Flowsortering og Exome-sekventering af Reed-Sternberg-cellerne af klassisk Hodgkin-lymfom

Summary

Her beskriver vi en kombineret flowcytometrisk celle sortering og lav input, næste generations bibliotek konstruktion protokol designet til at producere højkvalitets, hel-exome data fra Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) celler af klassisk Hodgkin lymfom (CHL).

Abstract

Hodgkin Reed-Sternberg-cellerne fra klassisk Hodgkin-lymfom fordeles sparsomt inden for en baggrund af inflammatoriske lymfocytter og omfatter typisk mindre end 1% af tumormassen. Materiale afledt af bulktumor indeholder tumorindhold ved en koncentration utilstrækkelig til karakterisering. Derfor beskrives fluorescensaktiveret cellesortering ved anvendelse af otte antistoffer, såvel som side- og fremadspredning, som en metode til hurtigt at adskille og koncentrere sig med høje renheds tusinder af HRS-celler fra tumoren til efterfølgende undersøgelse. På samme tid, fordi standardprotokoller for exome-sekventering typisk kræver 100-1.000 ng input-DNA, hvilket ofte er for højt, selv med strømningssortering, giver vi også en optimeret, lavindstillet bibliotekskonstruktionsprotokol, der er i stand til at producere høj kvalitet Data fra så lidt som 10 ng input DNA. Denne kombination er i stand til at producere næste generations biblioteker, der er egnet til hybridisering af hele-eXome lokkemad eller mere fokuserede målrettede paneler, som ønsket. Eksome-sekventering af HRS-cellerne, når de sammenlignes med sunde intratumor-T- eller B-celler, kan identificere somatiske ændringer, herunder mutationer, insertioner og deletioner og kopiantalændringer. Disse resultater belyser HRS-cellernes molekylærbiologi og kan afsløre veje til målrettede lægemiddelbehandlinger.

Introduction

Fremskridt i kræft genomik som følge af næste generations sekventering har ført til betydelige gennembrud i identifikationen af ​​terapeutiske mål og i prognostikation for mange hæmatologiske og ikke-hæmatologiske neoplasmer. Nye individualiserede behandlingsstrategier baseret på specifikke genomiske ændringer introduceres hurtigt i mange tumortyper (gennemgået i referencer ^{1 , 2} ). På trods af signifikante fremskridt i lymfom genomik var genomet af de neoplastiske HRS-celler i klassisk Hodgkin-lymfom (CHL) blevet undersøgt. Undersøgelserne er blevet hæmmet af knapheden af ​​neoplastiske HRS-celler inden for et reaktivt mikromiljø, hvilket gør det vanskeligt at isolere rensede HRS-cellepopulationer ³ .

Fremgangsmåden til isolering af levedygtige HRS-celler fra primære tumorer blev udviklet af Fromm et al. ^{4 ,}Ref "> 5 ^{, 6.} Metoden anvender en otte-antistof-cocktail, der består af CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 og CD64 til entydigt at identificere HRS-celler fra en CHL-tumor suspension. Er i stand til at isolere mindst 1.000 levedygtige HRS-celler fra friske eller frosne cellesuspensioner fra tumorbiopsier bestående af mindst 10 ⁷ celler (ca. 10 mg væv). Renheden er større end 90% ved flowcytometrisk analyse og anslås at være Mindst 80% ved eksome genomisk analyse af ti på hinanden følgende tilfælde.

Vi har raffineret en flowcytometrisk celleisoleringsteknik, der har lettet processen væsentligt, hvilket muliggør hurtig isolering af tusindvis af levedygtige HRS-celler fra primære CHL-tumorer ⁷ . Vi har brugt teknikken til at producere, hvad der menes at være tumorens første heleksome-sekvens i primære tilfælde af Hodgkin-lymfom. Vores studier demonstrerer thE gennemførlighed af høj gennemstrømning, genomgående undersøgelser af individuelle CHL tilfælde og har allerede ført til identifikation af nye genomiske ændringer med potentialet til at forklare aspekter af CHL patogenese.

Vi udviklede yderligere en rørledning til at udnytte det ekstraherede DNA til høj genomstrømning genomiske undersøgelser. For at opnå pålidelige resultater fra så få som 1.000 sorterede HRS-celler (det mindste opnået fra sekventielle tilfælde) udviklede vi yderligere en modificeret næste generations DNA-bibliotekskonstruktion ^8, der tillod os at øge adapterligeringseffektiviteten og at generere DNA-fragmentbiblioteker Uden overdreven amplifikation. Denne metode muliggør analyse af rutinemæssige kliniske prøver og påvisning af tilbagevendende mutationer og kromosomale ændringer ⁷ .

Protocol

1. Væv Behandling og Frysning

1. Saml lymfeknudevæv i fosfatbufret saltvand (PBS) eller Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) og behandle inden for 24 timer efter indsamling. Overfør udskåret lymfeknudevæv ⁹ til en petriskål indeholdende 10 ml RPMI med 2% føtalt kalveserum (FCS) og finhakket det med en frisk skalpelsblad. Brug bagsiden af ​​et 10 ml sprøjtestempler til yderligere at male / dissociere vævet.
2. Overfør væsken til et 50 ml konisk rør gennem en 100 μm cellesilinder. Skyl petriskålen og filteret med yderligere 10 ml RPMI 2% FCS.
3. Få et celleantal ved hjælp af enten en automatiseret celle tæller eller et hæmocytometer.
   BEMÆRK: Generelt forventes mindst 2 x 107 celler fra ca. 5 mm ³ CHL lymfeknudevæv. En levedygtighed på over 80% forventes, men den kan variere efter stikprøve.
4. Spin ned cellerne ved 400 xg i 10 minutter og aspiraI supernatanten. Placer den rørholdige cellepille på is.
5. Forkøl fryseprodukt på is. Resuspender cellerne i koldfrysningsmedium ved en koncentration på 2 x 107 / ml og resuspender den ved pipettering. Vortex ikke. Inkubér suspensionen på is i 10 minutter.
6. Aliquot prøven 1 mL / cryo hætteglas (forkølet på is). Overfør hætteglassene til en fryser på -80 ° C i 1-2 dage og overfør dem igen til flydende nitrogen.

