Summary
Denna rapport beskriver en kubisk protokoll för att klargöra hela tjocklek mus hudbiopsier och visualisera proteinuttrycksmönster, celler som förökar och sebocyter på en enda cell upplösning i 3D. Denna metod möjliggör noggrann bedömning av hud anatomi och patologi och onormala epidermal fenotyper i genetiskt modifierade möss linjer.
Abstract
Huden är avgörande för vår överlevnad. Det yttre epidermal lagret består av interfollikulära epidermis, vilket är ett stratifierat skivepitel som täcker större delen av vår kropp, och epidermala bihang såsom hårsäckar och svettkörtlar. Epidermis genomgår regenerering under hela livet och som svar på skada. Detta möjliggörs av K14-uttryck basala epidermala stamceller / progenitorceller populationer som tätt regleras av flera regleringsmekanismer verksamma inom epidermis och mellan epidermis och dermis. Den här artikeln beskriver en enkel metod för att klargöra hela tjocklek mus hudbiopsier och visualisera K14 proteinuttrycksmönster, Ki67 märkt förökande celler, Nile Red märkta sebocyter och DAPI nukleära märkning på en enda cell upplösning i 3D. Denna metod möjliggör noggrann bedömning och kvantifiering av hud anatomi och patologi och onormala epidermal fenotyper i genetiskt modifierade möss linjer. Den kubiska protokollet är the bästa metoden tillgänglig hittills för att undersöka molekylära och cellulära interaktioner i full tjocklek hudbiopsier vid en enda cell upplösning.
Introduction
Huden är avgörande för vår överlevnad. Den består av tre huvudskikt yttre epidermis, dermis och hypodermis. Epidermis är en mycket regenerativ vävnad. Det är en skivepitelcancer stratifierat epitel, bestående mestadels av keratinocyter. Keratinocyter föds i basalskiktet, och röra sig uppåt genom de suprabasala lagren medan differentierande, och så småningom de fälls i det yttre cornified skiktet ungefär en månad efter födseln. Epidermis utvecklar ett antal bihang inklusive hårsäckar och talgkörtlar. Hårsäckarna regenerera även i ett cykliskt sätt under hela livet en. Den regenerativa kapaciteten av epidermis är aktiverad genom närvaron av stam- och stamfaderceller som är belägna i basalskiktet av de interfollikulära epidermis och hårsäckar 2.
Många signalvägar har varit inblandade i epidermal utveckling och förnyelse. Några av dessa inträffar inomendast epidermis, såsom den Hedgehog pathway. Andra signal evenemang äger rum mellan dermis och epidermis 3. Till exempel, är Wnt-signaler från dermis tros vara viktigt för hår follikelutveckling, och de utsöndras av den dermala papillen vid inträde av anagen att aktivera hårsäcken bula stam / progenitor-cellproliferation och hårsäcken tillväxt 4. Det är viktigt att förstå de cellulära och molekylära mekanismer som styr epidermal utveckling och förnyelse för att bättre förstå hur de kan störas i regenerativ hudsjukdom som hudcancer.
Den här artikeln beskriver en C lear, U nobstructed B regn I maging cocktails och C omputational analys (CUBIC) protokoll 5-7 för att klargöra hela montera hudpreparat, och visualisera proteinuttrycksmönster i 3 dimensioner på en enda cell upplösning av konfokalmikroskopi. Den kubiska Metoden innebär nedsänkning av hudvävnad i två aminoalkohol-baserade kemiska cocktails. Dessa lösningar justera brytningsindex i provet huden och lämnar vävnaden transparent och proteinerna intakt, vilket gör att immundetektering vid en enda cell upplösning.
Med hjälp av denna CUBIC protokoll, den basala och prolifererande keratinocyter befolkningen i de interfollikulära epidermis och i hårsäcken avbildades i sin helhet tjocklek hudbiopsier av vildtyp möss med användning av anti-Keratin14 (K14) och anti-Ki67-antikroppar. Talgkörtlar i vildtyp hudbiopsier ades också visualiseras med Nile Red-färgning. Slutligen var de basala keratinocytceller befolkningen i vildtyp och hyperplastiska YAP2-5SA-AC hudbiopsier jämfört 8.
