Summary
Bu rapor tam kalınlıkta fare deri biyopsi açıklık ve 3D tek hücre çözünürlükte protein ekspresyonu, çoğalan hücreleri ve Sebositler görselleştirmek için bir KÜBİK protokol tanımlamaktadır. Bu yöntem cilt anatomi ve patoloji doğru değerlendirilmesini sağlar ve genetiği değiştirilmiş fare hatları anormal epidermal fenotipleri.
Abstract
Cildimiz yaşam için esastır. Dış epidermal tabaka, saç folikülleri ve ter bezleri gibi vücudumuzda ve epidermal uzantıları en kapsayan bir çok katlı yassı epitel olan interfolliküler epidermis oluşur. Epidermis ömrü boyunca ve yaralanmaya yanıt olarak rejenerasyon uğrar. Bu sıkı epidermis içinde ve epidermis ve dermis arasındaki birden çok etkin düzenleyici mekanizmalar tarafından düzenlenir bazal epidermal kök / progenitör hücre popülasyonlarının K14-ifade ederek etkindir. Bu makale tam kalınlıkta fare deri biyopsi açıklık ve K14 protein ekspresyonu görselleştirmek için basit bir yöntem açıklanır, Ki67 hücrelerin hızla çoğalan etiketli, Nil Kırmızı Sebositler etiketli ve 3D tek hücre çözünürlükte DAPI nükleer etiketleme. Bu yöntem, doğru bir değerlendirme ve cilt anatomi ve patoloji ölçümü ve genetiği değiştirilmiş fare hatları anormal epidermal fenotipleri sağlar. KÜBİK protokol thtek bir hücre çözünürlükte tam kalınlıkta deri biyopsilerinde moleküler ve hücresel etkileşimleri araştırmak için bugüne kadar mevcut e en iyi yöntem.
Introduction
Cildimiz yaşam için esastır. Bu üç ana tabaka, dış epidermis, dermiş ve deri altı oluşur. epidermis oldukça rejeneratif dokudur. Çoğunlukla keratinositlerde oluşan bir skuamöz tabakalı epitel olduğunu. Keratinositler bazal tabakada doğmuş ve ayırt ederken bazal üstü katmanları üzerinden yukarı doğru hareket, ve sonunda onların doğumdan sonra yaklaşık bir ay dış boynuzlaşan katmanda dökülür vardır. Epidermis, saç foliküllerinin ve yağ bezleri içeren uzantıları bir dizi geliştirir. Saç köklerinin de hayat 1 boyunca döngüsel bir şekilde yeniden. Epidermisin rejeneratif kapasitesinin interfolliküler epidermis ve saç folikülü 2 bazal tabakasında bulunan kök ve projenitör hücrelerinin varlığı ile sağlanır.
Birçok sinyalleme hatları, epidermal gelişim ve yenilenme implike edilmiştir. Bunlardan bazıları içinde meydanaörneğin kirpi yolunun sadece epidermis. Diğer sinyal olayları dermis ve epidermis 3 arasında gerçekleşecek. Örneğin, dermis Wnt sinyal saç folikülü gelişimi için önemli olduğu düşünülmektedir ve bunlar etkinleştirmek için anajen başlangıcında dermal papilla tarafından salgılanan saç folikülü çıkıntı kök / progenitör hücre çoğalması ve saç folikülü büyüme 4.. Daha iyi böyle cilt kanseri gibi rejeneratif cilt hastalığında tedirgin olabilir nasıl anlamak için epidermal gelişim ve yenilenme kontrol hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak önemlidir.
