Summary
Ce rapport décrit un protocole CUBIC pour clarifier plein des biopsies de peau d'épaisseur de la souris, et de visualiser les profils d'expression de la protéine, les cellules proliférantes, et sébocytes à la résolution d'une seule cellule en 3D. Cette méthode permet une évaluation précise de l'anatomie de la peau et de la pathologie et de phénotypes épidermiques anormales dans des lignées de souris génétiquement modifiées.
Abstract
La peau est essentielle pour notre survie. La couche externe est constituée de l'épiderme de l'épiderme interfolliculaire, qui est un épithélium pavimenteux stratifié qui couvre la majeure partie de notre corps, et les phanères comme les follicules pileux et des glandes sudoripares. L'épiderme subit la régénération pendant toute la vie et en réponse à une blessure. Ceci est activé par K14 exprimant des populations souches / cellules progénitrices épidermiques basales qui sont étroitement régulés par des mécanismes de régulation multiples actifs dans l'épiderme et entre l'épiderme et le derme. Cet article décrit une méthode simple pour clarifier plein des biopsies de peau d'épaisseur de la souris, et de visualiser les profils d'expression de la protéine K14, Ki67 étiquetés cellules proliférantes, rouge Nil étiqueté sébocytes, et l'étiquetage nucléaire DAPI à la résolution de la cellule unique en 3D. Cette méthode permet une évaluation précise et la quantification de l'anatomie de la peau et de la pathologie et de phénotypes épidermiques anormales dans des lignées de souris génétiquement modifiées. Le protocole CUBIC est ee meilleure méthode disponible à ce jour pour étudier les interactions moléculaires et cellulaires en pleine épaisseur biopsies de la peau à la résolution d'une seule cellule.
Introduction
La peau est essentielle pour notre survie. Il se compose de trois couches principales de l'épiderme les extérieurs, le derme et l'hypoderme. L'épiderme est un tissu très régénérative. Il est un épithélium pavimenteux stratifié, composé principalement de kératinocytes. Les kératinocytes sont nés dans la couche basale, et se déplacent vers le haut à travers les couches suprabasales tout en différenciant, et finalement ils tombent dans la couche externe cornified environ un mois après leur naissance. L'épiderme se développe un certain nombre d'appendices, y compris les follicules pileux et des glandes sébacées. Les follicules pileux se régénèrent également de façon cyclique tout au long de la vie 1. La capacité de régénération de l'épiderme est activé par la présence de cellules souches et progénitrices qui sont situés dans la couche basale de l'épiderme interfolliculaire des follicules pileux et 2.
De nombreuses voies de signalisation ont été impliquées dans le développement et la régénération de l'épiderme. Certaines d'entre elles se produisent à l'intérieurseulement l'épiderme, telles que la voie Hedgehog. D' autres événements de signalisation ont lieu entre le derme et l' épiderme 3. Par exemple, les signaux Wnt du derme sont considérées comme importantes pour le développement des follicules pileux, et ils sont sécrétés par la papille dermique au début de la phase anagène pour activer le follicule pileux gonflement souches / progénitrices la prolifération cellulaire et la croissance des follicules pileux 4. Il est important de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent le développement de l'épiderme et de la régénération afin de mieux comprendre comment ils peuvent être perturbés dans les maladies régénératrice de la peau telles que le cancer de la peau.
Cet article décrit un lear C, U nobstructed B pluie I cocktails forgemagie et C analyse omputational (CUBIC) protocole 5-7 pour clarifier les préparatifs de la peau de montage entières, et de visualiser les profils d'expression des protéines dans les 3 dimensions à la résolution d'une seule cellule par microscopie confocale. La méthode CUBIC implique l'immersion de la peautissu en deux cocktails chimiques à base de aminoalcools. Ces solutions ajuster les indices de réfraction de l'échantillon de peau, en laissant le tissu transparent et les protéines intactes, ce qui permet immunodétection à une résolution à une seule cellule.
En utilisant ce protocole CUBIQUE, la base et la prolifération des populations de kératinocytes dans l'épiderme interfolliculaire et dans les follicules pileux ont été imagées en totalité des biopsies de peau d'épaisseur des souris de type sauvage en utilisant l'anti-Keratin14 (K14) et des anticorps anti-Ki67. Les glandes sébacées dans les biopsies de la peau de type sauvage ont également été visualisés en utilisant du Nil Rouge coloration. Enfin, les populations de kératinocytes basaux de type sauvage et hyperplasiques biopsies cutanées YAP2-5SA-Ac 8 ont été comparés.
