Summary
В настоящем докладе описывается кубического протокол для уточнения полной толщины кожи мыши биопсию, и визуализировать экспрессии белка шаблоны, пролиферирующие клетки и себоцитов в одной резолюции ячейки в 3D. Этот метод позволяет точно оценить анатомии кожи и патологии, а также аномальных эпидермальных фенотипов в генетически модифицированных мышей линий.
Abstract
Кожа имеет важное значение для нашего выживания. Наружный слой эпидермиса состоит из межфолликулярного эпидермиса, который является многослойный чешуйчатый эпителий, покрывающий большую часть нашего тела, и эпидермальных придатков, таких как волосяные фолликулы и потовые железы. Эпидермис подвергается регенерации на протяжении всей жизни, и в ответ на травму. Это обеспечивается с помощью K14-экспрессирующие базальные популяции стволовых / прогениторных клеток эпидермиса, которые жестко регулируется несколькими регуляторных механизмов активных внутри эпидермиса и между эпидермиса и дермы. В данной статье описывается простой метод для выяснения полной толщины мыши биопсии кожи, и визуализировать паттерны экспрессии белка K14, Ki67 помеченных пролиферирующие клетки, нильский красный маркированы себоцитов и DAPI ядерной маркировки на одной резолюции ячейки в 3D. Этот метод позволяет точно оценить и количественную оценку анатомии кожи и патологии, а также аномальных эпидермальных фенотипов в генетически модифицированных мышей линий. Кубическая протокол йе лучший метод, доступный на сегодняшний день для изучения молекулярных и клеточных взаимодействий в полной толщины биопсии кожи на одной резолюции клетки.
Introduction
Кожа имеет важное значение для нашего выживания. Она состоит из трех основных слоев наружные эпидермис, дерму и подкожную клетчатку. Эпидермис является весьма регенеративных тканей. Это плоскоклеточный многослойный эпителий, состоящего в основном из кератиноцитов. Кератиноциты рождаются в базальном слое, и двигаться вверх через супрабазальных слои дифференцируя, и в конце концов они опадают во внешнем рогового слоя примерно через месяц после их рождения. Эпидермис развивается ряд придатков, включая волосяные фолликулы и сальные железы. Волосяные фолликулы также регенерируют в циклическом моды на протяжении всей жизни 1. Регенерационная способность эпидермиса включена наличием стволовых клеток и клеток - предшественников, которые расположены в базальном слое межфолликулярного эпидермиса и волосяных фолликул 2.
Многие сигнальные пути участвуют в развитии эпидермального и регенерации. Некоторые из них происходят в пределахтолько на эпидермис, такие как путь ежа. Другие сигнальные события происходят между дермы и эпидермиса 3. Например, Wnt сигналы от дермы , как полагают , являются важными для развития волосяного фолликула, и они секретируются дермального сосочка в начале анагена для активации волосяной фолликул выпуклость пролиферации стволовых клеток / клеток - предшественников и рост волосяного фолликула 4. Важно понимать клеточные и молекулярные механизмы, которые контролируют развитие эпидермальный и регенерации, чтобы лучше понять, как они могут быть возмущенных в регенеративной заболевания кожи, такие как рак кожи.
В данной статье описывается C Лира, U nobstructed B дождь I maging коктейли и omputational анализ (кубические) протокол C 5-7 уточнить целые препараты кожи монтирование, и визуализировать паттерны экспрессии белка в 3 -х измерениях на одном разрешении клеток с помощью конфокальной микроскопии. Кубическая метод предполагает погружение кожиткани в двух аминоспирт на основе химических коктейлей. Эти решения корректировать показатели преломления в образце кожи, оставляя ткань прозрачной и белки нетронутыми, что позволяет иммунологического в одной резолюции ячейки.