2. Forberedelse af cellesuspensioner til cellesortering

BEMÆRK: Hvert parti antistof skal korrekt titeres ved anvendelse af 10 millioner celler i et 300 μg farvningsvolumen. Perifert blod kan anvendes til alle antistoffer undtagen CD30, for hvilke KMH2 cellelinien spidset til perifert blod kan anvendes til titrering ¹⁰ . Vi begynder generelt med producentens anbefalede mængde antistof og udfører to to gange fortyndinger og en to gange stigning (fire datapunkter)For hvert parti antistoftitrering. For eksempel, hvis producenten anbefaler et 10 μl volumen, udfører vi titrering med 2, 5, 10 og 20 μl volumener.

1. Anbring et vandbad til 37 ° C. Forbland den titerede mængde antistoffer i et mørkt glas hætteglas og tilsæt PBS + 2% BSA for et totalt cocktailvolumen på 100 μl.
   BEMÆRK: Selv om vi anbefaler at titere antistofferne, kan følgende volumener anvendes som udgangspunkt: CD64, 20 μL; CD95, 5 μl; CD30, 20 μl; CD5, 10 μl; CD20, 10 μl; CD15, 20 μl; CD40, 5 μl; Og CD45, 10 μl.
2. Overfør hætteglasset fra flydende nitrogen i en isskop med tøris for at forhindre optøning. Forvarm 50 ml optøningsmedium indeholdende RPMI / 20% FCS / DNase (100 μg / ml) i et 50 ml konisk rør i et 37 ° C vandbad.
3. Overfør 45 ml optøningsmedium til et frisk rør og hold det ved 37 ° C. Tø hurtigt cellerne ved at holde et kryogent hætteglas i en 37 ° C vandfladteH, indtil kun en meget lille frossen del forbliver.
4. Hæld hætteglassets indhold i røret, der indeholder 45 ml optøningsmedium. Skyl det tomme kryogen hætteglas 2 gange med 1 ml optøningsmedium og kombiner skyllene.
5. Inkuber cellerne ved stuetemperatur i 15 minutter for at tillade DNase-fordøjelse og celleudligning. Spin ned cellerne ved 500 xg i 10 minutter og aspirer supernatanten.
6. Resuspender cellerne i ca. 200 μL af optøningsmediet holdes tilbage (5 ml) og lad det ækvilibrere til stuetemperatur i 2-3 minutter. Genopretning af> 70% frosne levedygtige celler forventes.
   BEMÆRK: For en større renhed af sorterede HRS-celler, der kan rosettes af vedhæftede T-celler, kan en cocktail af umærkede antistoffer tilføjes ved dette trin (se den valgfrie protokol).
7. Tilsæt 100 μl af en antistofcocktail og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur (RT), beskyttet mod lys. Tilsæt 3 ml sorteringsmedium, spind ned cellerne ved 500 xgI 10 minutter og aspirere supernatanten.
8. Resuspender cellerne i 1 ml sorteringsmedium og overfør dem til en 5 ml flowrør-topsilinder.
9. Skyl både det 50 ml koniske rør og cellefilmen med yderligere 1 ml sorteringsmedium og læg celler på is.

3. (Valgfri protokol) T Cell Rosette Blokering

BEMÆRK: HRS-celler er roset af T-celler i vævssektioner og cellesuspension, og disse T-celler kan potentielt forurene den sorterede HRS-fraktion. Disse interaktioner medieres af CD54 og CD58 på HRS-cellen, der binder til LFA-1 og CD2 på T-cellerne ^{4 , 11} . Disse interaktioner kan blokeres med umærkede antistoffer mod disse adhæsionsmolekyler.

1. Aliquot 100.000 til 500.000 celler i 100 μl RPMI.
2. Inkuber cellesuspensionen med umærkede antistoffer mod CD2, CD54, CD58 og LFA-1 (10 μl hver) på is i 1 time. THan cellesuspension kan nu mærkes med fluorescerende antistoffer.

4. HRS-, B- og T-celleisolering ved anvendelse af cellesortering

BEMÆRK: Selvom vi brugte et særligt forskningsordreinstrument ved hjælp af 5 lasere (se Materialets regneark), bør enhver sorter med evnen til at detektere fluorokromerne, der anvendes i antistoffepanelet, være tilstrækkelig. Udførelsen af ​​trinene nedenfor kræver en fortrolighed med software ^12- funktionen og et grundlæggende kendskab til cellesorteringsoperationer. Se venligst online software manualen for detaljerede instruktioner.