Bu makalede, bir C uzuv açıklanır U tüm montaj cilt hazırlıklarını açıklık ve konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte 3 boyutlu protein ekspresyonu görselleştirmek için B yağmur ben maging kokteyller ve C omputational analiz (CUBIC) protokolünü 5-7 nobstructed. Kübik yöntemi cilt daldırma içerirİki aminoalkol bazlı kimyasal kokteyller doku. Bu çözümler tek bir hücre çözünürlükte immunodeteksiyon izin şeffaf ve proteinler sağlam dokuyu bırakarak, cilt numunede kırılma indeksleri ayarlayın.
interfolliküler epidermis ve saç folikülü keratinosit popülasyonları Böylece kübik protokolü, bazal kullanarak ve prolifere olan, anti-Keratin14 (K14) ve anti-Ki 67 antikorları kullanılarak vahşi tip farelerde tam kalınlıkta deri biyopsi görüntülenmiştir. wild tip cilt biyopsilerinde yağ bezleri de Nil Kırmızı boyama kullanılarak görüntülendi. Son olarak, vahşi tip ve hiperplastik YAP2-5SA-ΔC cilt biyopsilerinde bazal keratinosit popülasyonları 8 karşılaştırıldı.
Bu KÜBİK protokol tek hücre çözünürlükte tam kalınlıkta deri biyopsi protein ifadesinin görsel değerlendirmesini sağlar ve genetiği değiştirilmiş deride epidermal anatomi ve morfolojik kusurları takdir önemli bir araçtırfareler ve epidermal geliştirme ve yenilenme altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: Hayvan denekleri Tüm prosedürler onaylı ACEC protokolü 13 / 64B altında UNSW Avustralya'da Hayvan Bakım ve Etik Komitesi (ACEC) yönergeleri izleyin.
Şeffaf Fare Cilt Doku 1. Hazırlık
Not: Bu çalışmada kullanılan tüm fareler, bir C57BL / 6 genetik geçmişi vardı
- Fare cilt dokusunun toplanması.
- Insanca servikal dislokasyon ile fareler euthanize.
- Dikkatle cildi yara değil düzeltici alarak özenle ilgili cilt alanından tüyleri.
- Yıkayın fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 70 etanol ile dezenfekte edilmesi için.
- forseps ile dorsal boyun cildi kaldırın ve makas ile kesi yapmak.
- Dorsal sıçan derisine (yaklaşık 1.5 x 4 cm) büyük bir alanını parçalara ayır.
- Bir filtre kağıdı üzerinde deri dermis tarafı aşağı düzleştirmek ve numunenin ön-arka yönde not edin.
- triPBS içinde taze hazırlanmış% 4'lük paraformaldehit (PFA) çözeltisi ile doldurulmuş bir 15 ml tüp içinde m filtresi parçalara deri çevresinde kağıt ve bir yer.
- 4 ° C sıcaklıkta buzdolabında bir gece boyunca oda sıcaklığında, 1 saat boyunca saptamak veya.
- 15 ml'lik bir tüp içinde, PBS içinde yıkayın 2 x 5 dak.
Not: aşağıdaki (1.1.10 - 1.1.12) doku uzun süreli depolama için isteğe bağlı adımlardır. - Oda sıcaklığında 1 saatlik yıkama adımları sırasında 15 ml tüp içinde etanol (% 25,% 50% 70) artan konsantrasyonu ile PBS içinde parçalara cilt kurutmak.
- sonraki kullanıma kadar 4 ° C sıcaklıkta 15 ml'lik bir tüp içinde, PBS içinde% 70 etanol içinde dehidre edilmiş deri saklayın.
- 4 saat temizlemeden önce oda sıcaklığında 1 saatlik yıkama adımları sırasında 15 ml tüp içinde etanol (% 70,% 50,% 25,% 0) konsantrasyonu ise PBS içinde deri dokusu rehidrate.
- Fare cilt biyopsileri Takas
- 3.85 gr üre ve 3.85 g N, N, N çözülmesiyle CUBIC1 temizleme çözeltisi hazırlayın, N '70 ° C - 60 ayarlanmış bir ısıtıcı üzerinde damıtılmış su 5.38 ml -tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiamin karışımları bulunur. Sıcak bir karıştırıcı kullanın.