Ce protocole CUBIC permet une évaluation visuelle de l'expression des protéines dans leur intégralité des biopsies de peau d'épaisseur à la résolution d'une seule cellule, et est un outil important pour apprécier l'anatomie épidermique et défauts morphologiques dans la peau d'organismes génétiquement modifiéssouris, et d'enquêter sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent le développement de l'épiderme et de la régénération.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Déclaration éthique: Toutes les procédures impliquant des sujets animaux suivent les directives du Comité des soins aux animaux et de l'éthique (ACEC) à UNSW Australie sous protocole approuvé AFIC 13 / 64B.
1. Préparation du tissu transparent de la peau de la souris
Remarque: Toutes les souris utilisées dans cette étude étaient sur une C57BL / 6 de fond génétique
- Collection de tissus de la peau de la souris.
- Humainement euthanasier les souris par dislocation cervicale.
- Retirez délicatement les poils de la zone de la peau concernée avec une coupe en prenant soin de ne pas blesser la peau.
- Laver la peau à décontaminer avec de l'éthanol à 70% en tampon phosphate salin (PBS).
- Soulevez la peau du cou dorsale avec une pince et de faire l'incision avec des ciseaux.
- Disséquer une grande surface de la peau dorsale de souris (environ 1,5 x 4 cm).
- Aplatir la peau derme vers le bas sur un papier filtre, et prendre note de l'orientation antérieure-postérieure de l'échantillon.
- Tripapier m de filtre autour de la peau disséquée, et placer dans un tube de 15 ml rempli de 4% fraîchement préparé paraformaldéhyde (PFA) solution dans PBS.
- Fixer pendant 1 h à température ambiante, ou une nuit au réfrigérateur à 4 ° C.
- Laver la peau 2 x 5 min dans du PBS dans un tube de 15 ml.
Note: Ce qui suit (1.1.10 - 1.1.12) sont des étapes facultatives pour le stockage à long terme des tissus. - Déshydrater la peau disséqués dans du PBS avec une concentration croissante d'éthanol (25%, 50% à 70%) dans un tube de 15 ml pendant 1 h sur des étapes de lavage à la température ambiante.
- Stocker les peaux déshydratées dans de l'éthanol à 70% dans du PBS dans un tube de 15 ml à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
- 4 heures avant le dégagement, réhydrater le tissu cutané dans du PBS avec une concentration décroissante de l'éthanol (70%, 50%, 25%, 0%) dans un tube de 15 ml pendant 1 h sur des étapes de lavage à la température ambiante.
- Effacement des biopsies de la peau de la souris
- Préparer la solution CUBIC1 de compensation en dissolvant 3,85 g d' urée et 3,85 g de N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) éthylènediamine dans 5,38 ml d'eau distillée sur un appareil de chauffage réglé à 60 - 70 ° C. Utiliser un agitateur à chaud.
- Ajouter 2,31 g de polyéthylène glycol éther mono-p-isooctylphényle / Triton X-100 à la solution une fois qu'il est clair et a refroidi à température ambiante.
- Couper la peau de la souris avec une lame de rasoir dans des biopsies de dimensions approximatives de 0,2 x 0,5 cm, et plonger dans 5 ml de solution CUBIC1 de compensation dans un tube de 15 ml. Afin d'optimiser la visualisation des follicules pileux, en sorte que le côté le plus long de la biopsie est découpée le long de la direction de l'échantillon antéro-postérieur.
- Placer sur une plate-forme tournante dans un four d'hybridation à 37 ° C.
- Changer la solution de compensation après 7 jours. Préparer la solution de CUBIC1 frais avant utilisation.
- Vérifier la transparence du tissu après 7 jours. Si nécessaire, laisser des biopsies en solution de compensation CUBIC1 jusqu'à ce que le tissu est complètement transparent.
- Une fois que la biopsie de la peau est transparente,retirer la solution de CUBIC1, et ajouter 4 ml de 1 x PBS pour laver le tissu 4 fois pendant 6 heures à 37 ° C.