Используя этот CUBIC протокол, базальную и пролиферирующие популяции кератиноцитов в эпидермисе межфолликулярного и в волосяных фолликулах были обследованы в полной толщины кожи биопсий мышей дикого типа с использованием анти-Keratin14 (K14) и анти-Ki67 антител. Сальные железы в дикого типа биопсии кожи также были визуализированы с помощью Нила Красное окрашивание. И, наконец, базальные популяции кератиноцитов дикого типа и гиперпластических биопсии кожи YAP2-5SA-delta ; C сравнивали 8.
Этот протокол позволяет КУБИЧЕСКИЙ визуальную оценку экспрессии белка в полной толщины биопсии кожи в одной резолюции клетки, и является важным инструментом, чтобы оценить эпидермальный анатомию и морфологические дефекты в коже генетически модифицированныхмышей, и исследовать клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе развития эпидермальный и регенерации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этика Заявление: Все процедуры, связанные с предметов животного происхождения следуйте рекомендациям по уходу и комитетом по этике животных (ACEC) в UNSW Австралии в соответствии с утвержденным протоколом ACEC 13 / 64В.
1. Подготовка Прозрачная Маус ткань кожи
Примечание: Все мыши, используемые в данном исследовании, были на C57BL / 6 генетического фона
- Коллекция тканей кожи мыши.
- Гуманно усыпить мышей путем смещения шейных позвонков.
- Осторожно удалите волоски из соответствующего участка кожи с триммером Стараясь не поранить кожу.
- Промыть кожу обеззараживать с 70% -ным этанолом в фосфатном буферном растворе (PBS).
- Поднимите спинной кожи шеи с пинцетом и сделать разрез с ножницами.
- Рассеките большой участок кожи спинной мыши (примерно 1,5 х 4 см).
- Свести кожи дермы стороной вниз на фильтровальную бумагу, и обратите внимание на передне-задней ориентации образца.
- Triм фильтровальную бумагу вокруг рассеченной кожи, и место, в 15 мл пробирку, заполненную свежеприготовленный 4% -ном растворе параформальдегида (PFA) в PBS.
- Закрепить в течение 1 ч при комнатной температуре, или в течение ночи в холодильнике при температуре 4 ° С.
- Промыть кожу 2 х 5 мин в PBS в 15 мл пробирку.
Примечание: Следующая (1.1.10 - 1.1.12) являются необязательными этапами для длительного хранения тканей. - Высушить расчлененный кожи в PBS с увеличением концентрации этанола (25%, 50% 70%) в 15 мл трубки во время стадий промывки 1-ч при комнатной температуре.
- Храните обезвоженной кожи в 70% этаноле в PBS в 15 мл пробирку при 4 ° С до дальнейшего использования.
- За 4 часа до очистки, регидрировать ткани кожи в PBS с уменьшением концентрации этанола (70%, 50%, 25%, 0%) в 15 мл трубки во время стадий промывки 1-ч при комнатной температуре.
- Очистка биопсии кожи мыши
- Подготовьте CUBIC1 клиринговую раствор путем растворения 3,85 г мочевины и 3,85 г N, N, N ', N'-tetrakis (2-гидроксипропил) этилендиамин в 5,38 мл дистиллированной воды на нагревател, установленного на 60 - 70 ° C. Используйте горячую мешалку.
- Добавить 2,31 г Полиэтиленгликоль моно-п-isooctylphenyl эфир / тритона Х-100 к раствору сразу понятно и охлаждают до комнатной температуры.
- Порезать кожу мыши с острым лезвием бритвы в биоптатах примерными размерами 0,2 х 0,5 см, и погружать в 5 мл CUBIC1 клирингового раствора в 15 мл пробирку. Для оптимизации визуализации волосяных фолликулов, убедитесь, что длинная сторона биопсии разрезают вдоль передне-заднем направлении образца.
- Место на поворотную платформу в качестве гибридизационного печи при температуре 37 ° С.
- Изменение клиринговую раствора через 7 дней. Подготовьте свежий CUBIC1 раствор перед использованием.