- açık ve oda sıcaklığına kadar soğuduktan sonra çözeltiye 2.31 g polietilen glikol mono-p-isooctylphenyl eter / Triton X-100 ilave edin.
- yaklaşık boyutları 0.2 x 0.5 cm biyopsi bir jiletle farenin deri kesin ve 15 ml'lik bir tüp içinde CUBIC1 temizleme çözeltisi 5 ml daldırın. saç köklerinin görselleştirme optimize etmek için, biyopsi uzun kenarı örneğinin anteroposterior yönde kesilir emin olun.
- 37 ° C 'de, bir hibridizasyon etüvü içinde dönen bir platform üzerine yerleştirin.
- 7 gün sonra takas çözümü değiştirin. kullanımdan önce taze CUBIC1 çözeltisi hazırlayın.
- 7 gün sonra doku şeffaflık kontrol edin. Gerekirse doku tamamen şeffaf kadar CUBIC1 takas çözeltide biyopsi bırakın.
- deri biyopsisi şeffaf sonra,CUBIC1 çözeltisini çıkarın ve bunu, 37 ° C'de 6 saat için doku 4 kez yıkayın 1 x PBS 4 ml.
- 37 ° C'de 4 saat süreyle, 15 ml bir tüp içinde, PBS içinde hacim sükroz / ağ% 20 cilt dokusunun yıkayın.
- -80 ° C dondurucu içinde bir gece boyunca 15 ml'lik bir tüp içinde, orta optimal kesme ısısı (OCT), Bileşik montaj doku dondurun.
Not: Bu adım sonraki adımlarda antikor penetrasyon için biyopsisi en geçirgenliğini artırır.
2. İmmünofloresan Boyama
- 3 saat - 2, oda sıcaklığına kadar 1.2.9 doku) çözülme.
- Oda sıcaklığında 8 saat boyunca 5 ml PBS, 15 ml bir tüp içinde yıkayın dokusu OCT bileşiği kaldırın.
- 37 bir karıştırıcı üzerinde, 3 gün boyunca PBST (PBS +% 0.1 Triton-X100): 100 2 ml tüp aktarın biyopsileri, ve her ikisi de 1 seyreltilmiş 1 ml tavşan anti-Keratin14 ya tavşan anti-Ki 67 antikoru doku inkübe C fırında °.
- 15 ml tüp, transfer biyopsileriND 37 ° C fırın içinde bir çalkalayıcı üzerinde PBST 5 ml 6 saat için doku 4 kez yıkayın.
- 37 ° C fırın içinde bir karıştırıcı üzerinde 3 gün PBST içinde 100 ile inkübe: 2 ml tüp aktarın biyopsileri, 1 seyreltilmiş sekonder antikor Alexa594 1 ml anti-tavşan ekleyin.
- 15 ml tüp aktarın biyopsileri ve 37 ° C fırın içinde bir çalkalayıcı üzerinde PBST 5 ml 6 saat boyunca doku 4 kez yıkayın.
- 2 ml tüp aktarın biyopsileri, ilave 1 mL 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) Nükleer karşıt-çözeltisi (1: 1000) PBST içinde ve 37 ° C fırın içinde bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca inkübe edilir.
- DAPI counterstaining çözeltisini çıkarın ve 37 ° C fırın içinde bir çalkalama Doku 6 saat 4 kez yıkayın 2 ml tüp PBST 1 ml.
Not: İsteğe bağlı adım: biyopsiler, en az 3 hafta boyunca% 0.02 sodyum azid ile 1x PBS içinde karanlıkta saklanabilir.
3. Nil Kırmızı Boyama
- 1 m'lik bir nihai konsantrasyona kadar dimetilsülfoksit (DMSO) Nile Red tozu çözmekug / ml
- 1 ug / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar, 1 ml PBS 1 ul Nile Red solüsyonu eklenir.
