Summary
이 보고서는 전체 두께가 마우스 피부 생검을 명확하게하고, 3 차원의 단세포 해상도 단백질 발현 패턴 증식 세포 및 sebocytes 시각화 입방 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 피부 해부학과 병리학의 정확한 평가를 가능하게하고, 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의.
Abstract
피부는 우리의 생존을 위해 필수적이다. 외부 표피 층은 모낭과 땀샘 우리의 몸과 표피 부속의 대부분을 커버하는 층상 편평 상피이다 interfollicular 표피로 구성되어 있습니다. 표피는 일생 동안 부상에 응답하여 재생을 겪는다. 이 긴밀하게 표피 내부와 표피와 진피 사이의 활성 여러 규제 메커니즘에 의해 규제되는 기저 상피 줄기 / 전구 세포 인구를 K14이 발현으로 활성화되어 있습니다. 이 문서는 전체 두께 마우스 피부 생검을 명확히하고, K14 단백질 발현 패턴을 시각화하는 간단한 방법을 설명, 사료된다 세포 증식라고 표시된, 나일 레드 sebocytes를 표시 및 3D에서 단일 셀 해상도 DAPI 핵 라벨. 이 방법은 정확한 평가와 피부 해부학과 병리학의 정량 및 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의 수 있습니다. 입방 프로토콜은 일입니다단일 셀 해상도에서 전체 두께 피부 생검 분자 및 세포 상호 작용을 조사 날짜에 사용할 수 전자 최선의 방법.
Introduction
피부는 우리의 생존을 위해 필수적이다. 그것은 세 가지 주요 레이어 외부 표피, 진피 및 피하로 구성되어 있습니다. 표피는 높은 재생 조직이다. 그것은 주로 각질 구성된 층상 편평 상피이다. 각질 세포는 기저층에서 태어나 차별화하면서 suprabasal 레이어를 통해 위쪽으로 이동하고, 결국은 자신의 출생 후 한 달에 대한 외부 각질화 층에서 발산되어있다. 표피는 모낭 및 피지선 포함 부속물들을 개발하고있다. 모낭은 생활 1 전체에 순환 방식으로 재생. 표피의 재생 능력은 interfollicular 표피와 모낭 (2)의 기저층에있는 줄기 및 전구 세포의 존재에 의해 사용할 수 있습니다.
많은 신호 전달 경로는 표피 개발 및 재생에 관여하고있다. 이들 중 일부는 내 발생이러한 헤지 호그 경로로만 표피. 다른 신호 이벤트는 진피와 표피 세 사이에 발생한다. 예를 들어, 진피의 Wnt 신호 모낭 발달에 중요한 것으로 생각되며, 그들은 활성화 성장기의 발병 모유두에서 분비되는 모낭 벌지 줄기 / 선조 세포의 증식 및 모발 성장은 4. 더 나은들이 피부암으로 회생 피부 질환으로 교란 될 수있는 방법을 이해하는 표피 발달 및 재생을 제어하는 세포 및 분자 적 메커니즘을 이해하는 것이 중요하다.
이 문서에서는 C의 리어 설명, U는 전체 마운트 피부 준비를 명확히하고, 공 초점 현미경에 의한 단일 셀 해상도에서 3 차원 단백질 발현 패턴을 시각화하는 B 비 I의 maging 칵테일과 C omputational 분석 (CUBIC) 프로토콜 5-7 nobstructed. 입방 방법은 피부의 몰입을 포함한다이 아미노 알코올 기반 화학 칵테일의 조직. 이러한 솔루션은 단일 세포 면역 해상도를 허용 투명 단백질 손상 조직을두고 피부 샘플의 굴절률을 조정한다.
interfollicular 표피와 모낭에서 각질 세포 인구를이 CUBIC 프로토콜, 기초를 사용하고 증식하는 안티 Keratin14 (K14) 및 안티 사료된다 항체를 사용하여 야생형 마우스의 전체 두께 피부 생검에 몇 군데 있었다. 야생형 피부 조직 검사에서 피지선은 나일 레드 염색을 사용하여 시각화 하였다. 마지막으로, 야생형 및 증식 YAP2-5SA-ΔC 피부 생검의 기초 각질 세포 인구 8을 비교 하였다.