- Проверьте прозрачность ткани через 7 дней. При необходимости оставить биопсий в клиринговой растворе CUBIC1, пока ткань не будет полностью прозрачным.
- После того, как биопсия кожи является прозрачным,удаления раствора CUBIC1, и добавить 4 мл 1 × PBS мыть в ткань 4 раза в течение 6 ч при 37 ° С.
- Промыть ткань кожи в 20% вес / объем сахарозы в PBS в 15 мл пробирку в течение 4 ч при 37 ° С.
- Замораживание ткани в монтажной среды Оптимальная температура резания (ОКТ) Соединение в 15 мл пробирку в течение ночи в морозильной камере C -80 °.
Примечание: Этот шаг увеличит проницаемость биопсии для проникновения антител в последующих стадиях.
2. Иммунофлуоресценции Окрашивание
- Растаяйте ткань от 1.2.9) до комнатной температуры в течение 2 - 3 ч.
- Мытье ткани в 15 мл пробирку с 5 мл PBS в течение 8 ч при комнатной температуре, чтобы удалить OCT Compound.
- Передача биопсий в 2 мл пробирку и инкубировать ткани в 1 мл кроличьей анти-Keratin14 или кроличьей анти-Ki67 антителом, и разводили 1: 100 в PBST (PBS + 0,1% Тритон-X100) в течение 3-х дней на вибраторе в 37 ° C духовку.
- Передача биопсии в 15 мл трубки,й моют ткани, 4 раза в течение 6 ч в 5 мл PBST на шейкере в 37 ° C духовке.
- Передача биопсий в 2 мл пробирку, добавляют 1 мл анти-кроличий Alexa594 вторичного антитела, разбавленного 1: 100 в PBST и инкубировать 3 дня на шейкере в 37 ° C духовке.
- Передача биопсий в 15 мл трубки и промыть ткани 4 раза в течение 6 ч в 5 мл PBST на шейкере в 37 ° C духовке.
- Передача биопсий в 2 мл пробирку, добавляют 1 мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) решение ядерной контрастное (1: 1000) в PBST и инкубировать в течение ночи на качалке при 37 ° C духовке.
- Удалить решение counterstaining DAPI, и добавьте 1 мл PBST в 2 мл пробирку для мытья ткани 4 раза в течение 6 часов на шейкере в 37 ° C духовке.
Примечание: Дополнительный этап Биопсии можно хранить в темноте в 1X PBS с 0,02% азида натрия в течение не менее 3-х недель.
3. Нил Красный Окрашивание
- Растворите нильский красный порошок, в диметилсульфоксиде (ДМСО) до конечной концентрации 1 мг / мл
- Добавить 1 мкл нильский красный раствор до 1 мл PBS до конечной концентрации 1 мкг / мл.
- Оттепели ткани от 1.2.9) до комнатной температуры в течение 2 - 3 ч и промывают 5 мл PBS в течение 8 ч при комнатной температуре.
- Передача биопсий в 2 мл пробирку, и погружать ткани в 1 мл раствора нильского Красное окрашивание в течение 2,5 ч при комнатной температуре.
- Промыть биопсии кожи в 2 мл пробирку с 1 мл PBST 4 раза в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Удалить PBST раствор из 2 мл пробирку, прибавляют 1 мл раствора DAPI ядерной counterstaining (1: 1000) в PBST и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре.
- Удалить решение counterstaining DAPI, и добавьте 1 мл PBST в 2 мл пробирку, чтобы вымыть ткани кожи 4 раза в течение 6 ч при комнатной температуре.
Примечание: Дополнительный этап Биопсии можно хранить в темноте в 1X PBS с 0,02% азида натрия в течение не менее 3-х недель.