1. Cytometer opsætning:
   1. Tænd computeren og log ind. Tænd for BSC (og BSC udgange), og tænd derefter for cytometeret. Vent mindst 90 s for at cytometerets interne CPU skal starte, og åbn derefter laserstyringssoftwaren og kontroller, at alle lasere er tændt. Start cytometer software ¹³ og login.
   2. Inden for cytometer-softwaren skal du klikke på "Cytometer → View Configurations." Når dialogboksen til konfigurationsunderprogrammet åbnes, skal du markere den 130-μm tilpassede konfiguration og klikke på "Indstil konfiguration" og "OK". Afslut konfigurationsunderprogrammet.
   3. Overhold dialogboksen i cytometer-softwaren og klik på "brug CS & T-indstillinger." Installer en 130 μm dyse i instrumentet og tænd strømmen ved at klikke på den røde "X" -knap i strømvinduet. Lad instrumentet opvarme i mindst 30 minutter.
   4. Kør en præstationsprøve på instrumentet ved hjælp af den ønskede metode (et præstationssporingssoftware modul er inkluderet i sorteringen beskrevet her, se softwarehåndbogen (s. 117 - 122) og referencestandard (se Materialerne til den standard, der anvendes i Denne opsætning).
      1. Klik på "Cytometer → CST," Sørg for at feltet "Karakteriser" er indstillet til "ChecK Performance "på rullemenuen og klik på" Kør ". Når du bliver bedt om software, skal du indlæse et rør af referencepartikler på prøvefasen og klikke på" OK ".
      2. Når kørslen er færdig, skal du klikke på "Udfør" og lukke softwaremodulet. Når cytometersoftwaren er færdig med at forbinde til cytometeret, skal du klikke på "brug CS & T-indstillinger" i dialogboksen, der vises.
   5. Bestem den korrekte dropforsinkelse ved hjælp af den automatiske dropforsinkelsesfunktion af cytometersoftwaren (se s. 154 - 161 i softwarehåndbogen).
      1. Åbn eksperimentet "Drop Delay" i "Browser" -vinduet i cytometersoftwaren, installer et rør med kalibreringspartikler på prøvefasen og klik på "Load" i vinduet "Acquisition Dashboard". Aktivér den automatiske strømovervågningsfunktion ved at klikke på "Sweet Spot" -knappen i "Stream" -vinduet. Lad denne funktion altid være til stede for alle efterfølgendeG trin.
      2. Tænd spændingspladespændingen ved at klikke på knappen "Spænding" i sidestrømvinduet, og tænd for test sortering ved at klikke på knappen "Test Sort" umiddelbart ved siden af ​​"Spænding" knappen.
      3. Juster alle sidestrøm indstillinger til nul undtagen venstre sidestrøm. Juster indstillingen for venstre sidestrøm, så to strømspots er synlige i sidestrømvinduet. Klik på knappen "Optisk filter", og kontroller, at det venstre sidestrømpunkt falder inden for den venstre boks, der vises i det svarte område i sidestrømvinduet.
      4. Juster indstillingen for venstre sidestrøm, hvis det er nødvendigt. Sluk test sortering ved at klikke på knappen "Test Sort" igen. I "Browser" -vinduet udvider du "Global Worksheets" -elementet i "Drop Delay" -forsøget ved at klikke på "+".
      5. Dobbeltklik på "Sort Layout_001" for at åbne sorteringslayoutet, verificer ved visuel inspektionIon, at den venstre sorteringspopulation har "P1" tildelt den og klik på "Sorter" i vinduet "Sorter layout". Klik på "Automatisk forsinkelse" i vinduet "Sorter layout" og derefter "Kør".
      6. Når kørslen er færdig, skal du klikke på "Afslut". Installer et rør sterilt deioniseret vand på prøvefasen og klik på "Load" i vinduet "Acquisition Dashboard". Kør røret med vand i mindst 5 min for at fjerne resterende testpartikler fra instrumentet, inden du fortsætter.
   6. Kør kompensationskontrol (ved hjælp af kompensationsperler fra materialet regneark eller tilsvarende) ved hjælp af en indbygget kompensationsopsætning i sorteringssoftwaren (se s. 131 - 137 i softwarehåndbogen for yderligere detaljer).
      1. Opret et nyt eksperiment ved at klikke på "Eksperiment nyt eksperiment". På fanen "Parametre" i vinduet "Instrumentstatus" skal du slette ubrugte parametre. Klik på "Experiment CompensatIon Setup Opret kompensationskontrol. "
      2. I vinduet "Browser" skal du udvide "Kompensationskontrol" -prøven ved at klikke på "+" -tegnet. Kør kompensationskontrolrør uden at optage dataene, og juster om nødvendigt detektorspændingerne (i "Parametre" fanen i "Instrument Status" vinduet), så at positivt farvede perlepopulationer for hver fluorochrom ligger mellem kanal 10.000 og 100.000 og er Den lyseste i deres primære detektions kanal.
      3. Skriv ned de nødvendige spændinger for hver parameter for hvert rør. Fremhæv "Unstained Control" -røret under "Kompensationskontrol" -prøven ved at single-venstre-klikke på den. Læg det ufarvede kontrolrør på prøvefasen og klik på "Load" i vinduet "Acquisition Control".
      4. Indtast de fastsatte spændinger manuelt ved at køre individuelle kompensationskontroller i detektorspændingsfelterne for alle parametre, ogKlik derefter på "Optag" i vinduet "Acquisition Control". Kør alle resterende kompensationskontroller, registrer dataene uden at ændre nogen detektorindstillinger. Installer et rør sterilt, deioniseret vand i 5 minutter for at fjerne alt resterende materiale fra instrumentet, inden du fortsætter.
2. HRS-cellegating:
   1. Køb og registrer mindst 100.000 begivenheder til indledende gating, mens du justerer strømningshastigheden for at erhverve 3.000-4.000 begivenheder / s (se trin 4.1).
      BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at tilføje yderligere sorteringsmedium til fortynding af cellerne, hvis cellekoncentrationen er for høj. Stop overtagelsen.
   2. Gate HRS-celler ved hjælp af trinene skitseret i figur 1
      BEMÆRK: I de fleste CHL tilfælde vil mellem 0,01% og 0,1% af cellerne være HRS-celler.
3. B- og T-cellegating:
   1. Identificer somatiske kontroller (B og T-celler) ved gating af CD20 og CD5 respCtively (gating lymfocytter af CD45 / SSH) efterfulgt af CD20 versus CD5 (se figur 1 ).
   2. Målsamling strømmer til opsamlingsrør i et forkølet to-vejs eller fire-vejs indsamlingsstativ. Fyld enten flowrør eller 15 ml centrifugestil rør mindst halvvejs med opsamlingsmedium.
   3. Tildel HRS og kontrolpopulationer til ordentlige opsamlingsrør i sorteringsopsætningen efter leverandørinstruktioner. Genstart celleopsamlingen og start sorteringen.
   4. Saml alle HRS celler og op til 1 million B og T celler. Mål kollektive strømme til opsamlingsrør i et forkølet 4-vejs (eller tovejs) samlingsstativ.