- Çözülme 2 boyunca oda sıcaklığına 1.2.9 doku) - 3 saat ve oda sıcaklığında 8 saat süre ile 5 ml PBS ile yıkayın.
- 2 ml tüp biyopsiler aktarın ve oda sıcaklığında 2.5 saat süre ile, 1 ml Nile Red boyama çözeltisi doku daldırın.
- Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle 1 ml PBST ile 4 kez 2 ml tüp içinde deri biyopsileri yıkayın.
- , 2 mi tüpten PBST solüsyonu kaldırma DAPI çekirdek counterstaining çözeltisi (1: 1000) 1 ml ilave PBST içinde ve oda sıcaklığında, gece boyunca inkübe edilir.
- DAPI counterstaining çözeltisini çıkarın ve oda sıcaklığında 6 saat süre ile deri dokusu 4 kez yıkayın 2 ml tüp içinde PBST 1ml ekleyin.
Not: İsteğe bağlı adım: biyopsiler, en az 3 hafta boyunca% 0.02 sodyum azid ile 1x PBS içinde karanlıkta saklanabilir.
4. Görüntüleme
- 50 içeren CUBIC2 temizleme solüsyonu, hazırlayın% Sukroz,% 25 (ağırlık / hacim) üre,% 10 (ağ / hac) (ağ / hac) 2,2 ', 2' '- nitrilotriethanol ve% 0.1 (h / h) Triton X-100.
- 37 ° C bir fırında 24 saat süre ile bir çalkalama 2 ml'lik bir tüp içinde 1 mi CUBIC2 çözelti içinde deri dokusu inkübe edin. Bu adım dokusunun kırılma indeksi eşitlemek olacaktır.
- doku netlik kontrol edin. açıktır sonra, bir cam lamel üzerine onun daha uzun tarafında tüm deri biyopsisi (0.2 x 0.5 cm) yerleştirin saç köklerinin uzunluğu yönü lamel yüzeyine paralel böyle olduğunu (1. 24 x 60 mm)
Not: İsteğe bağlı adım: antikor lekeli biyopsiler yaklaşık 7 gün CUBIC2 çözelti içinde saklanabilir. Nil kırmızısı boyanmış biyopsiler olduğunda, en fazla 1 gün için CUBIC2 çözelti içinde saklanabilir ve kısa sürede görüntülü olmalıdır. - Görüntüleme odası hazırlayın (Şekil 1)
(F, mavi tack hamur veya benzeri oynamak, ve 2 lamelleri (24 x 50 mm): görüntüleme odasının hazırlanması için gerekli Sarf şunlardır: NotŞEKIL 1 A).- Mavi yapışma iki ince şeritler (çap yaklaşık 1 mm x 2 cm), ve iki lamelleri (Şekil 1B) hazırlayın.
- Cilt biyopsisi (Şekil 1C) için yeterli alan sağlayan bir kapak kayma mavi tack şeritler yerleştirin. 4.4.3)
- CUBIC2 çözeltisinin bir damlası (Şekil 1c) lamel şeritler arasındaki deri biyopsisi yerleştirin.
- İkinci lamel (Şekil 1D) ile deri biyopsisi örtün.
- konfokal mikroskop aşamasında üzerine monte deri biyopsisi ile görüntüleme odasına yerleştirin ve hafif yolun içine doku taşıyın.
- Ilgi floresan lekeli bölgeleri tanımlamak için bir cıva veya halojen ışık kaynağına ve standart Epifloresans filtreleri (örneğin, DAPI / GFP / CY3 / CY5) kullanarak örnek tarayın.
- (10X ve 20X objektif (NA 0.75) ve standart konfokal floresan görüntüleme teknikleri kullanılarak, örneğin., DA ile ilgi görüntü bölgeleriPI lekeli örnekleri 405 nm lazer ile aydınlatmak ve 425 arasındaki floresan sinyali toplamak - 475 nm ve Alexa Fluor 594 veya Nil Kırmızı lekeli örnekleri ile bir 561 nm lazer ile aydınlatmak ve 570 arasındaki floresan sinyali toplamak -) 620 nm.