이 CUBIC 프로토콜은 단일 셀 해상도에서 전체 두께 피부 조직 검사에서 단백질 발현의 시각적 평가를 가능하게하고, 유전자 변형의 피부의 표피 해부학과 형태 학적 결함을 인식하는 중요한 도구입니다마우스 및 표피 개발과 재생의 기초가되는 세포 및 분자 메커니즘을 조사합니다.
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Protocol
윤리 문 : 동물 주제와 관련된 모든 절차 승인 ACEC 프로토콜 13 / 64B에서 UNSW 호주의 동물 관리 및 윤리위원회 (ACEC)의 지침을 따르십시오.
투명 마우스 피부 조직의 1. 준비
참고 : 본 연구에 사용 된 모든 마우스는 C57BL / 6 유전 적 배경에 있었다
- 마우스 피부 조직의 컬렉션입니다.
- 인도적 경추 탈구로 쥐를 안락사.
- 조심스럽게 피부에 상처하지 트리머 복용 관리와 관련 피부 영역에서 머리카락을 제거합니다.
- 워시 피부 인산염 완충 식염수 (PBS)에 70 % 에탄올로 오염을 제거합니다.
- 집게와 지느러미 목 피부를 들어 올리고 가위로 절개를합니다.
- 지느러미 마우스 피부 (약 1.5 × 4cm)의 큰 영역을 해부하다.
- 필터 종이에 피부 진피 쪽을 평평하게하고, 샘플의 전후방 방향을 기록하십시오.
- 트라이PBS에서 새로 제조 된 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액으로 가득 15 ML 튜브에서 m 필터 해부 피부 주위에 종이, 장소.
- 4 ℃에서 냉장고에 밤새 실온에서 1 시간 동안 고정하거나.
- 15 ML 튜브에 PBS에 세척 피부 2 × 5 분.
참고 : 다음 (1.1.10 - 1.1.12)을 조직의 장기 저장을위한 선택적인 단계입니다. - 실온에서 1 시간 세정 단계 동안 15 ㎖의 튜브에 에탄올 (25 %, 50 % 70 %)의 농도가 증가하여 PBS에서 해부 피부 탈수.
- 더 사용할 때까지 4 ° C에서 15 ML 튜브에 PBS에서 70 % 에탄올 탈수 피부를 저장합니다.
- 4시간 지우기 전에 실온에서 1 시간 세정 단계 동안 15 ml의 튜브에서 에탄올 (70 %, 50 %, 25 %, 0 %)의 농도가 감소함에 따라 PBS에서 피부 조직을 재수.
- 마우스 피부 조직 검사를 지우기
- 3.85 g의 요소와 3.85 g의 N, N, N을 용해하여 CUBIC1 클리어 솔루션을 준비 ', N'70 °의 C - (60)에 설정된 히터 증류수 5.38 ㎖ 중의은 - 테트라 (2- 히드 록시 프로필) 에틸렌 디아민. 뜨거운 교반기를 사용합니다.
- 이 분명하고, 실온으로 냉각 후, 용액에 2.31 g의 폴리에틸렌 글리콜 모노 메틸 -p- isooctylphenyl 에테르 / 트리톤 X-100을 추가한다.
- 대략적인 크기 0.2 × 0.5 cm의 생검에 날카로운 면도날와 마우스의 피부를 잘라, 그리고 15 ML 튜브에 CUBIC1 클리어 솔루션 5ml에 잠수함. 모낭의 시각화를 최적화하기 위해, 생검의 긴면이 샘플의 안테 - 후방 방향을 따라 절단되어 있는지 확인합니다.
- 37 ° C에서 하이브리드 오븐에서 회전하는 플랫폼에 배치합니다.
- 7 일 후 청산 솔루션을 변경합니다. 사용하기 전에 신선한 CUBIC1 솔루션을 준비합니다.
- 7 일 후 조직의 투명성을 확인합니다. 필요한 경우 조직이 완전히 투명해질 때까지, CUBIC1 청산 용액에 조직 검사를 둡니다.