Detta CUBIC protokollet möjliggör visuell bedömning av proteinuttryck i full tjocklek hudbiopsier vid en enda cell upplösning, och är ett viktigt verktyg för att uppskatta epidermal anatomi och morfologiska defekter i huden av genetiskt modifierademöss, och att undersöka de cellulära och molekylära mekanismerna bakom epidermal utveckling och förnyelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: alla förfaranden som rör djurpatienter följer riktlinjerna i Animal Care och etikkommittén (ACEC) vid UNSW Australien enligt godkänd ACEC protokoll 13 / 64B.
1. Beredning av Transparent Mouse hudvävnad
Anmärkning: Alla möss som användes i denna studie var på en C57BL / 6 genetisk bakgrund
- Insamling av mus hudvävnad.
- Humant euthanize mössen genom cervikal dislokation.
- Försiktigt bort hår från den relevanta hudområdet med en trimmer noga med att inte såra huden.
- Tvätta huden att sanera med 70% etanol i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Lyft ryggnackskinnet med pincett och göra snitt med en sax.
- Dissekera ett stort område av dorsal mushud (approximativt 1,5 x 4 cm).
- Platta huden dermis och ner på ett filterpapper, och noterar den främre-bakre orientering av provet.
- trim filterpapper runt dissekeras huden, och placera i ett 15 ml rör fyllt med nyberedd 4% paraformaldehyd (PFA) lösning i PBS.
- Fix för en timme vid rumstemperatur, eller över natten i kylskåp vid 4 ° C.
- Tvätta huden 2 x 5 min i PBS i en 15 ml tub.
Obs: Följande (1.1.10 - 1.1.12) är valfria steg för långtidslagring av vävnad. - Dehydratisera dissekerade huden i PBS med ökande koncentration av etanol (25%, 50% 70%) i ett 15 ml rör under 1-timme tvättsteg vid rumstemperatur.
- Lagra uttorkad hud i 70% etanol i PBS i en 15 ml rör vid 4 ° C fram till vidare användning.
- 4 timmar före clearing, rehydrera hudvävnad i PBS med minskande koncentration av etanol (70%, 50%, 25%, 0%) i ett 15 ml rör under 1-timme tvättsteg vid rumstemperatur.
- Rensa biopsier mushud
- Förbered CUBIC1 clearinglösning genom att lösa 3,85 g urea och 3,85 g N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroxipropyl) etylendiamin i 5,38 ml destillerat vatten på en värmare inställd på 60-70 ° C. Använda en het omrörare.
- Lägg 2,31 g polyetylenglykol mono-p-isooctylphenyl eter / Triton X-100 till lösningen när den är klar och har svalnat till rumstemperatur.
- Skär mushud med en vass rakblad in i biopsier av ungefärliga dimensioner 0,2 x 0,5 cm, och dränka i 5 ml CUBIC1 clearing lösning i ett 15 ml rör. För att optimera visualisering av hårsäckar, se till att den längre sidan av biopsi skärs längs antero-posterior riktning av provet.
- Placera på en roterande plattform i en hybridiseringsugn vid 37 ° C.
- Ändra clearing lösning efter 7 dagar. Framställ färsk CUBIC1 lösning före användning.
- Kontrollera insynen i vävnaden efter 7 dagar. Om det är nödvändigt, lämna biopsier i CUBIC1 clearing lösning tills vävnaden är helt genomskinligt.
- När hudbiopsi är transparent,avlägsna CUBIC1 lösning och tillsätt 4 ml av en × PBS för att tvätta vävnaden 4 gånger under 6 h vid 37 ° C.
- Tvätta hudvävnaden i 20% vikt / volym sackaros i PBS i en 15 ml rör under 4 h vid 37 ° C.
- Frysa vävnaden i monteringsmedium Optimal Cutting Temperature (oktober) Förening i ett 15 ml rör över natt i en -80 ° C frys.
Obs: Detta steg kommer att öka biopsi permeabilitet för penetration antikropp i efterföljande steg.
2. Immunofluorescens färgning
- Tina vävnad från 1.2.9) till rumstemperatur under 2-3 h.
- Tvätt vävnad i 15 ml rör med 5 ml PBS för 8 timmar vid rumstemperatur för att avlägsna oktober Compound.
- Överförings biopsier till ett 2 ml rör, och inkubera vävnaden i 1 ml kanin-anti-Keratin14 eller kanin-anti-Ki67-antikropp, både utspädda 1: 100 i PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) under 3 dagar på en skakanordning i en 37 ° C ugn.
- Överförings biopsier till ett 15 ml rör, ennd tvätta vävnaden 4 gånger under 6 timmar i 5 ml PBST på en skak i en ugn vid 37 °.