5. DNA-ekstraktion

1. Pellet opsamlede celler ved centrifugering i 1,5 ml koniske rør ved 3.000 xg i 10 minutter og resuspenderes en gang med 1 ml PBS for at vaske cellerne.
2. Pellet igen en gang ved 3000 xg i 10 minutter og fjern supernatanten; Vær meget forsigtig for ikke at forstyrreDen lille pille.
3. Tilsæt 150 μl lysisbuffer (eller et passende volumen til det anvendte kit) til de vaskede celler og bland ved pipettering op og ned.
   BEMÆRK: Man kan opbevare cellelysat ved -70 ° C på dette tidspunkt, hvis det er nødvendigt.
4. Konstruer en søjleindretning ved at placere filterkolonnen inde i røret og tilsæt lysatet fra trin 5.5 til søjlen. Spin samlingen ved 13.000 xg i 3 min.
5. Fjern minikolonnen fra samlingen og kassér væsken i opsamlingsrøret. Udskift minikolonnen i opsamlingsrøret.
6. Tilsæt 650 μL kolonne vaskeopløsning til hver samling. Centrifuge i 1 min ved 13.000 x g. Kassér væsken fra opsamlingsrøret. Gentag dette trin for i alt 4 vasker.
7. Kassér væsken fra opsamlingsrøret og saml minikolonneanordningen igen. Centrifuger i 2 minutter ved 13.000 xg for at tørre bindingsmatrixen.
8. Overfør minikolonnen til et nyt 1,5 ml rør og tilsæt 25 μl 10 mM Tris-Cl, somForetrækkes til efterfølgende lydbehandlingstrin eller Nuclease-Free Water opvarmet til 65 ° C. Inkubér i 2 minutter ved stuetemperatur og centrifuger samlingen ved 13.000 xg i 1 min. Gentag igen med 25 μL for i alt 50 μL.
9. Bland DNA-elueringen ved pipettering op og ned og kvantificer ved anvendelse af fluorimetri ¹⁴ .