- 피부 조직 검사가 투명하면,CUBIC1 솔루션을 제거하고 37 ℃에서 6 시간 동안 조직 4 번 씻어 1 × PBS의 4를 가하여.
- 37 ℃에서 4 시간 동안 15 ml의 관에서 PBS에 V 크로즈 / w 20 %의 피부 조직을 세척 하였다.
- -80 ° C 형 냉장고에 하룻밤 15 ML 튜브 매체 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물을 장착의 조직을 고정.
참고 :이 단계는 다음 단계에서 항체 침투를 위해 조직 검사의 투과성을 증가 할 것이다.
2. 면역 형광 염색법
- 3 시간 - 2 실온에 1.2.9에서 조직) 해동.
- 실온에서 8 시간 동안 PBS 5 ㎖로 15 ML 튜브에 세척 조직의 OCT 화합물을 제거합니다.
- 37 년 쉐이커에 3 일 PBST (PBS + 0.1 % 트리톤 - X100) 100 : 2 ML 튜브로 전송 생검, 모두 1 희석, 1 ml의 토끼 방지 Keratin14 또는 토끼 항 사료된다 항체의 조직을 품어 C 오븐 °.
- 15 ㎖의 관,로 전송 생검차 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 PBST 5ml에 6 시간 동안 조직을 4 회 반복한다.
- 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 삼일 PBST 100과 부화 : 2 ML 튜브로 전송 생검 1, 희석 차 항체 Alexa594 1 ml의 항 - 토끼를 추가합니다.
- 15 ML 튜브로 전송 생검, 그리고 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 PBST의 5 ㎖에서 6 시간 동안 조직을 4 회 반복한다.
- 2 ML 튜브로 전송 생검 추가, 1 ml의 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) 핵 Counterstain과 용액 (1 : 1,000) PBST와 37 ° C 오븐에 통에 밤새 품어.
- DAPI의 대조 염색 액을 제거하고 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 조직을 6 시간 동안 4 회 씻어 2 ML 튜브에 PBST 1 ㎖를 추가합니다.
참고 : 선택 단계 : 생검 최소 3 주 동안 0.02 %의 아 지드 화 나트륨과 1X PBS에서 어둠 속에서 저장 될 수있다.
3. 나일 레드 염색
- 1m의 최종 농도로 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에 나일 레드 분말을 용해g / ㎖
- 1 μg / ML의 최종 농도는 1 ㎖의 PBS로 1 μL 나일 적색 용액을 추가한다.
- 해동이 실온에 1.2.9에서 조직) - 3 시간 및 상온에서 8 시간 동안 5 ㎖ PBS로 세척한다.
- 2 ML 튜브에 조직 검사를 전송하고, 실온에서 2.5 시간 동안 1 ml의 나일 레드 염색 용액에 조직을 잠수함.
- 실온에서 30 분 동안 1 ml를 PBST로 4 회 2 ㎖의 튜브 피부 생검을 씻는다.
- 상기 2 ㎖의 튜브에서 PBST 용액을 제거 DAPI 핵으로 대조 용액 (1 : 1000) 1 ㎖를 추가 PBST로 실온에서 밤새 배양한다.
- DAPI의 대조 염색 액을 제거하고 실온에서 6 시간 동안 피부 조직을 4 회 씻어 2 ML 튜브에 PBST의 1ml를 추가합니다.
참고 : 선택 단계 : 생검 최소 3 주 동안 0.02 %의 아 지드 화 나트륨과 1X PBS에서 어둠 속에서 저장 될 수있다.
4. 이미지
- (50)를 포함하는 CUBIC2 클리어 솔루션을 준비% 슈 크로즈, 25 % (w / v)의 요소, 10 % (/ V w) (w / v)의 2,2 ', 2' '- nitrilotriethanol 및 0.1 % (v / v) 트리톤 X-100.
- 37 ° C의 오븐에서 24 시간 동안 진탕 기에서 2 ㎖의 튜브에 1 ㎖의 용액 CUBIC2 피부 조직을 인큐베이션. 이 단계에서는 조직의 굴절률을 고르게한다.