- Överförings biopsier till ett 2 ml rör, tillsätt 1 ml anti-kanin Alexa594 sekundär antikropp utspädd 1: 100 i PBST och inkubera 3 dagar på en skakanordning i en ugn vid 37 °.
- Överförings biopsier till ett 15 ml rör, och tvätta vävnads 4 gånger under 6 timmar i 5 ml PBST på en skak i en ugn vid 37 °.
- Överförings biopsier till ett 2 ml rör, tillsätt 1 ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) nukleär motfärg-lösning (1: 1000) i PBST och inkubera över natten på en skakanordning i en ugn vid 37 °.
- Avlägsna DAPI motfärgning lösning och tillsätt 1 ml PBST till 2 ml rör för att tvätta vävnaden 4 gånger under 6 timmar på en skak i en ugn vid 37 °.
Notera: Valfritt steg: Biopsier kan lagras i mörker i 1 x PBS med 0,02% natriumazid i minst 3 veckor.
3. Nile Red Färgning
- Lös upp Nile Red pulver i dimetylsulfoxid (DMSO) till en slutlig koncentration av 1 mg / ml
- Lägg ett pl Nile Red-lösningen till 1 ml PBS till en slutlig koncentration av 1 pg / ml.
- Tö vävnad från 1.2.9) till rumstemperatur under 2-3 h, och tvätta med 5 ml PBS under 8 timmar vid rumstemperatur.
- Överföra biopsier till ett 2 ml rör, och dränka vävnad i en ml Nile Red färgningslösning under 2,5 h vid rumstemperatur.
- Tvätta hudbiopsier i 2 ml rör med 1 ml PBST 4 gånger under 30 min vid rumstemperatur.
- Ta bort PBST-lösning från 2 ml rör, tillsätt 1 ml DAPI nukleär motfärgning lösning (1: 1000) i PBST och inkubera över natten vid rumstemperatur.
- Avlägsna DAPI motfärgning lösning, och tillsätt 1 ml PBST i 2 ml rör för att tvätta hudvävnaden 4 gånger under 6 h vid rumstemperatur.
Notera: Valfritt steg: Biopsier kan lagras i mörker i 1 x PBS med 0,02% natriumazid i minst 3 veckor.
4. Imaging
- Förbered CUBIC2 clearinglösning, som innehåller 50% (Vikt / volym) sackaros, 25% (vikt / volym) urea, 10% (vikt / volym) 2,2 ', 2' '- nitrilotriethanol, och 0,1% (volym / volym) Triton X-100.
- Inkubera hudvävnaden i 1 ml CUBIC2 lösning i en 2 ml rör på en skakanordning under 24 h i en ugn 37 ° C. Detta steg kommer att jämna brytningsindex av vävnaden.
- Kontrollera klarheten av vävnaden. När det är klart, placera hela hudbiopsi (0,2 x 0,5 cm) på dess längre sida på en glastäckglas, så att riktningen av längden av hårsäckarna är parallell med täckglas ytan (# 1 24 x 60 mm)
Obs: Valfritt steg: Antikropps färgade biopsier kan lagras i CUBIC2 lösning under ca 7 dagar. Nile Red-färgade biopsier kan endast lagras i CUBIC2 lösning för upp till en dag, och bör avbildas så snart som möjligt. - Förbered avbildning kammare (Figur 1)
Notera: förbrukningsmateriel som krävs för framställning av avbildningskammaren är: blå klibb, spela deg eller liknande, och 2 täckglas (24 x 50 mm) (Figure 1A).- Förbered två tunna remsor av blått klibb (diameter ca 1 mm x 2 cm), och två täckglas (Figur 1B).
- Placera blå please remsor på ett täckglas, vilket gör att tillräckligt med utrymme för hudbiopsi (Figur 1C). 4.4.3)
- Placera hudbiopsi mellan remsorna på täckglas i en droppe CUBIC2 lösning (Figur 1C).
- Täck hudbiopsi med den andra täck (figur 1D).
- Placera avbildning kammare med den monterade hudbiopsi på scenen av ett konfokalt mikroskop och flytta vävnad in i ljusvägen.
- Skanna provet med en kvicksilver eller halogen ljuskälla och standard epifluorescence filter (t.ex. DAPI / GFP / CY3 / CY5) för att identifiera fluorescerande färgade områden av intresse.