6. Bibliotekskonstruktion

1. Forberedelse inden begyndelsen:
   1. Opsæt sonikatoren ved vandniveau 12, Intensity 5, Cycles / burst 200 og Temp 7.
   2. Baseret på den tilgængelige DNA-mængde bestemt ved hjælp af fluorimetri og det eksperimentelle design bestemmer mængden af ​​DNA, der skal anvendes til bibliotekskonstruktion.
      BEMÆRK: Husk, at hvis der bruges for lidt DNA, og kvaliteten af ​​biblioteket er kompromitteret, kan der være lidt ansøgning om materiale, der efterlades for validering. For substandard input mængder, jo større input masse, jo højere kompLexitet af det resulterende sekventeringsbibliotek. Nogle retningslinjer for denne protokol er som følger: 10 ng skal give gode resultater, og 50 ng kan betragtes som et groft maksimum.
   3. Bestem adapteren: Indsæt molforholdet løst på værdierne i tabel 1 .
   4. Beregn mængden af ​​adapter til brug på følgende måde:
      BEMÆRK: Antal mol DNA-input, n
      jeg. N = 1,54e-12 ^-12 * inputmasse (i ng) / (gennemsnitlig fragmentstørrelse)
      ii. Når den gennemsnitlige fragmentstørrelse er 200 bp, forenkles dette til:
      N = 7,7e-15 * indgangsmasse (i ng)
      Antal mol adapter til at omfatte, a
      jeg. A = n * r
      Volumen af ​​adapter lager til brug i adapter ligation trin, v
      jeg. V (i μL ) = a / [ 10 ^-12 * adapter lagerKoncentration (i μM )]
      BEMÆRK: Hvis adapterkoncentrationen er lav, for at sikre, at den nødvendige mængde adapter er inkluderet, kan adapteropløsning anvendes til at fortynde slutreparationsreagenserne i stedet for vand.
      Eksempel: For 100 ng input-DNA med en gennemsnitlig fragmentstørrelse på 200 bp, for en ønsket molaradapter: indsætforhold på 15: 1 og en adapterlagerkoncentration på 2 μM, er det anbefalede volumen af ​​adapter til brug 5,8 μL.
   5. Tildel indekserede stregkoder til prøverne.
      BEMÆRK: Biblioteker, der vil blive samlet i en hybridiseringsreaktion eller en bane på en sequencerens strømningscelle, må ikke indeholde nogen overflødige indeks.
2. Bibliotekskonstruktion - DNA-skæring:
   1. Tilføj hele mængden af ​​DNA, der skal bruges til et sonikationsrør. Hvis volumenet af prøve indeholdende input DNA alene er mindre end 50 μL, tilsættes Buffer EB op til et 50 μl totalt volumen og blandes.
   2. Sonicate til 30 s.
   3. Fjern røret og udfør en hurtig-spin i en mini centrifuge lige nok til at samle nogen spray fra den øvre del af væggene i mikrotubeen.
   4. Gentag trin 6.2.2-6.2.3 for i alt syv 30 s sonication sessioner for i alt 210 s af sonikering.
      BEMÆRK : Du er velkommen til at eksperimentere med at dividere 210 s til færre sessioner.
3. Bibliotekskonstruktion - Slutreparation, A-tailing og adapterligation:
   BEMÆRK: Undgå at foretage nogen størrelsesvalg inden bibliotekets PCR-amplifikationstrin.
   1. Følg producentens anvisninger ¹⁹ til slutreparation og A-tailing efter sonikering af prøve DNA.
   2. Efter A-tailing skal du bruge det passende antal mol adapter (beregnet i trin 6.1.3) i reaktionen. Kombiner adapteren, A-tailed DNA-fragmenter, enzym og buffer og inkuber natten over ved 20 ° C i ca. 16 timer.
4. libRary konstruktion - Bibliotek forstærkning:
   1. Udfør en perleoprensning af adapterligationsreaktionen. Efter at have tilføjet perler til PCR-produktet, vent 5 min ved stuetemperatur. Placer den mod en magnetisk stativ og fjern væskerne, vask to gange i 200 μl 80% ethanol, tør pærerne lang nok til at fjerne det meste af væsken uden overtørring og eluere DNA'et fra perlerne ved at pipettere 25 μl Nukleasefrit vand, som foreslået, på perlerne, mens røret forbliver imod en magnetisk stativ.
      BEMÆRK: Det kan være muligt at eksperimentere med bevaring af perlerne i polyethylenglycol
      (PEG) indtil efter amplifikationen i stedet for at kassere dem, men dette er ikke blevet testet.
   2. Inkluder 0,6 μl af en 1: 1.000 fortynding af grønt farvestof pr. 50 μl PCR-masterblanding. Alternativt kan du bruge et realtid PCR-kompatibelt intercolating farvestof i valg i det passende volumen for udstyret.
   3. Programmer PCR reaktionen ved 98 ° C for45 s for den oprindelige denaturering efterfulgt af en cyklus af denaturering, glødning og forlængelse ved 98 ° C i 15 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s eller vælg det passende program, hvis der anvendes et alternativ Polymerase enzym.
      1. Indstil maskinen til at tage fluorescensdata ved 72 ° C for hver cyklus. Program en endelig forlængelse ved 72 ° C i 1 min efterfulgt af et hold ved 4 ° C i ubestemt tid. PCR-primere til amplifikation af det adapter-ligerede bibliotek ved anvendelse af reagenser i tillægstabellen er: Oligo 1, AATGATACGGCGACCACCGAGA og Oligo 2, CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
   4. Forstærk biblioteket ved hjælp af PCR-betingelserne beskrevet ovenfor, mens du observerer fluorescensintensitetsværdierne i realtid med qPCR-softwaren, stopper lige før slutningen af ​​den eksponentielle vækstfase.
   5. Efter amplifikation, lav en standard perleoprydning (se trin 6.4.1) ved anvendelse af 0,8x volumen af ​​amplifikationsreaktionsrekvovHærdet, typisk 0,8 x 50 = 40 μl perler. Tilføj perlerne til PCR-produktet og vent 5 minutter ved stuetemperatur.
   6. Placer den mod et magnetisk stativ og fjern væskerne, vask to gange i 200 μl 80% ethanol, tør perlerne lang nok til at fjerne det meste af væsken uden at tørre over og eluere ved at tilsætte nukleasefrit vand til de tørre perler.
   7. Kvantificer det resulterende DNA ved anvendelse af fluorimetri. Visualiser bibliotekets fragmenter for størrelse; Se afsnittet om Data QC forventninger til flere detaljer.

7. Exome Hybridization

1. Kombiner fire biblioteker med forskellige adapterstregkoder.
   BEMÆRK: Masse ved fluorimetri og størrelse ved gel anvendes til at beregne molariteten, og derefter kombineres biblioteker i ækvimolære mængder for i alt en 1.000 ng masse poolet bibliotek. Det er bedst at holde alle tumor-normale par sammen snarere end at adskille dem i separate pools.
2. Anvend exome capture capture protokollen Up class = "xref"> 15 og gøre 8 PCR cykler efter opsamlingsoprydning. Andre valg af fangstmål kan være muligt.

8. Multiplexet sekventering

1. Sequence en enkelt hybridiseringsoptagelse indeholdende fire multipleksede biblioteker i en enkelt bane på sekventeringsplatformen, der henvises til i Materiale-regnearket ¹⁶ .
   BEMÆRK: Alternative konfigurationer er mulige for avancerede brugere, der ønsker at planlægge og optimere deres mållæsningsdybde.