- Laver le tissu cutané à 20% p / v de saccharose dans du PBS dans un tube de 15 ml pendant 4 heures à 37 ° C.
- Congeler le tissu en milieu de montage optimal Cutting Temperature (OCT) Le composé dans un tube de 15 ml pendant une nuit dans un congélateur à -80 ° C.
Remarque: Cette étape va augmenter la perméabilité de la biopsie pour la pénétration d'anticorps dans les étapes suivantes.
2. immunofluorescence
- Décongeler les tissus de 1.2.9) à la température ambiante pendant 2 - 3 h.
- un tissu de lavage dans le tube de 15 ml avec 5 ml de PBS pendant 8 heures à la température ambiante pour éliminer le composé octobre.
- Des biopsies de transfert à un tube de 2 ml, et on incube le tissu dans 1 ml de lapin anti-Keratin14 lapin ou un anticorps anti-Ki67, tous deux dilués 1: 100 dans PBST (PBS + 0,1% de Triton-X100) pendant 3 jours sur un agitateur dans une 37 ° C four.
- biopsies de transfert à un tube de 15 ml, une laver le tissu 4 fois pendant 6 heures dans 5 ml de PBST sur un agitateur dans un four à 37 °.
- biopsies de transfert à un tube de 2 ml, ajouter 1 ml anti-lapin Alexa594 anticorps secondaire dilué à 1: 100 dans du PBST et incuber 3 jours sur un agitateur dans un four à 37 °.
- Des biopsies de transfert à un tube de 15 ml et on lave 4 fois les tissus pendant 6 heures dans 5 ml de PBST sur un agitateur dans un four à 37 °.
- biopsies de transfert à un tube de 2 ml, ajouter 1 ml 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) solution nucléaire de contraste (1: 1000) dans PBST et incuber pendant la nuit sur un agitateur dans un four à 37 °.
- Enlever la solution de DAPI contre-coloration et ajouter 1 ml de PBST au tube de 2 ml pour laver le tissu 4 fois pendant 6 heures sur un agitateur dans un four à 37 °.
Remarque: L'étape facultative: Biopsies peuvent être stockés dans l'obscurité 1x PBS avec l'azoture de sodium à 0,02% pendant au moins 3 semaines.
3. Rouge Nil Staining
- Dissoudre la poudre rouge Nil dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration finale de 1 mg / ml
- Ajouter 1 pi de solution de rouge Nil à 1 ml de PBS à une concentration finale de 1 pg / ml.
- tissu Thaw de 1.2.9) à la température ambiante pendant 2 - 3 h, et laver avec 5 ml de PBS pendant 8 heures à la température ambiante.
- Transférer les biopsies à un tube de 2 ml et immerger le tissu dans 1 ml de solution de coloration rouge Nil pendant 2,5 heures à la température ambiante.
- Laver les biopsies de peau dans le tube de 2 ml avec 1 ml de PBST 4 fois pendant 30 min à température ambiante.
- Enlever la solution de PBST du tube de 2 ml, ajouter 1 ml de solution DAPI nucléaire de contre-coloration (1: 1000) dans PBST et incuber une nuit à température ambiante.
- Enlever la solution de DAPI contre-coloration, et ajoutez 1 ml de PBST dans le tube de 2 ml pour laver le tissu de la peau 4 fois pendant 6 heures à la température ambiante.
Remarque: L'étape facultative: Biopsies peuvent être stockés dans l'obscurité 1x PBS avec l'azoture de sodium à 0,02% pendant au moins 3 semaines.
4. Imaging
- Préparer la solution CUBIC2 de compensation, qui contient 50% (P / v) de saccharose, 25% (p / v) d'urée, 10% (p / v) de 2,2 ', 2' '- Nitrilotriéthanol et 0,1% (v / v) de Triton X-100.
- Laisser incuber le tissu cutané dans 1 ml de solution CUBIC2 dans un tube de 2 ml sur un agitateur pendant 24 heures dans un four à 37 ° C. Cette étape sera même l'indice de réfraction du tissu.