- Bild områden av intresse med hjälp av en 10X och 20X mål (NA 0,75) och standard konfokal fluorescensavbildningstekniker (t ex., Med DAPI färgade prover lysa med en 405 nm laser och samla fluorescenssignalen mellan 425-475 nm, och med Alexa Fluor 594 eller Nile Red-färgade prover lysa med en 561 nm laser och samla fluorescenssignalen mellan 570-620 nm).
- Generera bilden Z-stackar av varje område av intresse med hjälp av mikroskop Z-stack bild förvärv programvara (eg., Med hjälp av NIS element bildbehandlingsprogram 4,13 som beskrivs nedan).
- Säkerställer optimal lasereffekt och PMT HV / Offset inställningarna har valts ut för att samla prov fluorescens.
- Öppna "ND Acquisition" verktygsfält från "Förvärvs Controls".
- Välj "Z-serien Setup" fliken (se till att alla andra flikar är omarkerade).
- Medan levande scanning, fokus till toppen av provet och tryck på "Top" -knappen.
- Fokus till botten av provet och tryck på "Bottom" -knappen.
- Ingång krävs steg storlek (eller tryck optimerad steg storleksknapp).
- press den "Kör nu" -knappen.
- Spara resulterande Z-stackar som enskilda TIFF bildstaplar (1 fluorokrom per bild Z-stack).
- Använd bild Z-stackar att rekonstruera 3D volym områden av intresse med hjälp av 3D-analysmjukvara (eg., Med hjälp av Imaris x64 7.2.3 som beskrivs nedan).
- Starta analysprogram.
- Välj "Surpass" -knappen i verktygsfältet för 3D-volymen generation.
- (DAPI eg.,). Öppna först färgbild Z-stack
- Använd "Lägg till kanal" verktyg för att lägga till ytterligare färgkanaler, en kanal per fluorokrom. Således ett prov innehållande både DAPI och Alexa Fluor 594 fluorokromer kräver två kanaler.
- Använd "Bildegenskaper" verktyg för att ställa in rätt pixel (voxel) dimensioner (XYZ), som bestämdes i 4,7 ovan.
- Använd "Display Justering" verktyg för att ändra kanal färger som behövs (t.ex. ställer DAPI kanal till blå, Alexa Fluor 594 kanal till rött).
- till posättningen 3D-volymen i bildfönstret, använder datorn musen för att klicka och dra volym som krävs.
- Använd "Snapshot" i verktygsfältet för att skapa skärmdumpar av 3D-bilden.
- Använd "Animation" i verktygsfältet för att skapa filmer av 3D-prov rotation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Full tjocklek rygg hudbiopsier av vuxna vildtyp möss klar, färgades med en antikropp som binder basala keratinocyter markör Keratin14 (K14), och kärnor motfärgades med DAPI färgning lösning (Figur 2 och Movie 1).
DAPI-positiva kärnor var synlig i hela provet (Figur 2A, C), och K14 färgning var synlig endast i en cell tjockt basalskiktet av interfollikulära epidermis, och beskriver de talgkörtlar (svarta asterisker), de yttre rot höljen hårsäckar, och i de sekundära hår bakterier (Figur 2B, C), som tidigare publicerats 9. K14 färgningsintensitet var hög i interfollikulära epidermis, den distala hårsäcken och de sekundära hår bakterier (vita asterisker), och det var relativt låg i utbuktningen området i hårsäcken (Bu i figur 2C). Den dermala papiller var också tydligt visible genom DAPI märkning (pil i figur 2C).
Att visualisera prolifererande celler, full tjocklek dorsala hudbiopsier i telogen av vuxna vildtyp möss förtydligats och färgades med en anti-Ki67-antikropp, och kärnor motfärgades med DAPI-lösning (Figur 3, och Movie 2).
Prolifererande keratinocyter detekterades i de basala interfollikulära epidermis (IFE i figur 3C), och i isthmus (Är i figur 3C) i hårsäckarna, men inte i utbuktningen regionen (Bu i figur 3C).
Att visualisera talgkörtlar, full tjocklek dorsala hudbiopsier i anagen av vuxna vildtyp möss förtydligats och färgades med Nile Red som märker fetthalten i sebocyter och kärnor motfärgades med DAPI-färgning lösning (Figur 4 och Movie 3). Nile Red-positiva sebaceous körtlar observerades i näset regionen hårsäckarna (SB i figur 4C), vilket visar att CUBIC protokollet inte signifikant påverkar morfologin av dessa fettinnehållande strukturer. Oväntat var hårstråna också märkt med Nile Red (HS i figur 4C).