9. Analyse (Kan erstattes med Alternativ Pipeline (r) hvis ønsket)

1. Snps og små indeler:
   1. Kort rå data til det humane referencegenomet, UCSC hg19, ved hjælp af Burrows-Wheeler Aligner (BWA) ¹⁷ eller en alternativ algoritme. Filter eller mærke læser med en kortlægningskvalitets score under 20 og PCR-duplikater ved hjælp af Samtools ¹⁸ eller PicardRef "> 19.
   2. Detektere somatiske nukleotidvarianter og små indeler i HRS-prøver sammenlignet med T-cellets somatiske kontroller ved anvendelse af Strelka ²⁰ eller en variantopkaldsmodtager. Anvend snpEff ^{21 for} at annotere Strelka output. Ønsker du systematisk at inspicere variant loci for artefakter ved hjælp af Integrated Genome Viewer (IGV) ^{22 , 23} .
2. Kopier nummerændringer:
   1. Beregn det log-transformerede forhold " ltr " for hvert exome målinterval " i " af intra-bibliotek normaliserede læs tæller i tumoren mod normalets normale på følgende måde:
      
      BEMÆRK: c er antallet af læsning af kortlægning til et givet opfangningsinterval, l er den samlede biblioteksstørrelse, t betegner tumor og n betegner normal.
   2. Filterintervaller med utilstrækkelig dækning ( C _t + C _n <100 læser) til yderligere analyse. Gennemføre pan-interval segmentering ved hjælp af DNAcopy v.1.0 ²⁴ fra Bioconductor i R.
      BEMÆRK: Overvej segmenter, hvor den absolutte værdi af den gennemsnitlige ltr er under 0,5 for at være kopi-neutral. Resterende segmenter kan betegnes som kopienummergevinster, hvis tegn på den gennemsnitlige ltr er positiv (med andre ord er der signifikant flere aflæsninger i tumorprøven end i den normale prøve efter normalisering) eller kopiantaltab, hvis tegnet Af den gennemsnitlige ltr er negativ.

Representative Results

En bioanalyzer plot skal tages efter bibliotekets amplifikation og 0,8x perleoprydning. Man bør se en "normallignende" fordeling af fragmentstørrelser i det ønskede interval ( figur 2a ). Afvigelser fra denne form, såsom en synlig "skulder" i kurven, angiver tilstedeværelsen af ​​en artefakt med høj eller lav molekylvægt. For eksempel viser figur 2b -2d eksempler på biblioteker indeholdende synlige artefakter, som ideelt set ikke skal sekventeres. Hvis et bibliotek er væsentligt kompromitteret, kan det være værd at gentage bibliotekets konstruktion, hvis DNA er tilgængeligt og / eller cellesorteringen begynder frisk.

En adapter dimer kan undertiden overføre gennem den første 0,8x perle oprydning. Hvis dette sker, vil det være synligt som en skarp top centreret omkring 125 - 130 bp (se FigurE 2c). I dette tilfælde anbefales det at gentage en yderligere 0,8x perleoprydning og gentage bioanalysatoren for at sikre en vellykket fjernelse af dimeren.

Ved anvendelse af specifikationerne beskrevet i denne protokol og multiplexering af sekventeringen på niveauet af fire prøver pr. Bane i sequenceren, der er anført i Materiale regnearket, læser en middeldybde på 50-100x over målet (efter fjernelse af bioinformatik fjernelse af PCR-duplikat) Kan opnås (se figur 3a ). Desuden bør biblioteker, der ikke blev foramplificeret, og som resulterede i biblioteker med tilstrækkelig dækning, producere rene eksemplarer af kopiantal. I løbet af det tidlige arbejde blev denne bibliotekskonstruktionsprotokol testet over tre størrelsesordener af inputmasse, og variable resultater blev opdaget (se afsnittet Diskussion). Kopier antal plotter genereret ved hjælp af et bibliotek genereret fra 1 ng, en suboptimal mængde input DNA, Resulterede i falske kopiantal gevinster og tab ( figur 3b , bund).

Ca. 70% af tilfældene af CHL bærer B2M- og A20-mutationer og / eller deletioner ⁷ . B2M-mutationer omfatter overvejende et translationsstartsted, et første exon-stopsted og et første exon-stopsted. A20 mutationer er en blanding af kopi nummer tab og indeler. Mutationerne synes at være klonale og kan anvendes til at estimere relative tumorindhold. Hvis T-celler anvendes som somatiske kontroller, vil HRS-sekventering vise signifikante kopiantalgevinster i positionerne svarende til T-cellereceptor alfa / delta (14q11-12) og beta-positioner (7q32-35) samt betydelige tab i B-celle receptor tung kæde (14q32) og kappa lette kædepositioner (2p11) (se figur 4 ). Samlet sekventering viser et interval fra 100 til 400 somatiske mutationer pr. Tilfælde. Kopiantalvariation er meget vI nogle tilfælde, der viser talrige segmentgevinster og -tab og andre tilfælde, der kun viser nogle få ændringer.