- 조직의 선명도를 확인합니다. 이 클리어되면, 유리 커버 슬립 상에 그 긴 변에 전체 피부 생검 (0.2 × 0.5 cm)에 위치, 모낭의 길이 방향이 커버 슬립의 표면에 평행 같은 것을 (# 1 24 X 60mm)
참고 : 선택 단계 : 항체 염색 생검은 약 7 일 동안 CUBIC2 용액에 저장 될 수있다. 나일 레드 염색 생검은 최대 1 일 동안 CUBIC2 솔루션에 저장 될 수 있으며, 가능한 한 빨리 군데해야합니다. - 영상 실을 준비합니다 (그림 1)
(F를, 파란색 압정 반죽 또는 유사한을 재생하고,이 된 커버 (24 × 50 ㎜) : 이미징 챔버의 제조에 필요한 소모품은 다음과 같습니다 참고igure의 1A).- 블루 압정의 두 개의 얇은 스트립 (직경 약 1mm × 2 ㎝)와 두 개의 커버 슬립 (그림 1B)를 준비합니다.
- 피부 생검 (그림 1C)를위한 충분한 공간을 허용 한 커버 슬립에 파란색 압정 스트립을 놓습니다. 4.4.3)
- CUBIC2 솔루션의 드롭 (그림 1C)의 커버 슬립에 스트립 사이에 피부 조직 검사를 놓습니다.
- 두 번째 커버 슬립 (그림 1D)와 피부 생검을 커버.
- 공 초점 현미경의 무대에 탑재 된 피부 조직 검사와 영상 챔버를 놓고 빛 경로로 조직을 이동합니다.
- 형광 염색 관심 지역을 식별하는 수은 또는 할로겐 광원 및 표준 표면 형광 필터 (예 DAPI / GFP / CY3 / CY5)를 이용하여 시료를 검사한다.
- (a 10X 및 20X 대물 렌즈 (NA 0.75) 및 표준 촛점 형광 이미징 기술을 사용하여 예를 들어., DA로 주목 화상 영역PI 염색 샘플은 405 nm의 레이저와 조명과 425 사이의 형광 신호 수집 - 475 nm의, 그리고 알렉사 플 루어 594 또는 나일 레드 묻은 시료와 561 nm의 레이저와 조명과 570 사이의 형광 신호 수집 -) 620 nm의.
- 현미경 Z 스택 화상 획득 소프트웨어를 이용하여 관심있는 각각의 영역의 영상 Z-스택을 생성한다 (예., 후술하는 바와 같이 소프트웨어 4.13 NIS 촬상 소자를 사용하여).
- 최적의 레이저 파워와 PMT HV를 확인 / 오프셋 설정은 샘플 형광을 수집하기 위해 선정되었다.
- "취득 제어"에서 "ND 취득"도구 모음을 엽니 다.
- (다른 모든 탭이 선택 해제되어 있는지 확인합니다) "Z 시리즈 설정"탭을 선택합니다.
- 라이브 스캔하는 동안, 샘플의 상단에 초점을 맞추고 "최고"버튼을 누릅니다.
- 샘플의 바닥에 집중하고 "바닥"버튼을 누릅니다.
- 입력 필수 단계 크기 (누르거나 최적화 된 스텝 크기 버튼).
- 사전SS 버튼 "지금 실행".
- 개별 티파니 이미지 스택과 같은 결과 Z-스택 (이미지 Z-스택 당 1 형광 색소)을 저장합니다.
- 3D 분석 소프트웨어를 사용하여 관심의 3 차원 볼륨 영역을 재구성 화상 Z-스택을 사용 (예., 후술 Imaris x64의 7.2.3를 사용하여).
- 분석 소프트웨어를 시작합니다.
- 선택 3D 볼륨 생성을위한 도구 모음에 버튼을 "능가".
- 열기 최초의 컬러 이미지 Z 스택 (예., DAPI).
- 추가 색상 채널, 형광 색소 당 하나의 채널을 추가하려면 '채널을 추가'도구를 사용합니다. 따라서 DAPI와 알렉사 플 루어 594 형광 색소를 모두 포함하는 샘플은 두 개의 채널이 필요합니다.