Att visualisera morfologiska förändringar i epidermis hos YAP2-5SA-AC transgena möss som uttrycker en hyperaktiv YAP mutantprotein i basala keratinocyter 8, var fulla tjocklek dorsala hudbiopsier av vuxna vildtyp och YAP2-5SA-AC transgena kull möss förtydligats och färgades med anti-K14-antikropp, och kärnor motfärgades med DAPI-lösning (Figur 5, och Movie 4 (vildtyp) och Film 5 (YAP2-5SA-AC)).
I YAP2-5SA-AC transgen hud, hyperplasi av interfollikulära epidermis (övre dubbla pilar i figur 4F figur 5F), som representerar de förstorade stamcellspopulationer, som tidigare beskrivits 8.
Figur 1: Beredning av Imaging avdelningen. A: förbrukningsmateriel som krävs för framställning av avbildning kammaren är blå hals, spela deg eller liknande, och 2 täck (24 x 50 mm) B:. Förbereda två tunna remsor av blå please (diameter ca 2 mm x 2 cm), och två täck C:. Placera blå please remsor på ett täckglas, vilket gör tillräckligt med utrymme för hudbiopsi. Placera hudbiopsi i en droppe CUBIC2 lösning mellan de två remsorna D:. Placera andra täck på blå please remsor för att täcka hudbiopsi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: K14 / DAPI Label ing av rygghuden i telogen av vuxna vildtyp möss 3D-volymen rekonstruktion av en rygg hudbiopsi i telogen av en vuxen vildtyp mus märkt med en K14-antikropp (röd i B, C), och DAPI nukleära motfärg. (blå i A, C). K14 färgningen är stark i interfollikulära epidermis (IFE), näset och talgkörtlar (svarta asterisker) och de sekundära hår bakterier (vit asterisk), och relativt låg i utbuktningen område (Bu). Skalstrecken 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Ki67 Märkning av rygghuden i telogen av Adult Vildtyps möss 3D volym rekonstruktioner av en rygg hudbiopsi av en vuxen vildtyp mus märkt med en Ki67 antikropp (röd i B, C), och DAPI nukleära motfärg (blå i A, C). Prolifererande Ki67-positiva keratinocyter är uppenbara i de basala interfollikulära epidermis (IFE), och i isthmus regionen (Is), men inte i utbuktningen (Bu) av telogen hårsäcken. Skalstrecken 50 | im.rFå = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Nile Red Färgning av rygghuden i Anagen av vuxna vildtyp möss 3D-volymen rekonstruktion av en rygg hudbiopsi i anagen av en vuxen vildtyp mus märkt med Nile Red (röd i B, C), och DAPI nukleära motfärg (blå i. A, C). Nile Red färgning syns i sebocyter (SB) och i hårstrået (HS). Skalstrecken 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur5: morfologiska abnormaliteter i YAP2-5SA-AC Epidermis 3D volym rekonstruktioner av rygg hudbiopsier av vuxna vildtyp (A - C) och YAP2-5SA-AC transgena kull möss (D - F) märkta med en K14-antikropp (röd. B, C, E, F), och DAPI nukleär motfärg (blå i A, C, D, F). Den epidermal hyperplasi av YAP2-5SA-AC epidermis framgår i interfollikulära epidermis (övre dubbla pilar i F) och i hårsäckarna, som uppvisar de karakteristiska stam / progenitorceller massor proximalt (lägre dubbla pilar i F) 8. Skalstrecken 50 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Film 1. Klicka här för att ladda ned den här filmen.
Film 2. Klicka här för att ladda ned den här filmen.
Film 3. Klicka här för att ladda ned den här filmen.
01movie4.jpg "/>
Movie 4. Klicka här för att ladda ned den här filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De regulatoriska mekanismer som styr huden utveckling och homeostas oftast studeras i 2D med hjälp av vävnadssnittning och histologisk färgning eller märkning med antikroppar, vilket möjliggör endast en begränsad förståelse för hud morfologi, cellpopulationer eller proteinuttryck. Ett antal metoder har utvecklats för att förbättra visualiseringen av det rumsliga organisering av celler och proteiner vid enstaka cell upplösning i 3 dimensioner i epidermala hela monteringar 10-13. Några av dessa innebär dock separation av epidermis från dermis, som är tekniskt utmanande särskilt med hjälp hårig hud, och resulterar ofta i vävnadsskada och bristning av hårsäckarna. Även separation av epidermis och dermis försämrar studerar de cellulära och molekylära interaktioner som sker mellan dem under embryonal utveckling och vävnad homeostas.