Figur 1: Multiparameter Gating til strømningssortering af levedygtige HRS-, B- og T-celler. Befolkningsnavne vises på plot og angiver forældrespopulationen i en hvilken som helst port. ( A ) viser alle celler: På FSC-H versus FSC-A histogram tegner du en SINGLETS-port, som omfatter populationer med proportionelle FSC-H og FSC-A-stigninger. Ekskluder dubletter med høj FSC-A og lavere FSC-H. Hodgkin-celler er meget store; Udvide porten til at omfatte høje FSC-H og FSC-A hændelser. ( B ) Udelukkende affald, døde celler og ulysede RBC'er, der normalt har lavere FSC-A og små stigninger i SSC-H uden at skære ud levedygtige populationer (VIABLE gate). ( C ) Gate MONONUCLEAR celler påFSC-A versus SSC-H for at udelukke granulocytter med højt SSC-H; Bemærk, at porten kun bruges til identifikation af T- og B-celler. ( D ) Gate T CELLS identificeret positivt af CD5 (grøn) uden CD20 og B CELLS (blå), som har CD20-udtryk uden CD5. ( E ) Tegn en LARGER-port på CD45 / SSH-plottet, herunder 10-20% af lymfoide celler og alle granulocytiske celler. ( F ) Gate CD30-positive begivenheder med svag til negativ CD64 / FITC autofluorscence. ( G ) blandt CD30 positive hændelser, gate CD40- og CD95-positive hændelser (CD30 / 40/95 HRS gate, rød). ( HL ) Overhold de bekræftende immunofenotypiske egenskaber på HRS-celler; HRS-celler udtrykker generelt ikke CD20 (plot H og L). Ekspressionen af ​​CD5 er korreleret med CD45 på grund af T-celle-rosettering (I); De fleste tilfælde vil vise udtryk for CD15 og vil være lyse for CD71 ( J ). CD40- og CD95-ekspression er generelt over niveauet af B- og T-celler resp Ektivt ( K ). Denne forskning blev oprindeligt offentliggjort i Blood ⁷ . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Størrelsesfordelingsplotter af prøver efter adapterligering og forstærkning. Ideelt set bør biblioteker med synlige artefakter gentages og ikke sekventeres. ( A ) velformet bibliotek Ingen synlige artefakter. ( B ) Asymmetri i kurven afslører et problem. (C) Signifikant adapterdimer (spids ved 128) og en artefakt med høj molekylvægt (> 400 bp). Dimeren kan rengøres med yderligere 0,8x perleoprydning. ( D ) Signifikant artefakt med høj molekylvægt.S / ftp_upload / 54399 / 54399fig2large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Bioinformatiske kvalitetskontrolmålinger for biblioteker af høj kvalitet lavet af 10 ng input-DNA sammenlignet med lavkvalitetsbiblioteker fremstillet af 1 ng input-DNA. Størrelsen og fordelingen af ​​den unikke læste dybde af dækningsforventninger. ( A ) En gennemsnitlig dybde på dækningen på mindst 50 forventes ved anvendelse af 10-100 ng input DNA. ( B ) Hver af de to paneler afbilder kopiantalvariationanalyseresultater, der sammenligner data mellem 2 sekventerede biblioteker. Exoniske sondesegmenter (x-akse) versus kopiantalændring på en log _2- skala (y-akse) er tegnet for et enkelt repræsentativt kromosom (chr 6). Sammenligning af data fra et 10 ng lavt input bibliotek fra intratumoralT-celle-DNA til et 100 ng normalt input-bibliotek fra intratumoralt T-celle-DNA fra samme sag viste ingen signifikante falske positive resultater; Det vil sige, lavt input og normale indlæsningsbiblioteker er kopi-neutrale (øverste). Talrige falske positive segmentale kopiantalændringer blev kaldt, da data fra et 1 ng lavt indlæsningsbibliotek fra intratumoralt T-celle DNA blev sammenlignet med et 100 ng normalt input-bibliotek fra intratumoralt T-celle DNA fra samme tilfælde (bund). Denne forskning blev oprindeligt offentliggjort i Blood ⁷ . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Tilbagevendende kopiantal gevinster og tab med tumorceller (primære HRS og cellelinier) sammenlignet med sunde intratumor-T-celler fra primære cases. Hvis T-celler anvendes som den somatiske kontrol mod B-celleafledte HRS- og celleliniepopulationer, kan tilbagevendende gevinster ses i T-celle receptorer alfa / delta og beta. På samme måde er tilbagevendende tab detekterbare i immunoglobulin tung og kappa kæder. Denne forskning blev oprindeligt offentliggjort i Blood ⁷ . Klik her for at se en større version af denne figur.

DNA-inputmasse (n)	1-10 ng	25 ng	100 ng
Adapter: Indsæt molforhold (r)	65: 1	25: 1	15: 1

Tabel 1: DNA InSæt Mass og den tilsvarende adapter: Indsæt molarforhold. Værdierne i denne tabel kan bruges som en vejledning til beregning af mængden af ​​adapter oligo, der skal tilføjes under adapterligationstrinnet i bibliotekets konstruktion.

Discussion

Fremtidige applikationer eller retninger efter mastering af denne teknik

Dette arbejde muliggør exome-sekventering fra prøver indeholdende mindst 10 ng DNA. I den kliniske sammenhæng udelukker denne grænse de fleste fine nål aspirationsprøver på grund af utilstrækkeligt materiale, men det indeholder passende kernebiopsier og ekskise biopsiprøver. Dette gør det muligt at erhverve data fra et større sæt af mulige prøver.

Kritiske trin i protokollen

Korrekt frysning og dissociationsteknikker er kritiske for eksperimentets succes. Hele prøven skal dissocieres, herunder fibrotiske sektioner, så meget som muligt. Udnyttelse af en 130 μm dyse til celle sorter synes at være kritisk for at maksimere udbyttet af de store HRS celler og DNA. Mens strengstyrede forsøg med flere dysestørrelser ikke blev udført, øges signifikantI celleudbytter blev iagttaget under anvendelse af den større dyse sammenlignet med 100 μm, og næsten ingen celler blev detekteret på glideposten 85 μm dyse sortering (upubliceret observation).

Ændringer og fejlfinding

Når man arbejder med mindre end 100 ng masser af input-DNA til bibliotekskonstruktion, skal man sørge for at reducere alle unødvendige behandlings- og oprensningsstrin, især før PCR-amplifikation, da hvert tabt unikt molekyle resulterer i en reduktion af kompleksiteten af ​​det endelige bibliotek . Protokollen anbefaler med vilje eluerende ekstrakter i 50 μL, fordi denne værdi er kompatibel med både sonikering og slutreparation ved hjælp af det anbefalede udstyr. På denne måde er det ikke nødvendigt at reducere elueringsvolumenet ved anvendelse af en centrifugalinddamper eller en søjle til sonikeringstrinet eller for at reducere lydstyrken for slutreparationstrinnet. Yderligere modifikationer af denne protokol er mulige; For eksempel kan nye bibliotekskonstruktionssæt forbedre adapterligeringseffektiviteten. Man kunne fejlsøge / optimere ved at sammenligne adaptermedierede biblioteksforstærkerkurver ved hjælp af realtidsforstærkning på biblioteker lavet med forskellige kits fra samme mængde og kvalitet af input-DNA.