4. обработки изображений
- Подготовьте CUBIC2 клиринговую раствор, который содержит 50% (Вес / объем) сахарозы, 25% (вес / объем) мочевины, 10% (вес / объем) 2,2 ', 2' '- nitrilotriethanol, и 0,1% (об / об) Тритона X-100.
- Инкубируйте ткани кожи в 1 мл раствора CUBIC2 в 2 мл пробирку на шейкере в течение 24 ч при 37 ° C духовке. Этот шаг будет даже показатель преломления ткани.
- Проверьте четкость ткани. После того, как это понятно, расположить всю биопсии кожи (0,2 х 0,5 см) на ее длинной стороне на предметное стекло покровное, таким образом, что направление длины волоса параллельно поверхности покровного (# 1 24 х 60 мм)
Примечание: Дополнительный этап Антитело Измазанные биопсий можно хранить в CUBIC2 растворе в течение примерно 7 дней. Найл Ред Измазанные биопсий можно хранить только в растворе CUBIC2 до 1 дня, и должны быть отображены как можно скорее. - Подготовка изображения камеры (Рисунок 1)
Примечание: Расходные материалы, необходимые для подготовки изображения камеры являются: голубой клейкость, лепка или подобное, и 2 покровные (24 х 50 мм) (Figure 1А).- Приготовьте две тонкие полоски синего клейкости (диаметр примерно 1 мм х 2 см) и два покровных (рис 1б).
- Поместите синие клейких полосок на одном покровным, что позволяет достаточно места для кожи биопсии (Рисунок 1С). 4.4.3)
- Поместите биопсию кожи между полосами на покровное в капле раствора CUBIC2 (рис 1C).
- Накройте биопсия кожи со вторым покровным (рис 1D).
- Поместите камеру формирования изображения с установленной биопсии кожи на стадии конфокальной микроскопии и перемещения ткани в световой путь.
- Сканирование образца с использованием ртути или галогена источника света и стандартные эпифлуоресцентной фильтры (например, DAPI / GFP / Cy3 / Cy5) для выявления флуоресцентно окрашенных областей , представляющих интерес.
- Изображение области интереса с использованием объектива 10X и 20X (NA 0.75) и стандартные методы визуализации конфокальной флуоресцентной (например., С Д.А.PI окрашенных образцов освещения с 405 нм лазером и сбор флуоресценции сигнала между 425 - 475 нм, а также с Alexa Fluor 594 или нильский красный окрашенных образцов освещают с 561 нм лазером и сбор флуоресценции сигнала между 570 - 620 нм).
- Генерация изображений Z-стеки каждой области , представляющей интерес с помощью микроскопа Z-стека программного обеспечения захвата изображений (например., С использованием NIS элементов формирования изображения программного обеспечения 4.13 , как описано ниже).
- Обеспечить оптимальную мощность лазера и PMT HV / Смещение настройки были выбраны для сбора образца флуоресценции.
- Откройте панель инструментов "ND Приобретение" из "Controls" Приобретение.
- Выберите вкладку "Настройка серии Z" (убедитесь, что все остальные вкладки невыделенная).
- В то время как живого сканирования, фокус на верхней части образца и нажмите кнопку "Top".
- Основное внимание на нижней части образца и нажмите на кнопку "Bottom".
- Входной требуемый размер шага (или нажмите кнопку оптимизированный размер шага).
- досс "Запуск" кнопку.
- Сохранить результирующие Z-стеки в виде отдельных Tiff стеков изображения (1 флуорохром на каждое изображение Z-стек).
- Используйте изображение Z-стеки реконструировать 3D объемные области интереса с использованием 3D программного обеспечения для анализа (например., Используя Imaris x64 7.2.3 , как описано ниже).
- Запустите программное обеспечение для анализа.
- Выберите кнопку "перегнать" в панели инструментов для генерации 3D-объема.
- Открыть первого цветное изображение Z-стека (например., DAPI).