- Vérifier la limpidité du tissu. Une fois qu'il est clair, placer l'ensemble de la biopsie cutanée (0,2 x 0,5 cm) sur son côté le plus long sur une lamelle de verre, de telle sorte que la direction de la longueur des follicules pileux est parallèle à la surface de la lamelle couvre-objet (# 1 24 x 60 mm)
Note: Etape facultative: biopsies Antibody-colorées peuvent être stockés dans une solution de CUBIC2 pendant environ 7 jours. biopsies du Nil Rouge tachés ne peuvent être stockés dans une solution CUBIC2 jusqu'à 1 jour, et devraient être imagés dès que possible. - Préparer chambre d'imagerie (Figure 1)
Remarque: Consommables nécessaires à la préparation de la chambre d'imagerie sont: tack bleu, pâte à modeler ou similaire, et 2 lamelles (24 x 50 mm) (Figure 1A).- Préparer deux bandes minces de tack bleu (diamètre d' environ 1 mm x 2 cm), et deux lamelles (figure 1B).
- Placez des bandes collantes bleues sur un feuillet de couverture, en laissant suffisamment d' espace pour une biopsie de la peau (figure 1C). 4.4.3)
- Placer une biopsie de la peau entre les bandes sur la lamelle dans une goutte de solution CUBIC2 (figure 1C).
- Couvrir la biopsie de la peau avec la deuxième lamelle (figure 1D).
- Placez la chambre d'imagerie avec la biopsie de la peau montée sur la scène d'un microscope confocal et déplacer le tissu dans la voie de la lumière.
- Balayez l'échantillon en utilisant une source de lumière au mercure ou un halogène et les filtres à épifluorescence standards (par exemple, DAPI / GFP / CY3 / CY5) pour identifier les régions colorées par fluorescence d'intérêt.
- Régions de l' image d'intérêt en utilisant un objectif 10X et 20X (NA 0,75) et des techniques d'imagerie de fluorescence confocale standards (par exemple., Avec DAéchantillons PI teinté éclairent avec un laser de 405 nm et de recueillir le signal de fluorescence entre 425-475 nm, et avec Alexa Fluor 594 ou des échantillons du Nil rouge-colorés illuminent avec un laser 561 nm et de recueillir le signal de fluorescence entre 570-620 nm).
- Générer l' image Z-piles de chaque région d'intérêt en utilisant Z-stack logiciel d'acquisition d'images de microscope (par exemple., En utilisant des éléments NIS logiciel d' imagerie 4.13 comme décrit ci - dessous).
- Assurer la puissance laser optimale et PMT HV / Offset paramètres ont été sélectionnés pour collecter la fluorescence de l'échantillon.
- Ouvrez la barre d'outils "ND Acquisition" de "Contrôles d'acquisition".
- Sélectionnez l'onglet "Z Setup série" (assurer que tous les autres onglets sont désélectionnée).
- Lors de la numérisation en direct, se concentrer sur le haut de l'échantillon et appuyez sur la touche "Haut".
- Concentrez au fond de l'échantillon et appuyez sur le bouton "Bas".
- Taille d'entrée requise de l'étape (ou appuyez optimisé étape bouton taille).
- Préss le bouton "maintenant Run".
- Enregistrer Z-piles résultantes comme Tiff individuelle piles d'images (1 fluorochrome par image Z-stack).
- Utilisez l' image Z-piles pour reconstruire les régions de volume 3D d'intérêt en utilisant un logiciel d'analyse 3D (par exemple., En utilisant Imaris x64 7.2.3 , comme décrit ci - dessous).
- Démarrez le logiciel d'analyse.
- Choisissez le bouton "Surpass" dans la barre d'outils pour la production de volume 3D.
- Ouvrir la première image couleur Z-stack (ex., DAPI).
- Utilisez l'outil 'ajouter la chaîne' pour ajouter des canaux de couleurs supplémentaires, un canal par fluorochrome. Ainsi, un échantillon contenant à la fois DAPI et Alexa Fluor 594 fluorochromes aura besoin de deux canaux.
- Utilisez l'outil "Propriétés de l'image" pour régler correctement pixel (voxel) dimensions (XYZ), tel que déterminé à 4.7 ci-dessus.
- Utiliser l' outil "de réglage de l' affichage" pour changer les couleurs de canal selon les besoins (par exemple, régler le canal DAPI au bleu, Alexa Fluor 594 canal rouge).
- Pour poSITION le volume 3D dans la fenêtre d'image, utilisez la souris d'ordinateur pour cliquer et faire glisser le volume au besoin.
