsamlingsströmmarna till insamlingsrör i ett förkylt fyrvägs (eller tvåvägs) insamlingsställ.

5. DNA-extraktion

1. Pelleten uppsamlade celler genom centrifugering i 1,5 ml koniska rör vid 3000 xg under 10 minuter och resuspenderas en gång med 1 ml PBS för att tvätta cellerna.
2. Pelleten en gång till vid 3000 xg under 10 minuter och avlägsna supernatanten; Var försiktig så att du inte störDen lilla pelleten.
3. Tillsätt 150 μl lysisbuffert (eller en lämplig volym för det använda paketet) till de tvättade cellerna och blanda genom pipettering upp och ner.
   OBS: Man kan lagra celllysat vid -70 ° C vid denna tidpunkt, om det behövs.
4. Konstruera en kolonnmontering genom att placera filterkolonnen inuti röret och tillsätt lysatet från steg 5.5 till kolonnen. Vrid aggregatet vid 13 000 xg under 3 min.
5. Ta bort minikolonnen från aggregatet och kassera vätskan i uppsamlingsröret. Byt minikolonnen i uppsamlingsröret.
6. Tillsätt 650 μL kolonntvättlösning till varje montering. Centrifugera i 1 min vid 13 000 x g. Kassera vätskan från uppsamlingsröret. Upprepa detta steg för totalt 4 tvättar.
7. Kassera vätskan från uppsamlingsröret och sätt ihop minikolonnaggregatet. Centrifugera i 2 min vid 13 000 xg för att torka bindningsmatrisen.
8. Överför minikolonnen till ett nytt 1,5 ml rör och sätt 25 μL 10 mM Tris-Cl, vilketÄr föredragen för efterföljande sonikeringstest, eller Nukleasfritt vatten upphettat till 65 ° C. Inkubera i 2 min vid rumstemperatur och centrifugera aggregatet vid 13 000 xg under 1 min. Upprepa en gång med 25 μl för totalt 50 μl.
9. Blanda DNA-elueringen genom pipettering upp och ner och kvantifiera med användning av fluorimetri ¹⁴ .