- Используйте "Добавить канал" инструмент для добавления дополнительных цветовых каналов, один канал флуорохромом. Таким образом, образец, содержащий как DAPI и Alexa Fluor 594 флуорохромии потребуется два канала.
- Используйте "Свойства" инструмент для установки правильно пикселей (вокселей) размеры (XYZ), как определено в 4.7 выше.
- Используйте "Настройка дисплея" инструмент для изменения цвета канала при необходимости (например, установить канал DAPI в синий цвет, Alexa Fluor 594 канала на красный).
- Рохруп- объем 3D в окне изображения, использовать компьютерную мышь, чтобы нажать и объем сопротивления по мере необходимости.
- Используйте "Snapshot" инструмент на панели инструментов для создания снимков экрана 3D-изображения.
- Используйте "Анимация" инструмент на панели инструментов для создания фильмов 3D вращения образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Полная толщина кожи спины биопсий взрослых мышей дикого типа были выяснены, окрашивали антителом связывания базальная кератиноцитов маркера Keratin14 (K14), и ядер были контрастно с DAPI красящим раствором (рис 2 и Movie 1).
DAPI-положительных ядер были видны по всему образцу (рис 2А, С), и К14 окрашивание было видно исключительно в толстом слое базальных одноклеточного из межфолликулярного эпидермиса, и с изложением сальные железы (черные звездочками), наружный корень оболочках волосяные фолликулы, и во вторичных волосяных микробов (рис 2, б), как и ранее опубликована 9. Интенсивность окраски К14 была высокой в межфолликулярного эпидермиса, дистальной волосяной фолликул и вторичных волос ростков (белые звездочки), и она была относительно низкой в области балджа волосяного фолликула (Bu на рисунке 2С). Кожный сосочки были также четко visiblе с помощью маркировки DAPI (стрелка на рисунке 2C).
Чтобы визуализировать пролиферирующих клеток, полную толщину биопсий кожи спины в телогене взрослых мышей дикого типа были разъяснены и окрашивали антителом против Ki67, и зародыши подвергали контрастному DAPI раствором (рис 3, и Movie 2).
Пролиферирующие кератиноциты были обнаружены в базальных межфолликулярного эпидермиса (IFE на фиг.3С), и в перешейке (Is на фиг.3С) волосяных фолликулов, но не в области выпуклость (Bu на фиг.3С).
Для визуализации сальные железы, полная толщина биопсию кожи спины в анагена взрослых мышей дикого типа были выяснены и окрашивали Нила Red , который маркирует содержание жира себоцитов и ядер были контрастно с красящим раствором DAPI (рисунок 4 и Movie 3). Найл Ред-положительным sebaceouS железы наблюдались в перешейке области волосяных фолликулов (СО на фигуре 4C), показывая , что кубическая протокол не оказывает существенного влияния на морфологию этих жиросодержащих структур. Неожиданно оказалось, волосы валы также были помечены красным Нила (HS на рисунке 4C).
Для того, чтобы визуализировать морфологические изменения в эпидермисе YAP2-5SA-трансгенных мышей & delta ; C , выражающие гиперактивный белок YAP мутанта в базальных кератиноцитов 8, полная толщина кожи спины биопсий взрослых дикого типа и YAP2-5SA-мышей трансгенной & delta ; C однопометница были разъяснены и окрашивали анти-K14 антитела, и ядра были контрастно с DAPI раствором (рисунок 5, и Movie 4 (дикого типа) и Movie 5 (YAP2-5SA-delta ; C)).
В трансгенной кожи YAP2-5SA-, & delta ; C гиперплазию межфолликулярного эпидермиса (верхние двойные стрелки на рис 4F рисунке 5F), представляющие население увеличенных стволовых клеток, как описано выше 8.