- Mikroskop Z-yığın görüntü elde etme yazılımı kullanarak ilgi her bölgenin görüntü Z-yığınlarının oluşturun (örneğin., Aşağıda tarif edildiği gibi yazılım 4.13 görüntüleme NIS elemanları kullanılarak).
- en uygun lazer gücü ve PMT HV sağlamak / Ofset ayarlar örnek floresan toplamak için seçilmiştir.
- "Toplama Controls" dan "ND Toplama" araç çubuğunu açın.
- (Diğer tüm sekmeleri seçilmemiş olmasını sağlamak) "Z serisi Setup" sekmesini seçin.
- Canlı Tarama yapılırken, numunenin üstüne odaklanmak ve "En İyi" düğmesine basın.
- numunenin altına Odak ve "Alt" tuşuna basınız.
- Giriş akımı adım boyutu (ya da basın optimize adım boyutu düğmesi).
- önss butonuna "Şimdi çalıştır".
- Bireysel Tiff görüntü yığınlarının olarak sonuçtaki Z-yığınlarının (görüntü Z-yığını başına 1 florokrom) kaydedin.
- 3B analiz yazılımı kullanılarak ilgi 3 boyutlu hacim bölgelerinin yeniden görüntü Z yığınlarının kullanarak (örn., Aşağıda tarif edildiği gibi Imaris x64 7.2.3 kullanarak).
- analiz yazılımı başlatın.
- Seçin 3D ses üretimi için araç çubuğundaki düğmesini "aşmak".
- Açık İlk renkli görüntü Z-yığını (örneğin., DAPI).
- ek renk kanalları, florokrom başına bir kanal eklemek için 'kanal eklemek' aracını kullanın. Böylece DAPI ve Alexa Fluor 594 fluorochromes ikisini de içeren bir numune iki kanalı gerektirir.
- Yukarıdaki 4,7 saptandığı gibi, (XYZ) doğru piksel (voksel) boyutlarını ayarlamak için "Görüntü Özellikleri" aracını kullanın.
- Gerektiği gibi kanal renklerini değiştirmek için "Ekran Ayarı" aracını kullanın (örneğin, mavi için DAPI kanalı ayarlamak Alexa Fluor kırmızı 594 kanal).
- po içinGörüntü penceresinde 3D hacim lan de, gerektiği gibi tıklayın ve sürükle hacmi bilgisayar fareyi kullanın.
- 3D görüntü ekran görüntüleri oluşturmak için araç çubuğundaki "Snapshot" aracını kullanın.
- 3D örnek rotasyon film oluşturmak için araç çubuğundaki "Animasyon" aracını kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yetişkin vahşi tipli fare tam kalınlıkta dorsal deri biyopsileri, bazal keratinosit markör Keratin14 (K14) bağlanan bir antikor ile boyandı, netleştirildi ve çekirdekleri DAPI boyama çözeltisi (Şekil 2 ve Film 1) ile zıt.
DAPI-pozitif çekirdekler numune (Şekil 2A, C) boyunca görünür ve K14 boyama sadece interfolliküler epidermisin tek hücreli kalın bazal katmanında görünür oldu, ve yağ bezleri (siyah yıldız), dış kök kılıflar özetleyen saç folikülleri ve ikincil saç mikroplar (Şekil 2B, C), daha önce 9 yayımlandı. K14 boyama yoğunluğu interfolliküler epidermis, uzak kıl folikülü ve ikincil saç mikroplar (beyaz yıldız) yüksek olduğunu ve bu saç kökü (Şekil 2C Bu) çıkıntısı alanında nispeten düşük oldu. Dermal papilla açıkça visibl da vardıDAPI etiketleme üzerinden e (Şekil 2C ok).