6. Bibliotekskonstruktion

1. Förberedelse före början:
   1. Ställ in sonikatorn vid vattennivå 12, Intensitet 5, Cykler / Spräng 200 och Temp 7.
   2. Baserat på den tillgängliga DNA-kvantiteten bestämd av fluorimetri och den experimentella konstruktionen bestämmer mängden DNA som ska användas för bibliotekskonstruktion.
      OBSERVERA: Tänk på att om för lite DNA används och bibliotekskvaliteten är äventyrad, kan det finnas liten ansökan om material som finns kvar för validering. För substandard ingångsmängder, desto större ingångsmassa desto högre kompLexitet av det resulterande sekvenseringsbiblioteket. Några riktlinjer för detta protokoll är följande: 10 ng ska ge bra resultat och 50 ng kan anses vara ett grovt maximum.
   3. Bestäm på adaptern: sätt in molförhållandet löst baserat på värdena i tabell 1 .
   4. Beräkna mängden adapter som ska användas på följande sätt:
      OBS: Antal mol DNA-ingång, n
      jag. N = 1,54e-12 ^-12 * ingångsmassa (i ng) / (medelstorleksstorlek)
      ii. När den genomsnittliga fragmentstorleken är 200 bp, förenklar detta till:
      N = 7,7e-15 * ingångsmassa (i ng)
      Antal molar adapter för att inkludera, a
      jag. A = n * r
      Volym av adapterns lager för användning i adapterligationssteget, v
      jag. V (i μL ) = a / [ 10 ^-12 * adapterlagerKoncentration (i μM )]
      OBS! Om adapterkoncentrationen är låg, för att säkerställa att den nödvändiga adaptern ingår, kan adapterlösningen användas för att späda slutreparationsreagens i stället för vatten.
      Exempel: För 100 ng ingångsd DNA med en medelfragmentstorlek på 200 bp, för en önskad molaradapter: sätt in förhållandet 15: 1 och en adapterns lagerkoncentration av 2 μM, är den rekommenderade volymen av adapter för användning 5,8 μL.
   5. Tilldela indexerade streckkoder till proverna.
      OBS: Bibliotek som ska sammanfogas i en hybridiseringsreaktion eller en bana på en sequencerens flödescell får inte innehålla några redundanta index.
2. Bibliotekskonstruktion - DNA-skjuvning:
   1. Lägg till hela mängden DNA som ska användas till ett sonikeringsrör. Om volymen av provet som innehåller det inmatade DNA ensamt är mindre än 50 μl, tillsätt buffert EB upp till en 50 μl total volym och blanda.
   2. Sonicate för 30 s.
   3. Ta bort röret och utför en snabbvridning i en mini-centrifug som är tillräckligt för att samla in någon spray från den övre delen av mikrotubens väggar.
   4. Upprepa steg 6.2.2-6.2.3 för totalt sju 30 s sonication sessioner för totalt 210 s av sonication.
      OBS ! Gärna experimentera med att dela 210 s till färre sessioner.
3. Bibliotekskonstruktion - Slutreparation, A-tailing och adapterligation:
   OBS: Undvik att göra något val av storlek innan bibliotekets PCR-amplifieringssteg.
   1. Följ tillverkarens anvisningar ¹⁹ för slutreparation och A-tailing efter sonikering av prov-DNA.
   2. Efter A-tailing, använd lämpligt antal mol adapter (beräknad i steg 6.1.3) i reaktionen. Kombinera adaptern, A-tailed DNA-fragment, enzym och buffert och inkubera över natten vid 20 ° C under ca 16 h.
4. libRary konstruktion - bibliotek förstärkning:
   1. Utför en pärlupprensning av adapterligationsreaktionen. Efter tillsats av pärlor till PCR-produkten vänta 5 minuter vid rumstemperatur. Placera den mot ett magnetiskt stativ och ta bort vätskorna, tvätta två gånger i 200 | il 80% etanol, torka pärlorna tillräckligt lång för att avlägsna det mesta av vätskan utan övertorkning och eluera DNA: n från pärlorna genom att pipettera 25 | il Nukleasfritt vatten, som föreslagits, på pärlorna medan röret förblir mot ett magnetiskt stativ.
      OBS! Det kan vara möjligt att experimentera med att bevara pärlorna i polyetylenglykol
      (PEG) tills förstärkningen istället för att kassera dem, men detta har inte testats.
   2. Inkludera 0,6 μl av en 1: 1 000 utspädning av grönt färgämne per 50 μl PCR-masterblandning. Alternativt kan du använda ett realtids-PCR-kompatibelt interkolerande färgämne i valfri volym för utrustningen.
   3. Programmera PCR-reaktionen vid 98 ° C för45 s för den ursprungliga denatureringen följt av en cykel av denaturering, glödgning och förlängning vid 98 ° C i 15 s, 60 ° C i 30 s och 72 ° C i 30 s, eller välj lämpligt program om man använder ett alternativ Polymerasenzym.
      1. Ställ in maskinen för att ta fluorescensdata vid 72 ° C för varje cykel. Programera en slutlig förlängning vid 72 ° C i 1 min följt av en hållning vid 4 ° C under obestämd tid. PCR-primrarna för amplifieringen av det adapter-ligerade biblioteket med användning av reagens i tilläggstabellen är: Oligo 1, AATGATACGGCGACCACCGAGA och Oligo 2, CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
   4. Förstärka biblioteket med de ovan beskrivna PCR-förhållandena, samtidigt som man observerar fluorescensintensitetsvärdena i realtid med qPCR-mjukvaran, stoppa strax före slutet av den exponentiella tillväxtfasen.
   5. Efter förstärkning gör du en standardpärlauppsättning (se steg 6.4.1) med användning av 0,8x volymen av amplifieringsreaktionsrekvovUtbredd, typiskt 0,8 x 50 = 40 | j, l pärlor. Lägg pärlorna till PCR-produkten och vänta 5 minuter vid rumstemperatur.
   6. Placera den mot ett magnetiskt stativ och ta bort vätskorna, tvätta två gånger i 200 | il 80% etanol, torka pärlorna tillräckligt lång för att avlägsna det mesta av vätskan utan att torka över och eluera genom att tillsätta nukleasfritt vatten till torra pärlorna.
   7. Kvantifiera det resulterande DNA med användning av fluorimetri. Visualisera bibliotekets fragment för storlek; Se avsnittet om Data QC-förväntningar för mer information .

7. Exome Hybridization

1. Kombinera fyra bibliotek med distinkta adapterns streckkoder.
   OBS: Massa genom fluorimetri och storlek med gel används för att beräkna molariteten, och sedan kombineras bibliotek i ekvimolära mängder för totalt 1 000 ng massa poolat bibliotek. Det är bäst att hålla alla tumörnära par tillsammans i stället för att separera dem i separata pooler.
2. Applicera exome capture capture protokoll Up class = "xref"> 15 och gör 8 PCR-cykler efter upptagningen. Andra val av fångstmål kan vara möjliga.