- 위의 4.7에서의 결정에 따라, (XYZ)을 올바른 픽셀 (복셀) 크기를 설정하려면 "이미지 속성"도구를 사용합니다.
- 필요에 따라 채널의 색상을 변경하려면 "디스플레이 조정"도구를 사용하여 (예를 들어, 파란색에 DAPI 채널을 설정 알렉사 플 루어 빨간색으로 594 채널).
- 포에이미지 창에서 3D 볼륨을 sition, 필요에 따라 클릭하고 드래그 볼륨으로 컴퓨터 마우스를 사용합니다.
- 3D 영상의 스크린 샷을 생성하기 위해 도구 모음에서 "스냅 샷"도구를 사용합니다.
- 3D 샘플 회전의 영화를 생성하는 도구 모음에서 "애니메이션"도구를 사용합니다.
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Representative Results
성인 야생형 마우스의 전체 두께 등의 피부 생검은 기저 각질 세포 마커 Keratin14 (K14)를 결합하는 항체로 염색, 명확하고, 핵은 DAPI 염색 용액 (그림 2, 영화 1)으로 대조 하였다.
DAPI 양성 핵 샘플 (도 2A, C)에 걸쳐 볼 수 있었고, K14 염색 배타적 interfollicular 표피의 하나의 셀 두께의 기초 층에 표시이고, 피지선 (검은 색 별표)의 외주 루트 칼집을 개략적 모낭은 모발 이차 세균 (도 2B, C)에서, 앞서 구 출판. K14 염색 강도는 interfollicular 표피 원위 모낭 및 보조 헤어 세균 (흰색 별표)에 높고, 그리고 모낭 (도 2c에 니어)의 팽창 영역에서 상대적으로 낮았다. 진피 유두 명확하게 visibl도했다DAPI 라벨을 통해 전자 (그림 2c에 화살표).
성인 야생형 마우스의 휴지기에 증식 세포, 전체 두께 등의 피부 조직 검사를 시각화하기는 명확하고 방지 사료된다 항체로 염색하고, 핵은 DAPI 용액 (그림 3, 영화 2)으로 대조하고 있었다.
증식하는 케 라티노 사이트는 표피의 기저 interfollicular (도 3c에 IFE)에서 검출하고, 협부의 모낭 아니라 팽창 영역 (도 3c에 니어)에 (도 3c의 경우) 하였다.
성인 야생형 마우스의 성장기에있는 피지선, 전체 두께 등의 피부 조직 검사를 시각화하기 위해 명확하고 sebocytes의 지방 함량 레이블 나일 레드로 염색하고, 핵은 DAPI 염색 용액 (그림 4, 영화 3)으로 대조하고 있었다. 나일 레드 양성 sebaceou의 분비는 CUBIC 프로토콜은 크게 다음 지방 함유 구조의 형태에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여 모낭 (그림 4C에서 SB)의 지협 지역에서 관찰되었다. 예기치 않게, 헤어 샤프트는 나일 레드 (그림 4C에서 HS)으로 표시 하였다.
기초 각질 8에서 활동적인 YAP 돌연변이 단백질을 발현 YAP2-5SA-ΔC 형질 전환 마우스의 표피의 형태 학적 변화를 시각화하기 위해, 성인 야생형 및 YAP2-5SA-ΔC 형질 전환 한배의 새끼 쥐의 전체 두께 등의 피부 생검은 명확하고 염색 하였다 안티 K14 항체 및 핵은 DAPI 용액 (도 5, 영화 4 (야생형)와 Movie 5 (YAP2-5SA-ΔC))과 대조시켰다.
그림 4 층에서 YAP2-5SA-ΔC 유전자 변형 피부에서, interfollicular 표피의 증식 (상단 이중 화살표 8 바와 같이 모낭은 이상이었고, 확대 된 줄기 세포 집단을 나타내는 비정상적인 모낭 (도 5F 낮은 이중 화살표)에서 근위 K14 표지 된 세포 덩어리를 표시.