- Utilisez l'outil "Snapshot" dans la barre d'outils pour générer des captures d'écran de l'image 3D.
- Utilisez l'outil "Animation" dans la barre d'outils pour générer des films de 3D rotation de l'échantillon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Épaisseur dorsale entière des biopsies de peau de souris adultes de type sauvage ont été clarifiées, colorées avec un anticorps se liant marqueur kératinocytaire de base Keratin14 (K14) , un anticorps, et les noyaux ont été contre -colorées avec une solution de coloration DAPI (Figure 2 et le film 1).
Les noyaux DAPI positifs étaient visibles à travers l'échantillon (figure 2A, C) et K14 coloration était visible exclusivement dans la couche de base épaisse une cellule de l'épiderme interfolliculaire et présentant les glandes sébacées (astérisques noirs), la gaine externe du bulbe de follicules pileux, et les germes de cheveux secondaires (figure 2B, C), tel que publié antérieurement 9. K14 intensité de la coloration a été élevée dans l'épiderme interfolliculaire, les follicules pileux distale et les germes capillaires secondaires (astérisques blancs), et il est relativement faible dans la zone de renflement du follicule pileux (Bu dans la figure 2C). La papille dermique étaient également visibl clairemente par l' étiquetage de DAPI (flèche dans la figure 2C).
Pour visualiser les cellules proliférantes, pleine épaisseur des biopsies de peau dorsale en télogène de souris de type sauvage adultes ont été clarifiées et colorées avec un anticorps anti-Ki67, et les noyaux ont été contre avec une solution DAPI (figure 3, et Movie 2).
Kératinocytes proliférants ont été détectés dans l'épiderme interfolliculaire de base (IFE sur la figure 3C), et l'isthme (Is sur la figure 3C) des follicules pileux, mais pas dans la région de la bosse (Bu sur la figure 3C).
Pour visualiser les glandes sébacées, pleine épaisseur des biopsies de peau dorsale en anagène de souris de type sauvage adultes ont été clarifiées et colorées avec Red Nile qui marque la teneur en matières grasses des sébocytes, et les noyaux ont été contre avec une solution de coloration DAPI (Figure 4 et Movie 3). sebaceou rouge Nil positifs glandes ont été observées dans la région de l' isthme des follicules pileux (SB sur la figure 4C), montrant que le protocole CUBIQUE ne modifie pas sensiblement la morphologie de ces structures contenant des matières grasses. De façon inattendue, les cheveux des arbres ont également été marquées avec du Nil Rouge (HS à la figure 4C).
Pour visualiser les changements morphologiques dans l'épiderme des souris transgéniques YAP2-5SA-ôc exprimant une hyperactive protéine YAP mutant dans les kératinocytes basales 8, pleine épaisseur biopsies de la peau dorsale de type sauvage adulte et YAP2-5SA-ôc souris même portée transgénique ont été clarifiées et colorées avec le un anticorps anti-K14, et les noyaux ont été contre -colorées avec une solution de DAPI (Figure 5, le film et 4 (type sauvage) et du film 5 (YAP2-5SA-Ac)).
Dans la peau transgénique YAP2-5SA-Ac, l'hyperplasie de l'épiderme interfolliculaires (doubles flèches haut de la figure 4F figure 5F), qui représentent les populations de cellules souches dilatés, comme décrit précédemment 8.