8. Multiplexerad sekvensering

1. Sekvensera en enda hybridiseringsfångst som innehåller fyra multiplexerade bibliotek i en enda lane på sekvenseringsplattformen som refereras i material-kalkylbladet ¹⁶ .
   OBS! Alternativa konfigurationer är möjliga för avancerade användare som vill planera och optimera deras mållängdsdjup.

9. Analys (kan ersättas med alternativ pipeline (s) om det är önskvärt)

1. Snps och små indeler:
   1. Kartera rådata till det mänskliga referensgenomet, UCSC hg19, med Burrows-Wheeler Aligner (BWA) ¹⁷ eller en alternativ algoritm. Filtrera eller markera läser med ett kartläggningskvalitetsresultat under 20 och PCR-duplikat med Samtools ¹⁸ eller PicardRef "> 19.
   2. Detektera somatiska nukleotidvarianter och små indeler i HRS-prover jämfört med T-cellets somatiska kontroller med användning av Strelka ²⁰ eller en variantvalare som valts. Applicera snpEff ²¹ för att kommentera Strelka-utgången. Om så önskas, inspektera du systematiskt variantlokal för artefakter med hjälp av Integrated Genome Viewer (IGV) ^{22 , 23} .
2. Kopiera nummerändringar:
   1. Beräkna det logförvandlade förhållandet " ltr " för varje exom-målintervall " i " av intra-bibliotek normaliserade läsantal i tumören mot de normala på följande sätt:
      
      OBS: c är antalet läser kartläggning till ett givet infångningsintervall, l är den totala biblioteksstorleken, t betecknar tumör och n betecknar normal.
   2. Filterintervall med otillräcklig täckning ( C _t + C _n <100 läser) för vidare analys. Utför pan-intervall segmentering med DNAcopy v.1.0 ²⁴ från Bioconductor i R.
      OBS: Tänk på segment där det absoluta värdet av den genomsnittliga ltr är under 0,5 för att vara kopieringsneutral. Återstående segment kan betecknas som kopieringsvinster, om tecknet på medelvärdet ltr är positivt (med andra ord finns det signifikant mer läs i tumörprovet än i det normala provet efter normalisering) eller kopieringstalsförluster, om tecknet Av den genomsnittliga ltr är negativ.

Representative Results

En bioanalysatorplot ska tas efter bibliotekets förstärkning och 0,8x pärluppsättning. Man bör se en "normalliknande" fördelning av fragmentstorlekar i det önskade området ( Figur 2a ). Avvikelser från denna form, såsom en synlig "axel" i kurvan, indikerar närvaron av en artefakt med hög eller låg molekylvikt. Exempelvis visar figur 2b -2d exempel på bibliotek som innehåller synliga artefakter som ideellt inte ska sekvenseras. Om ett bibliotek är väsentligt kompromissat kan det vara värt att upprepa bibliotekets konstruktion om DNA är tillgängligt och / eller cellsorteringen börjar frisk.

En adapterdimer kan ibland överföras genom den första 0,8x-pärlens rengöring. Om detta inträffar kommer det att synas som en skarp topp centrerad runt 125 - 130 bp (se FigurE 2c). I det här fallet är det tillrådligt att upprepa ytterligare 0,8x pärlrening och att upprepa bioanalysorn för att säkerställa att dimeren lyckas avlägsnas.

Genom att använda specifikationerna som beskrivs i detta protokoll och multiplexera sekvenseringen i nivå med fyra prover per fil i sekvensen som anges i materialets kalkylblad, läser ett mediandjup av täckning på 50-100x över målet (efter det att bioinformatikavlägsnandet av PCR-duplikat har läst) Kan uppnås (se figur 3a ). Dessutom skulle bibliotek som inte var överförstämda och som resulterade i bibliotek med adekvat täckning, skapa rena kopieringsnummer tomter. Under det tidiga arbetet testades det här bibliotekets byggprotokoll över tre storleksordningar av ingångsmassa, och olika resultat upptäcktes (se avsnittet Diskussion). Kopiera talintervall genererade med hjälp av ett bibliotek genererat från 1 ng, en suboptimal mängd ingångsd DNA, Resulterade i falska kopieringsnummervinster och förluster ( Figur 3b , botten).