Рисунок 1: Получение изображений Палаты. A: Расходные материалы, необходимые для получения изображения камеры синего цвета липкость, лепка или подобное, и 2 покровные (24 х 50 мм . ) B: подготовить две тонкие полоски синего галс (диаметром примерно 2 мм х 2 см), и два покровные C:. место синий галс полосы на одном покровным, что позволяет достаточно места для биопсии кожи. Поместите биопсии кожи в капле раствора CUBIC2 между двумя полосами D:. Поместите второй покровное на синих липкость полосок для покрытия биопсии кожи. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: K14 / DAPI Ярлык флу- кожи спины в Telogen из взрослых мышей дикого типа 3D - объем реконструкции биопсии кожи спины в телогене взрослого человека дикого типа мыши , меченной антителами К14 (Red в B, C), и DAPI ядерной контрастирующая. (синий в A, C). K14 окрашивание сильна в межфолликулярного эпидермиса (IFE), перешеек и сальных желез (черные звездочки), а также вторичных волос ростков (белая звездочка), и относительно низко в выпуклость область (BU). Шкала баров 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: Ki67 маркировка кожи спины в Telogen из взрослых мышей дикого типа объемных 3D - реконструкций биопсии спинной кожи взрослого дикого типа мыши , меченных антителом Ki67 (красным цветом B, C) и DAPI ядерной контрастное (синий в A, С). Пролиферирующие Ki67-положительные кератиноциты очевидны в базальных межфолликулярного эпидермиса (IFE), так и в области перешейка (Is), но не в выпуклость (BU) фолликула телоген волос. Шкала баров 50 мкм.rget = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Нил Красный Окрашивание кожи спины в анагена от взрослых мышей дикого типа 3D - объем реконструкции биопсии кожи спины в анагена взрослого человека дикого типа мыши , меченных Нил красный (красный в B, C) и DAPI ядерной контрастирующая (синий цвет в. А, С). Нил Красное окрашивание видна в себоцитов (SB) и в стержне волоса (HS). Шкала баров 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
фигура5: Морфологические Аномалии в YAP2-5SA-Эпидермис объемные & delta ; C 3D реконструкций кожи спины биопсий взрослых дикого типа (A - C) и YAP2-5SA-мышей трансгенной & delta ; C однопометница (D - F) , меченных антителом К14 (красный в. в, с, Е, F), и DAPI ядерной контрастное (синий в A, C, D, F). Эпидермального гиперплазия YAP2-5SA-эпидермис & delta ; C проявляется в межфолликулярного эпидермис (верхний двойными стрелками в F) , а также в волосяных фолликулах, которые отображают характерные массы стволовых / прогениторных клеток проксимально (нижние двойные стрелки в F) 8. Шкала баров 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Фильм 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать этот фильм.
Фильм 2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать этот фильм.
Фильм 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать этот фильм.
01movie4.jpg "/>
Фильм 4. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать этот фильм.
Фильм 5. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать этот фильм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Регуляторные механизмы, контролирующие развитие кожи и гомеостаз наиболее часто изучаются в 2D с использованием секционирования ткани и гистологическое окрашивание или мечение с антителами, что позволяет лишь ограниченную оценку морфологии кожи, клеточных популяций или экспрессии белка. Ряд методов были разработаны с целью улучшения визуализации пространственной организации клеток и белков в одной резолюции клетки в 3 -х измерениях в эпидермальных тотальных 10-13. Некоторые из них тем не менее включать разделение эпидермиса от дермы, что является технически сложной задачей особенно с использованием волосатой кожи, а также часто приводит к повреждению тканей и разрыва волосяных фолликулов. Кроме того, разделение эпидермиса и дермы также препятствует изучению клеточных и молекулярных взаимодействий, которые происходят между ними во время эмбрионального развития и гомеостаза тканей.