Den fasta mount metoden "är en annan metod där full tjocklek mushud dissekeras och immun och sedan klar hjälp av bensylbensoat och bensylalkohol (BBBA) samtidigt immunofluorescerande signaler 14. Denna metod kräver inte tekniskt utmanande separation av epidermis från dermis. Dock är BBBA mycket giftigt, det denaturerar några fluorescerande proteiner, och det kontaminerar mikroskop mål, inte gör det möjligt att med hög upplösning avbildning av prov som behövs för att undersöka cellulära och molekylära interaktioner i vävnaden.
Denna rapport beskriver en kubisk protokoll 5-7 för att klargöra hela tjocklek mus hudbiopsier från någon önskad anatomiska regionen och ålder med hjälp av relativt säkra och billiga reagens. Detta är tekniskt enkelt protokoll möjliggör visualisering av proteinuttryck och spridningsmönster genom immunofluorescens i full tjocklek hudbiopsier motfärgades med DAPI i tre dimensioner på en enda cell upplösning, vilket möjliggör oöverträffad och mycket noggrann kvalitative bedömning och kvantifiering av proteinuttryck, spridning, vävnad morfologi och hårsäcken dimensioner. Denna metod är också lämplig för visualisering av sebocyter använder Nile Red färgning trots avlägsnande av vävnadslipider under förtydligande förfarande. En viktig begränsning med denna metod är tillgängligheten av antikroppar effektivt bindande och möjliggör visualisering av deras respektive målproteiner med hjälp av denna hud klarningsprocess. Dessutom genererade bild och filmer filerna är stora och goda IT-resurser såsom datorer med kraftfulla processorer och gott datalagringsutrymme är viktigt.
Ett kritiskt steg i proceduren är framställningen av biopsier huden. Att visualisera intakt hårsäcken anatomi, bör tas orienteringen av hudbiopsi med i beräkningen, och längden av de biopsier bör klippas parallellt med riktningen av längden av hårsäckarna. Dessutom små och mycket tunna skidorn biopsier är svåra att montera på rätt sätt för mikroskopi. Större biopsier kommer att kräva mer tid att rensa och kan medföra antikroppspenetrations problem som uppstår i antigendetektions artefakter. Det är därför lämpligt att skära, klar och fläck flera biopsier per experiment.
Det är också viktigt att tätt täta rören medan du förbereder den kubiska lösningar för att förhindra avdunstning av innehållet under uppvärmningsprocessen, vilket resulterar i förändringar i reagenskoncentrationer och kan orsaka försämrad vävnads clearing. Nästa viktiga steg är att vävnaden kommer att klargöras vid 37 ° C för att påskynda clearingprocessen. Efter 7 dagar, kommer CUBIC1 lösning måste beredas på nytt för att ersätta den gamla.
I framtiden kommer fler antikroppar identifieras som är kompatibla med CUBIC huden klargörande förfarande och analyser kan utökas till att visualisera och kvantifiera epidermal och melanocyter (stam) cellmarkörs och dermala proteiner. Denna teknik kommer också att spela en viktig roll i 3D studier av hudpatologin och anatomi, och stöd i belysning av cellulära och molekylära mekanismerna bakom onormal och normal epidermal biologi i huden hos muterade möss och transgena modeller reporter mus, inklusive signalsystem interaktioner mellan dermis och epidermis.
Den kubiska protokoll 5-7 kommer sannolikt att vara tillämplig på huden hos andra ryggradsdjur djurmodeller och mänskliga huden punsch biopsier. Ljus ark mikroskopi möjliggör visualisering av epidermal anatomi, proteinuttrycksmönster, och utvecklingen av hårsäcken cykelsteg i större hudprover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Australian Bio-resurser (Garvan Institute, Australien), biologiska Resources Centre (UNSW Australien) och Animal Care & etikkommitté för stöd med djurförsök. Detta arbete stöddes av National Health och Medical Research Council of Australia (Project Grant APP1062720). Dr. Cesar P. Canales är mottagare av en CONICYT-Becas Chile stipendium (# 72.101.076). Mr Bassem Akladios är en mottagare av University International Forskarutbildning Award av UNSW Australien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 - Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
- Fuchs, E.
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