Cirka 70% av CHL-fallen bär B2M- och A20-mutationer och / eller deletioner ⁷ . B2M-mutationer innefattar övervägande en translationsstart, en första exon-stoppplats och en första exon-stoppplats. A20-mutationer är en blandning av kopiantalförluster och indeler. Mutationerna verkar vara klonala och kan användas för att uppskatta relativt tumörinnehåll. Om T-celler används som somatiska kontroller, kommer HRS-sekvensering att visa signifikanta kopieringsvinster i positionerna motsvarande T-cellreceptor alfa / delta (14q11-12) och betapositioner (7q32-35), samt signifikanta förluster i B-cellreceptor tung kedja (14q32) och kappa lätta kedjepositioner (2p11) (se figur 4 ). Övergripande sekvensering visar ett intervall från 100 till 400 somatiska mutationer per fall. Kopiera talvariation är högt vAribel från fall till fall, med vissa fall som visar många segmentvinster och förluster och andra fall som visar endast några förändringar.

Figur 1: Multiparametergating för flödessortering av livskraftiga HRS-, B- och T-celler. Befolkningsnamn visas på tomter och anger föräldrarnas befolkning i någon grind. ( A ) visar alla celler: På FSC-H mot FSC-A histogram ritar du en SINGLETS-grind som innehåller populationer med proportionella FSC-H och FSC-A ökar. Exkludera dubbletter som har hög FSC-A och lägre FSC-H. Hodgkin-celler är mycket stora; Expandera grinden för att inkludera höga FSC-H och FSC-A händelser. ( B ) Utesluta skräp, döda celler och olyserade RBC som normalt har lägre FSC-A och små ökar i SSC-H utan att skära ut levande populationer (VIABLE gate). ( C ) Gate MONONUCLEAR celler påFSC-A vs SSC-H för att utesluta granulocyter med hög SSC-H; Notera att grinden endast används för identifiering av T- och B-celler. ( D ) Gate T CELLS identifieras positivt av CD5 (grön) utan CD20 och B CELLS (blå), som har CD20 uttryck utan CD5. ( E ) Rita en LARGER-grind på CD45 / SSH-diagrammet, inklusive 10-20% av lymfoidcellerna och alla granulocytceller. ( F ) Gate CD30-positiva händelser med dim till negativ CD64 / FITC autofluorscens. ( G ) Bland CD30-positiva händelser, gate CD40- och CD95-positiva händelser (CD30 / 40/95 HRS-grind, röd). ( HL ) Observera de bekräftande immunofenotypiska egenskaperna på HRS-celler; HRS-celler uttrycker generellt inte CD20 (tomter H och L). Expressionen av CD5 är korrelerad med CD45 på grund av T-cell-rosettering (I); De flesta fallen kommer att visa uttryck för CD15 och kommer att vara ljus för CD71 ( J ). CD40- och CD95-uttryck är generellt över nivån av B- och T-celler resp Ektivt ( K ). Denna forskning publicerades ursprungligen i Blood ⁷ . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Storleksfördelning av prover efter adapterligering och förstärkning. Bibliotek med synliga artefakter bör helst upprepas och inte sekvenseras. ( A ) välformat bibliotek Inga synliga artefakter. ( B ) Asymmetri i kurvan avslöjar ett problem. (C) Signifikant adapterdimer (topp vid 128) och en artefakt med hög molekylvikt (> 400 bp). Dimeren kan rengöras med ytterligare 0,8x pärlstädning. ( D ) Signifikant artefakt med hög molekylvikt.S / ftp_upload / 54399 / 54399fig2large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Bioinformatiska kvalitetskontrollmätningar för bibliotek av högre kvalitet tillverkad av 10 ng Input-DNA Jämfört med lågkvalitetsbibliotek framställda från 1 ng Input DNA. Storleken och fördelningen av det unika läsdjupet för täckningsförväntningar. (A) Ett mediandjup av täckning på minst 50 förväntas vid användning av 10-100 ng ingångsd DNA. ( B ) Var och en av 2 paneler visar analysresultat för kopieringsnummervariationer som jämför data mellan 2 sekvenserade bibliotek. Exoniska sondsegment (x-axel) mot kopiantalförändring på en log _2- skala (y-axel) ritas för en enda representativ kromosom (chr 6). Jämförelse av data från ett 10 ng låginputsbibliotek från intratumoralT-cell-DNA till ett 100 ng normalt ingångsbibliotek från intratumoralt T-cell-DNA från samma fall visade inga signifikanta falskt positiva resultat; Det vill säga låginmatade och normala ingångsbibliotek är kopieringsneutrala (överst). Många falskt positiva segmentalkopieringsnummerändringar kallades när data från ett 1 ng låginputsbibliotek från intratumoralt T-cell-DNA jämfördes med ett 100 ng normalt ingångsbibliotek från intratumalt T-cell-DNA från samma fall (botten). Denna forskning publicerades ursprungligen i Blood ⁷ . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Återkommande kopieringsnummervinster och -förluster, med tumörceller (primära HRS och cellinjer) jämfört med friska intratumor-T-celler från primära cases. Om T-celler används som den somatiska kontrollen mot B-cell-härledda HRS- och cellinjepopulationer, kan återkommande vinster ses i T-cellreceptorer alfa / delta och beta. På samma sätt är återkommande förluster detekterbara i tunga och kappakedjor med immunglobulin. Denna forskning publicerades ursprungligen i Blood ⁷ . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