'Плоский монтаж подход "это еще один метод, где полная толщина мышикожа рассечена и иммуноокрашиванию, а затем выяснены с использованием бензилбензоат и бензиловый спирт (BBBA) при сохранении иммунофлуоресцентного сигналов 14. Этот метод не требует технически сложной разделения эпидермиса от дермы. Тем не менее, BBBA очень токсичен, он денатурирует некоторые флуоресцентные белки, и это загрязняет цели микроскопа, не позволяя для изображений с высоким разрешением образцов, необходимых для исследования клеточных и молекулярных взаимодействий в ткани.
В настоящем докладе описывается кубического протокол 5-7 уточнить полные биопсию кожи толщиной мыши из любого желаемого анатомической области и возраста с использованием относительно безопасных и дешевых реагентов. Это технически простой протокол позволяет визуализировать выражения и распространения образцов белка методом иммунофлуоресценции в полной биопсии кожи толщиной контрастным DAPI в трех измерениях при одном разрешении клеток, обеспечивая беспрецедентные и высокую точность качеторитетных оценка и количественное определение экспрессии белков, пролиферации, морфологии тканей и размеров волосяного фолликула. Этот метод также подходит для визуализации с использованием себоцитов Найл Ред окрашивание, несмотря на удаление липидов тканей во время процедуры осветления. Важным ограничением этого метода является наличие антител эффективно связывания и позволяющих визуализировать их соответствующих белков-мишеней с помощью этого процесса осветления кожи. Кроме того, генерируемые изображения и фильмы файлы большие и хорошие ИТ-ресурсы, такие как компьютеры с мощными процессорами и большим пространством для хранения данных имеют важное значение.
Важным шагом в процедуре является получение биопсий кожи. Для визуализации нетронутыми волосяного фолликула анатомии, ориентация биопсии кожи следует принимать во внимание, а длина биопсий следует разрезать параллельно направлению длины волосяных фолликулов. Кроме того, небольшой и очень тонкий лыжныйп биопсий трудно правильно смонтировать для микроскопии. Большие биопсий потребуется больше времени, чтобы очистить, и может повлечь проблемы проникновения антител, приводящие к артефактам обнаружения антигена. Поэтому желательно, чтобы вырезать, ясно и пятно несколько биопсий на эксперимент.
Кроме того, важно, чтобы плотно прилегают трубки при подготовке Кубическую растворов для предотвращения испарения содержимого в процессе нагрева, что приводит к изменениям в концентрации реагентов и может привести к клиринг нарушенную ткани. Следующим важным шагом является то, что ткань будет уточнена при 37 ° C для ускорения процесса клиринга. Через 7 дней, решение CUBIC1 необходимо будет приготовить свежую, чтобы заменить старый.
В будущем, больше антител будут идентифицированы, которые совместимы с КУБИЧНОЙ кожи осветления процедуры и анализы может быть продлен до визуализации и количественной оценки эпидермального и меланоцитов (стволовых) клеток маркерас и дермальные белки. Этот метод также будет играть фундаментальную роль в 3D исследованиях кожной патологии и анатомии, а также помощь в выяснении клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе ненормальное и нормальной эпидермальный биологии в коже мутантных мышей и трансгенных моделей репортер мыши, в том числе сигнальных взаимодействий между дермы и эпидермис.
Кубическую протокол 5-7, вероятно, будет применяться к коже других позвоночных животных моделей, а также к биопсий пробивных кожи человека. Свет листа микроскопия позволит визуализировать эпидермального анатомии, паттернов экспрессии белка и прогрессированием этапов цикла фолликул волос в больших образцах кожи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим австралийской биоресурсы (Гарван Institute, Австралия), ресурсный центр по биологическому (UNSW Австралия) и уход за животными & Комитет по этике для поддержки с экспериментов на животных. Эта работа была поддержана Национальным здравоохранения и Совет по медицинским исследованиям Австралии (проект Грант APP1062720). Доктор Сезар П. Каналес является получателями стипендии НКНТИ-Бекас Чили (# 72101076). Г-н Bassem Akladios является получателем университета международной премии постдипломного по UNSW Австралии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 - Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
- Fuchs, E.
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