Yetişkin vahşi tipli fare telojen olarak çoğalan hücrelerin tam kalınlıkta sırt derisi biyopsilerin görselleştirmek için açıklık ve bir anti-Ki 67 antikoru ile boyanmış ve çekirdekleri DAPI çözeltisi (Şekil 3 ve Film 2) ile zıt edildi.
Çoğalan keratinositler bazal interfolliküler epidermis (Şekil 3C IFE) tespit ve boğazda saç köklerinin değil, çıkıntı bölge (Şekil 3C Bu) 'de (Şekil 3C mı) bulundu.
Yetişkin wild tip farelerin anajen yağ bezleri, tam kalınlıkta dorsal deri biyopsi görselleştirmek için açıklık ve sebositlerin yağ içeriği etiketler Nil Kırmızısı ile boyanmış, ve çekirdekler DAPI boyama solüsyonu (Şekil 4 ve Film 3) ile zıt edildi. Nil Kırmızı-pozitif sebaceous bezleri KÜP protokolü nedeniyle, bu yağ içeren yapıların morfolojisine etki etmediğini gösteren, saç köklerinin (Şekil 4C'de SB) istmusu bölgesinde gözlenmiştir. Beklenmedik bir şekilde, saç gövdesi, aynı zamanda, Nil Kırmızısı (Şekil 4C'de HS) ile işaretlendi.
Baz keratinositlerde 8 hiperaktif YAP mutan proteini ifade YAP2-5SA-ΔC transgenik farelerin epidermisi morfolojik değişiklikler görselleştirmek için, yetişkin vahşi tip ve YAP2-5SA-ΔC transjenik yavru fareler tam kalınlıkta dorsal deri biyopsileri açıklık ile boyandı Anti-K14 antikoru ve çekirdekleri DAPI çözeltisi (Şekil 5 ve film 4 (vahşi tip) ve film 5 (YAP2-5SA-ΔC)) ile zıt.
Şekil 4F, YAP2-5SA-ΔC transgenik deride, interfolliküler epidermisin hiperplazisi (üst çift ok 8 açıklandığı gibi saç folikülleri, uzun ve genişletilmiş kök hücre popülasyonlarının temsil anormal saç köklerinin (Şekil 5F düşük çift oklar) proksimal K14-etiketli hücre kitleleri görüntülenir.
Şekil 1: Görüntüleme Odası hazırlanması. A: Mavi tack (çapı yaklaşık 2 mm x 2 cm) iki ince şeritler hazırlamak ve:. Görüntüleme odasının hazırlanması için gerekli Sarf B hamur veya benzeri, ve 2 lamelleri (24 x 50 mm) oynamak, mavi tutturma iki lamelleri C:. cilt biyopsisi için yeterli alan sağlayan bir kapak kayma yerleştirin mavi tack şeritler. . İki şerit arasındaki CUBIC2 çözümün bir damla deri biyopsisi yerleştirin D: blue tack şeritler yerleştirin ikinci lamel deri biyopsisi kapsayacak şekilde. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Yetişkin Yabani türde Farelerin telojen dorsal Skin K14 / DAPI Etiket ing bir K14 antikor (B Kırmızı, C) ile işaretlenmiş bir yetişkin wild tip fare telojen bir dorsal deri biyopsisi 3D hacim rekonstrüksiyonu ve DAPI nükleer counterstain. (A, C mavi). K14 boyama şişkinliği de interfolliküler epidermis (IFE), berzah ve yağ bezleri (siyah yıldız) ve ikincil saç mikroplar (beyaz yıldız) güçlü ve nispeten düşük Konum (Bu). Ölçek 50 mikron barlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. A (B, C Kırmızı) Yetişkin Yabani türde Fareler bir Ki67 antikor ile etiketlenmiş bir yetişkin wild tip fare dorsal deri biyopsisi 3D hacmi rekonstrüksiyon