그림 1 : 이미징 회의소의 준비. A : 블루 압정 (지름 약 2mm × 2 CM)의 두 개의 얇은 스트립을 준비하고 :. 이미징 챔버의 제조에 필요한 소모품 B 반죽 또는 유사한, 2 커버 슬립 (24 × 50 mm)를 재생, 블루 압정입니다 이 커버 슬립 C :. 피부 조직 검사를위한 충분한 공간을 허용 한 커버 슬립에 배치 블루 압정 스트립. . 두 스트립 사이 CUBIC2 용액 한 방울의 피부 조직 검사를 배치 D : 블루 압정 스트립에 장소 두 번째 coverslip에 피부 생검을 커버. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 성인 야생형 마우스의 텔로 겐의 등쪽 피부의 K14 / DAPI 라벨 보내고 K14 항체 (B 레드, C)로 표지 성인 야생형 마우스의 휴지기의 등쪽 피부 생검의 3D 볼륨 재구성 및 DAPI 핵 Counterstain과. (A, C 파란색). K14 염색 팽창에 interfollicular 표피 (IFE), 지협과 피지선 (블랙 별표) 및 차 머리 세균 (흰색 별표) 강한, 그리고 상대적으로 낮은 지역 (니어). 규모는 50 μm의 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. A의 (B, C 레드) 성인 야생형 마우스 사료된다 항체로 표지 성인 야생형 마우스의 등쪽 피부 생검의 3D 볼륨 복원이의 텔로 겐의 등쪽 피부의 사료된다 라벨링 및 DAPI 핵 Counterstain과 (파란색, C). 확산 사료된다 양성 각질 세포는 기초 interfollicular 표피 (IFE)에서 분명하고, 지협 지역 (IS)에서가 아니라 휴지기 모낭의 팽창 (니어)입니다. 규모는 50 μm의 바.rget = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 성인 야생형 마우스의 성장기에 등쪽 피부의 나일 레드 염색 나일 레드 (B 빨간색, C) 및 DAPI 핵 Counterstain과 (파란색으로 표시 성인 야생형 마우스의 성장기의 등쪽 피부 생검의 3D 볼륨 재구성. A, C). 나일 레드 염색은 sebocytes (SB)와 머리 샤프트 (HS)에 표시됩니다. 규모는 50 μm의 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림5 : 형태 학적 이상 유무 YAP2-5SA-ΔC 표피 성인 야생형 (A - C)의 등쪽 피부 생검의 3D 볼륨 복원 및 YAP2-5SA-ΔC 형질 전환 한배의 새끼 쥐 (D - F를)은 K14 항체로 표지 (빨간색입니다. B, A의 C, E, F), 및 DAPI 핵 Counterstain과 (블루, C, D, F). YAP2-5SA-ΔC 표피의 표피 증식은 근위 (F 낮은 이중 화살표) 8 특성 줄기 / 전구 세포 질량을 표시 interfollicular 표피와 모낭에 (F에서 최고 이중 화살표)에서 알 수있다. 규모는 50 μm의 바. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.
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Discussion
피부 개발 및 항상성 제어 규제기구는 가장 일반적으로 피부 형태학, 세포 집단 또는 단백질 발현의 제한된 하락 가능 항체와 조직 절편의 조직 학적 염색 또는 표지를 사용하여 2 차원으로 연구된다. 다수의 방법은 표피 전체 마운트 10-13의 3 차원 단일 세포 해상도 세포 단백질의 공간적 조직의 시각화를 개선하기 위해 개발되었다. 이들 중 일부는 특히 그러나 털이 피부를 사용하여 기술적 도전 진피에서 표피의 분리를 포함하고, 종종 모낭 조직 손상 및 파손을 초래한다. 또한, 배아 개발 및 조직의 항상성 동안 그들 사이에 발생하는 세포와 분자의 상호 작용을 연구 표피와 진피 손상의 분리.
'플랫 마운트 방식은'다른 방법입니다 전체 두께 마우스피부 절개 및 면역 염색, 면역 후 신호 (14)를 유지하면서 벤질 벤조 에이트 및 벤질 알콜 (BBBA)을 이용하여 정화된다. 이 방법은 진피, 표피의 기술적 도전 분리를 필요로하지 않는다. 그러나 BBBA는 일부 형광 단백질을 변성하고,이 조직에서의 세포 및 분자 작용을 조사하기 위해 필요한 샘플의 고해상도 영상화를 허용하지 현미경 목표 오염, 매우 독성이다.