Begrænsninger af teknikken

Mindst 10 ng renset HRS-DNA (ca. 1.000 sorterede celler efter tab i sorterings- og ekstraktionstrinnene) synes at være den minimale mængde for resultater af høj kvalitet. I pilotforsøg blev DNA fra en enkelt prøve af oprensede T-celler først anvendt til at gøre biblioteker spænder over en række inputmasser. 100 ng (standard anbefalet mængde) af input-DNA blev sammenlignet med biblioteker genereret under anvendelse af denne lavindgangsprotokol for 10 ng og 1 ng input DNA. Biblioteket genereret fra 10 ng input DNA havde ingen signifikante forskelle fra 100 ng input bibliotek i størrelse og distribution afDækning på tværs af målet eller i PCR-duplikationsfraktion. Biblioteket genereret ved anvendelse af 1 ng input DNA resulterede imidlertid i en signifikant højere PCR-duplikatfraktion og et tilsvarende fald (ca. 3 gange) i gennemsnitlig dækning over målet. Desuden udviste 1 ng biblioteket afvigelse fra ensartetheden i dækningen, hvilket skabte falskpositive kopiantalændringer med hensyn til 100 ng biblioteket, i modsætning til 10 ng indgangsbiblioteket, som var kopieringsneutral i samme vurdering. Udfør derfor forsigtighed ved at bruge mindre end 10 ng input DNA ved hjælp af denne metode.

Betydningen af ​​teknikken med hensyn til eksisterende / alternative metoder

Efter protokollen tillader fuld exome sekventering af HRS celler fra primære Hodgkin lymfom prøver. CHL-lymfeknudeprøver, der indeholder mindst 2 x 107 celler, er egnede til denne procedure. Dette var ikke tidligere tilgængeligt til forskningErs, der stolede på teknikker som laser capture microdissection og hele genom forstærkning. Det forudsiges, at genomiske tilgange til primære CHL-tilfælde fortsat vil være værdifulde for yderligere at forstå CHL-patogenese. Data peger også på signifikant genom-heterogenitet inden for denne sygdomsenhed med potentielt mindst to definerede undergrupper, som løst følger morfologisk lagdeling mellem nodulær sclerose og CHL med blandet cellularitet. Endelig menes det, at genom-niveau data vil føre til udvikling af målrettet terapi til vanskelige at behandle recidiverede / ildfaste CHL tilfælde.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri or Cell Culture Dish (sterile)
RPMI-1640 Media	Roswell Park Memorial Institute
Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated)
Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile
RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month)
scalpel with fresh blade
10 mL syringe (no needle)
Cryogenic vials
50 mL conical centrifuge tubes, force
Centrifuge			capable of handling 50 mL conical centrifuge tubes and providing 400g
Hepes buffer(1 M, cell culture grade)
phosphate buffered saline (PBS)
Pluoronic-F68	Thermo-Fisher	24040-032
DNAase-I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D4527-10KU	store as 5 mg/mL in RPMI in -200 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)
Sort Media (PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + Pluoronic –F68 (1x))
CD64-FITC (22)	Beckman Coulter, Miami, FL		20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD30-PE (BerH83)	BD Biosciences, San Jose, CA		20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD5-ECD (BL1a)	Beckman Coulter, Miami, FL		10 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10)	Ebiosciences, San Diego, CA		5 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD20-PC7 (B9E9)	Beckman Coulter, Miami, FL		10 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD15-APC (HI98)	BD Biosciences, San Jose, CA		20 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD45 APC-H7 (2D1)	BD Biosciences, San Jose, CA		Can be substituted with 10 μL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested
CD95-Pacific Blue (DX2)	Life Technologies, Grand Island, NY		5 μL suggested starting volume; Titering is suggested
CD2 (5 μg; clone RPA-2.10)	Biolegend, San Diego, CA		For optional protocol; Titering is suggested
CD54 (10 μg; clone 84H10)	Serotec, Oxford, United Kingdom		For optional protocol; Titering is suggested
CD58 (10 μg; clone TS2/9)	eBioscience, San Diego, CA		For optional protocol; Titering is suggested
LFA-1 (12 μg; clone MHM23)	Novus Biologicals, Littleton, CO		For optional protocol; Titering is suggested
BD CS&T Beads	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Accudrop Beads	BD Biosciences, San Jose, CA
BC Versa Comp antibody capture beads	Beckman Coulter, Miami, FL		Compensation Beads
BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers	BD Biosciences, San Jose, CA		any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient
Wizard	Promega	A2360
10 mM Tris-Cl buffer	NA
Qubit dsDNA HS Assay kit	Life Technologies, Carlsbad, CA
S2 Sonicator	Covaris, Woburn, MA		Alternatives may be substituted
microTUBE	Covaris, Woburn, MA
Low-Throughput Library Preparation Kit	Kapa Biosystems, Wilmington, MA	KK8221
Sybr Green	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9430
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter, Miami, FL
Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SeqCap EZ Exome v.3.0	Roche Nimblegen	6465684001
HiSeq	Illumina
TruSeq-style Universal adapter	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T
TruSeq-style index adapter	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq-style PCR primer 1	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		AATGATACGGCGACCACCGAGA
TruSeq-style PCR primer 2	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
Nuclease Free Duplex Buffer	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa
BD FACSDIVA software	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Falcon Tubes	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Flow Tubes	BD Biosciences, San Jose, CA