ve telojen dorsal Cilt Ki67 etiketleme ve DAPI nükleer counterstain (mavi, C). Proliferatif Ki67 pozitif keratinositler bazal interfolliküler epidermis (IEF) belirgindir ve kıstak bölgesi (IS) değil, telojen saç folikülü çıkıntı (Bu) 'de. Ölçek 50 mikron barlar.rYer = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Yetişkin Yabani türde Farelerin anagen dorsal Skin Nil Kırmızı Boyama Nil Kırmızısı (B kırmızı, C) ve DAPI nükleer counterstain (mavi ile etiketlenmiş bir yetişkin wild tip fare anajen dorsal deri biyopsisi 3D ses rekonstrüksiyonu. A, C). Nil Kırmızı boyama sebositlerin (SB) ve saç gövdesine (HS) görülebilir. Ölçek 50 mikron barlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
şekil5: Morfolojik anormallikler YAP2-5SA-ΔC Epidermis yetişkin vahşi tip (A - C) dorsal deri biyopsisi 3 boyutlu hacim rekonstrüksiyonu ve YAP2-5SA-ΔC transgenik yavru farelerin (D - F) Bir K14 antikor ile etiketlenmiş (kırmızı. B, A C, E, F) ve DAPI nükleer karşıt-(mavi, C, D, F). YAP2-5SA-ΔC epidermis epidermal hiperplazi proksimale (F alt çift oklar) 8 karakteristik kök / progenitör hücre kitleleri görüntüler interfolliküler epidermis ve saç köklerinin (F üst çift oklar), belirgindir. Ölçek 50 mikron barlar. Büyük halini görmek için tıklayınız bu rakamın.
Film 1 bu filmi indirmek için tıklayınız.
Film 2. Bu filmi indirmek için tıklayınız.
Film 3. Bu filmi indirmek için tıklayınız.
01movie4.jpg "/>
Film 4. Bu filmi indirmek için tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
cilt gelişimini ve homeostazisini kontrol eden düzenleyici mekanizmalar en yaygın cilt morfolojisi, hücre popülasyonlarının veya protein ifadesi sadece sınırlı bir takdir sağlayan antikorlar ile doku bölümlendirilmeleri ve histolojik boyama veya etiketleme kullanarak 2D çalışılmıştır. Bir dizi yöntem epidermal bütün bağlar 10-13 3 boyutlu tek hücre çözünürlükte hücre ve proteinlerin mekansal organizasyon görselleştirme artırmak için geliştirilmiştir. Bunlardan bazıları ancak özellikle saçlı deri kullanılarak teknik açıdan zor dermis, epidermis gelen ayrılmasını içerir ve genellikle kıl köklerinin doku hasarı ve rüptürü ile sonuçlanır. Ayrıca, embriyo gelişimi ve doku homeostazının sırasında aralarında oluşan hücresel ve moleküler etkileşimlerin incelenmesinde epidermis ve dermiş bozar ayrılması.
'Düz montaj yaklaşımı' Başka bir yöntem olduğu tam kat fareCilt kesilir ve boyanmış ve sonra immünofloresan sinyalleri 14 koruyarak benzil benzoat ve benzil alkol (BBBA) ile açıklanmaktadır. Bu yöntem, dermis epidermis teknik açıdan zor ayrılmasını gerektirmez. Ancak, BBBA bazı floresan proteinleri denatüre ve dokudaki hücresel ve moleküler etkileşimleri araştırmak için gerekli numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için izin vermiyor, mikroskop hedefleri kirletir, son derece toksiktir.