이 보고서는 상대적으로 안전하고 저렴한 시약을 사용하여 임의의 원하는 해부학 적 영역과 연령에서 전체 두께 마우스 피부 조직 검사를 명확히하기 위해 CUBIC 프로토콜 5-7을 설명합니다. 이 기술적으로 간단한 프로토콜은 가능 단일 셀 해상도에서 입체적으로 DAPI으로 대조 전체 두께 피부 생검에서 면역에 의해 단백질 발현 및 확산 패턴의 시각화를 허용 전례와 QUAL 매우 정확itative 평가 및 단백질 발현, 증식, 조직 형태 및 모낭 크기의 정량화. 이 방법은 또한, 정화 과정 동안 조직 지질의 제거에도 불구 나일 레드 염색을 사용하여 시각화 sebocytes 적합하다. 이 방법의 중요한 한계는 효과적으로 결합이 피부 정화 공정을 이용하여 각각의 표적 단백질의 시각화를 허용 항체의 가용성이다. 또한, 상기 생성 된 이미지 및 동영상 파일은 크고, 이러한 강력한 프로세서 및 풍부한 데이터 저장 공간을 가진 컴퓨터와 같은 IT 좋은 자원은 필수적이다.
절차에서 중요한 단계는 피부 조직 검사의 준비입니다. 완전한 모낭 해부학 시각화 피부 생검의 배향은 고려되어야하고 생검의 길이는 모낭의 길이 방향과 평행하게 절단한다. 또한, 매우 얇은 소형 스키n은 조직 검사는 현미경에 대해 올바르게 장착하기가 어렵다. 큰 생검을 취소하는 데 시간이 더 필요하고, 항원 검출 유물의 결과 항체 침투 문제가 발생할 수 있습니다. 이 실험에 따라서 절단하는 것이 좋습니다 명확하고 얼룩 여러 조직 검사입니다.
단단히 반응물 농도의 변화를 초래 가열 공정 동안 내용물의 증발을 방지하는 CUBIC 용액을 준비하는 동안 튜브를 밀봉하고 손상된 조직 소거가 발생할 수에 또한 중요하다. 다음으로 중요한 단계는 조직 클리어링 프로세스를 가속화하기 위해 37 ° C에서 명확해질 것이라는 것이다. 7 일 후 상기 CUBIC1 용액 구를 대체 할 새로운 제조 할 필요가있을 것이다.
앞으로 더 많은 항체는 CUBIC 피부 정화 절차와 호환되는지 확인되며, 분석을 시각화하고 표피와 멜라닌 세포 (줄기) 세포 마커의 정량화에 확장 될 수있다s와 피부 단백질. 이 기술은 또한 진피 사이 신호의 상호 작용을 포함하여 돌연변이 생쥐와 유전자 변형 기자 마우스 모델의 피부에 이상이 정상 상피 세포 생물학을 기본 세포 및 분자 메커니즘의 해명에 피부 병리 해부학, 원조의 3D 연구에서 기본적인 역할을 담당 할 것 표피.
입방 프로토콜 5-7 다른 척추 동물 모델의 피부에 적용 할 수있을 것, 및 인간의 피부 생검 펀치이다. 광 시트 현미경 큰 피부 샘플 표피 해부학, 단백질 발현 패턴 및 모낭 사이클 단계의 진행의 시각화를 가능하게 할 것이다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 동물 실험과 지원을 위해 호주 생물 자원 (Garvan 연구소, 호주), 생물 자원 센터 (UNSW 호주)와 동물 관리 및 윤리위원회 감사합니다. 이 작품은 호주 국립 보건 의료 연구위원회 (프로젝트 그랜트 APP1062720)에 의해 지원되었다. 박사 세자르 P. 카날 레스는 CONICYT - Becas 칠레 장학금 (# 72101076)의받는 사람입니다. 씨 바셈 Akladios는 UNSW 호주로 대학 국제 대학원 상을받는 사람입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 - Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
- Fuchs, E.
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