DNA-ingångsmassa (n)	1-10 ng	25 ng	100 ng
Adapter: sätt in molförhållande (r)	65: 1	25: 1	15: 1

Tabell 1: DNA InSätt Mass och motsvarande adapter: Sätt in molförhållande. Värdena i denna tabell kan användas som en guide för att beräkna mängden adapter oligo att lägga till under adapterns ligationssteg för bibliotekskonstruktion.

Discussion

Framtida applikationer eller anvisningar efter att ha behärskat denna teknik

Detta arbete möjliggör exome-sekvensering från prover innehållande minst 10 ng DNA. I det kliniska sammanhanget utesluter denna gräns de flesta finna-aspirationsprover på grund av otillräckligt material, men det innefattar adekvata kärnbiopsier och excisionsbiopsiprover. Detta kommer att möjliggöra förvärv av data från en större uppsättning möjliga prover.

Kritiska steg inom protokollet

Korrekta frysnings- och dissociationstekniker är kritiska för experimentets framgång. Hela provet ska dissocieras, inklusive fibrotiska sektioner, så mycket som möjligt. Att använda ett 130 μm munstycke för cellsorter verkar vara kritiskt för att maximera utbytet av de stora HRS-cellerna och DNA. Medan noggranna kontrollerade experiment med flera munstycksstorlekar inte utfördes, ökar signifikantI cellutbyten observerades med användning av det större munstycket jämfört med 100 pm, och i stort sett inga celler detekterades på glidstolpen 85 μm munstyckssortering (obublicerad observation).

Ändringar och felsökning

När man arbetar med mindre än 100 ng massor av ingångsd DNA för bibliotekskonstruktion, bör man se till att minska alla onödiga processer och upparbetningssteg, särskilt före PCR-amplifiering, eftersom varje förlorad unik molekyl resulterar i en minskning av komplexiteten hos det slutliga biblioteket . Protokollet rekommenderar avsiktligt eluering av extrakt i 50 μL eftersom detta värde är kompatibelt med både sonikering och slutreparation med hjälp av den rekommenderade utrustningen. På detta sätt är det inte nödvändigt att reducera elueringsvolymen med användning av en centrifugalindunstare eller en kolonn för sonikeringsteget eller för att minska sonikeringsvolymen för slutreparationssteget. Ytterligare ändringar av detta protokoll är möjliga; Till exempel kan nya bibliotekskonstruktionssatser förbättra adapterligeringseffektiviteten. Man kan felsöka / optimera genom att jämföra adaptermedierade biblioteksförstärkarkurvor med realtidsförstärkning på bibliotek som tillverkas med olika kit från samma mängd och kvalitet av ingångsd DNA.

Begränsningar av tekniken

Minst 10 ng renat HRS-DNA (cirka 1000 sorterade celler efter förluster i sorterings- och extraktionsstegen) verkar vara den minsta mängden för högkvalitativa resultat. I pilotförsök användes DNA från ett enda prov av renade T-celler först för att göra bibliotek som spänner över en rad ingångsmassor. 100 ng (standard rekommenderad mängd) av ingångsd DNA jämfördes med bibliotek genererade med användning av detta låginputsprotokoll för 10 ng och 1 ng ingångsd DNA. Biblioteket som genererades från 10 ng ingångs-DNA hade inga signifikanta skillnader från 100 ng-ingångsbiblioteket i storlek och distribution avTäckning över målet, eller i PCR-dupliceringsfraktion. Biblioteket som genererades med användning av 1 ng ingångsd DNA resulterade emellertid i en signifikant högre PCR-duplikatfraktion och en motsvarande minskning (ungefär 3 gånger) i genomsnittlig täckning över målet. Dessutom uppvisade 1 ng-biblioteket också avvikelse från enhetlighet i täckning, vilket skapade falskt positiva kopieringsnummerändringar med avseende på 100 ng-biblioteket, till skillnad från 10 ng-ingångsbiblioteket, vilket var kopie-neutralt i samma bedömning. Använd därför försiktighet med hjälp av mindre än 10 ng ingångsd DNA med hjälp av denna metod.

Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder

Följande protokoll tillåter fullständig exome-sekvensering av HRS-celler från primära Hodgkin-lymfomprover. CHL-lymfnodprover som innehåller minst 2 x 107 celler är lämpliga för denna procedur. Detta var inte tidigare tillgängligt för forskningErs, som förlitade sig på tekniker som laserinspelning mikrodissektion och hel genomförstärkning. Det förutses att genomiska tillvägagångssätt för primära CHL-fall kommer att fortsätta att vara värdefullt för att ytterligare förstå CHL-patogenes. Data pekar också på signifikant genom-heterogenitet inom denna sjukdomsenhet med eventuellt minst två definierade delmängder som löst följer morfologisk stratifiering mellan nodulär skleros och CHL med blandad cellitet. Slutligen tros det att genomivådata kommer att leda till utveckling av riktade terapi för svåra att behandla återfallande / eldfasta CHL-fall.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri or Cell Culture Dish (sterile)
RPMI-1640 Media	Roswell Park Memorial Institute
Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated)
Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile
RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month)
scalpel with fresh blade
10 mL syringe (no needle)
Cryogenic vials
50 mL conical centrifuge tubes, force
Centrifuge			capable of handling 50 mL conical centrifuge tubes and providing 400g
Hepes buffer(1 M, cell culture grade)
phosphate buffered saline (PBS)
Pluoronic-F68	Thermo-Fisher	24040-032
DNAase-I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D4527-10KU	store as 5 mg/mL in RPMI in -200 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)
Sort Media (PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + Pluoronic –F68 (1x))
CD64-FITC (22)	Beckman Coulter, Miami, FL		20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD30-PE (BerH83)	BD Biosciences, San Jose, CA		20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD5-ECD (BL1a)	Beckman Coulter, Miami, FL		10 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10)	Ebiosciences, San Diego, CA		5 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD20-PC7 (B9E9)	Beckman Coulter, Miami, FL		10 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD15-APC (HI98)	BD Biosciences, San Jose, CA		20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD45 APC-H7 (2D1)	BD Biosciences, San Jose, CA		Can be substituted with 10 μL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested
CD95-Pacific Blue (DX2)	Life Technologies, Grand Island, NY		5 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD2 (5 μg; clone RPA-2.10)	Biolegend, San Diego, CA		For optional protocol; Titering is suggested
CD54 (10 μg; clone 84H10)	Serotec, Oxford, United Kingdom		For optional protocol; Titering is suggested
CD58 (10 μg; clone TS2/9)	eBioscience, San Diego, CA		For optional protocol; Titering is suggested
LFA-1 (12 μg; clone MHM23)	Novus Biologicals, Littleton, CO		For optional protocol; Titering is suggested
BD CS&T Beads	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Accudrop Beads	BD Biosciences, San Jose, CA
BC Versa Comp antibody capture beads	Beckman Coulter, Miami, FL		Compensation Beads
BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers	BD Biosciences, San Jose, CA		any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient
Wizard	Promega	A2360
10 mM Tris-Cl buffer	NA
Qubit dsDNA HS Assay kit	Life Technologies, Carlsbad, CA
S2 Sonicator	Covaris, Woburn, MA		Alternatives may be substituted
microTUBE	Covaris, Woburn, MA
Low-Throughput Library Preparation Kit	Kapa Biosystems, Wilmington, MA	KK8221
Sybr Green	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9430
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter, Miami, FL
Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SeqCap EZ Exome v.3.0	Roche Nimblegen	6465684001
HiSeq	Illumina
TruSeq-style Universal adapter	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T
TruSeq-style index adapter	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq-style PCR primer 1	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		AATGATACGGCGACCACCGAGA
TruSeq-style PCR primer 2	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
Nuclease Free Duplex Buffer	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa
BD FACSDIVA software	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Falcon Tubes	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Flow Tubes	BD Biosciences, San Jose, CA