Bu rapor nispeten güvenli ve ucuz reaktifler kullanılarak, istenen herhangi bir anatomik bölge ve yaş tam kalınlıkta fare deri biyopsi netleştirmek için bir KÜBİK protokol 5-7 açıklanır. Bu teknik olarak basit bir protokoldür sağlayan tek bir hücre çözünürlükte üç boyutlu DAPI ile zıt tam kalınlıkta deri biyopsi, içinde immünofloresans protein ekspresyonu ve çoğalma desen görselleştirme sağlar görülmemiş ve qual yüksek doğruluğaitative değerlendirme ve protein ifadesi, çoğalması, doku morfolojisi ve saç folikülü boyutları ölçümü. Bu yöntem aynı zamanda berraklaştırma işlemi sırasında doku lipidlerin çıkarılmasına rağmen Nil kırmızısı boyası kullanılarak sebositlerin görünüm için uygundur. Bu yöntemin önemli bir sınırlama, etkili bir şekilde bağlanması ve bu cilt berraklaştırma işlemi kullanarak, kendi hedef proteinlerin görselleştirme izin antikorların mevcudiyetidir. Buna ek olarak, oluşturulan görüntü ve film dosyaları büyük ve böylesine güçlü işlemciler ve geniş veri depolama alanı ile bilgisayar gibi iyi BT kaynaklarını önemlidir.
prosedürün kritik bir adım deri biyopsisi hazırlanmasıdır. sağlam saç folikülü anatomisinin görselleştirmek için, deri biyopsisi yönü dikkate alınmalıdır, ve biyopsi uzunluğu saç köklerinin uzunluğu doğrultusuna paralel olarak kesilmelidir. Buna ek olarak, küçük ve çok ince kayakn biyopsiler mikroskopi için doğru monte etmek zordur. Büyük biyopsiler temizlemek için daha fazla zamana ihtiyaç olacak ve antijen saptama eserler sonuçlanan antikor penetrasyon sorunlarını tabi olabilir. Deney başına nedenle, kesmek tavsiye açık ve leke multipl biyopsiler olduğunu.
sıkıca reaktif konsantrasyonlarında değişiklikler ile sonuçlanır ısıtma işlemi sırasında içeriğinin buharlaşmasını önlemek için KÜP çözümler hazırlarken tüpleri mühür ve bozulmuş doku takas bozulmasına neden olabilir ayrıca önemlidir. Bir sonraki önemli adım doku temizleme sürecini hızlandırmak için 37 ° C'de netlik kazanacaktır olmasıdır. 7 gün sonra, CUBIC1 çözüm eskisinin yerine taze hazırlanmış gerekir.
Gelecekte, daha fazla antikor KÜBİK cilt açıklama prosedür ile uyumlu olduğu tespit edilecek ve analizler görselleştirilmesi ve epidermal ve melanosit (kök) hücre marker miktarının uzatılabilirs ve dermal proteinleri. Bu teknik aynı zamanda dermis arasındaki sinyalizasyon etkileşimler de dahil olmak üzere mutant fareler ve transgenik muhabiri fare modellerinde, deride anormal ve normal epidermal biyolojisini altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların aydınlatılması cilt patoloji ve anatomi ve yardım 3D çalışmalarda önemli bir rol oynayacaktır epidermis.
KÜP protokolü 5-7 diğer omurgalı hayvan modellerinde derisine uygulanacak olması muhtemeldir ve insan derisi punch biyopsi etmektir. Işık levha mikroskopisi büyük deri örneklerinin epidermal anatomi, protein ekspresyonu ve saç folikülü döngüsü aşamalarında ilerleme görselleştirme sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz hayvan deney ile destek için Avustralya Bio-Kaynaklar (Garvan Enstitüsü, Avustralya), Biyolojik Kaynaklar Merkezi (UNSW Avustralya) ve Hayvan Bakım ve Etik Komitesi teşekkür ederim. Bu çalışma Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (Proje Hibe APP1062720) tarafından desteklenmiştir. Dr. Cesar P. Canales bir CONICYT-Becas Şili bursu (# 72101076) alıcıları olduğunu. Sayın Bassem Akladios UNSW Avustralya tarafından Üniversitesi Uluslararası Lisansüstü Ödülü bir alıcı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 - Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
- Fuchs, E.
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