Figure 1: Préparation de la Chambre Imaging. A: Consommables nécessaires à la préparation de la chambre d'imagerie sont tack bleu, pâte à modeler ou similaire, et 2 lamelles (24 x 50 mm) B:. Préparer deux bandes minces de tack bleu (diamètre d' environ 2 mm x 2 cm), et deux lamelles C:. la place tack bleu bandes sur une lamelle, en laissant assez d' espace pour la biopsie de la peau. Placez la biopsie de la peau dans une goutte de solution de CUBIC2 entre les deux bandes D:. Placer deuxième lamelle sur les bandes d'accrochage bleu pour couvrir la biopsie de la peau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: K14 / DAPI Étiquette ING de la peau dorsale en télogène de souris adultes de type sauvage reconstruction de volume 3D d'une biopsie de la peau dorsale chez télogène d'une souris de type sauvage adulte marqué avec un anticorps K14 (Rouge B, C) et DAPI contre - coloration nucléaire. (bleu A, C). K14 coloration est forte dans l'épiderme interfolliculaires (IFE), l'isthme et les glandes sébacées (astérisques noirs), et les germes de cheveux secondaires (astérisque blanc), et relativement faible dans le renflement zone (Bu). Echelle barres 50 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Ki67 Étiquetage des Dorsale peau en télogène des adultes de type sauvage souris Les reconstructions de volume 3D d'une biopsie de la peau dorsale d'une souris de type sauvage adulte marqué avec un anticorps Ki67 (Rouge B, C), et DAPI de contraste nucléaire (bleu A, C). Proliférantes Ki67 positifs kératinocytes sont évidents dans l'épiderme interfolliculaires basales (IFE), et dans la région de l'isthme (Is), mais pas dans le renflement (Bu) du follicule pileux télogène. Echelle barres 50 um.rget = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Nile Red Coloration de la peau Dorsale en anagène de souris adultes de type sauvage de reconstruction de volume 3D d'une biopsie de la peau dorsale en anagène d'une souris de type sauvage adulte marqué par Nile Red (rouge en B, C), et DAPI de contraste nucléaire (bleu. A, C). Rouge Nil coloration est visible dans les sébocytes (SB) et dans la tige du cheveu (SH). Echelle barres 50 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure5: Morphologique Anomalies dans le YAP2-5SA-ôc Épiderme Les reconstructions de volume 3D de biopsies de la peau dorsale de type sauvage adulte (A - C) et YAP2-5SA-ôc souris même portée transgénique (D - F) marquées avec un anticorps K14 (rouge. B, C nucléaire de contraste, E, F) et DAPI (bleu A, C, D, F). L'hyperplasie épidermique de l'épiderme YAP2-5SA-Ac est apparente dans l'épiderme interfolliculaires (top doubles flèches en F) et dans les follicules pileux, qui affichent les masses de cellules souches / progénitrices caractéristiques proximalement (doubles flèches inférieures à F) 8. Echelle barres 50 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Film 1. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce film.
Film 2. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce film.
Film 3. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce film.
01movie4.jpg "/>
Film 4. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce film.
Film 5. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les mécanismes de régulation contrôlant le développement de la peau et de l'homéostasie sont le plus souvent étudiées en 2D à l'aide de sectionnement des tissus et une coloration histologique ou marquage avec des anticorps, ce qui permet seulement une reconnaissance restreinte de la morphologie de la peau, des populations de cellules ou de l'expression de la protéine. Un certain nombre de méthodes ont été développées pour améliorer la visualisation de l'organisation spatiale des cellules et des protéines à une résolution cellulaire unique en 3 dimensions dans entières épidermiques supports 10-13. Certaines d'entre elles impliquent cependant la séparation de l'épiderme du derme, ce qui est techniquement difficile en particulier en utilisant la peau velue, et se traduit souvent par des dommages aux tissus et à la rupture des follicules pileux. En outre, la séparation de l'épiderme et du derme altère l'étude des interactions cellulaires et moléculaires qui se produisent entre eux au cours du développement embryonnaire et l'homéostasie tissulaire.
L'approche de montage à plat »est une autre méthode où la souris de pleine épaisseurla peau est disséquée et immunocolorée, puis clarifié en utilisant le benzoate de benzyle et l' alcool benzylique (BBBA) tout en préservant les signaux d'immunofluorescence 14. Cette méthode ne nécessite pas la séparation difficile techniquement de l'épiderme du derme. Cependant, BBBA est très toxique, il dénature certaines protéines fluorescentes, et il contamine des objectifs de microscope, ne permettant pas l'imagerie à haute résolution des échantillons requis pour étudier les interactions cellulaires et moléculaires dans les tissus.
Ce rapport décrit un protocole CUBIC 5-7 pour clarifier plein des biopsies de peau d' épaisseur de la souris de toute région anatomique désirée et de l' âge en utilisant des réactifs relativement sûrs et bon marché. Ce protocole techniquement simple permet la visualisation d'expression et la prolifération des modèles de protéines par immunofluorescence dans des biopsies de peau d'épaisseur totale DAPI en trois dimensions à la résolution d'une cellule unique, ce qui permet sans précédent et très précis quallitatifs évaluation et la quantification de l'expression de protéine, la prolifération, la morphologie des tissus et des dimensions des follicules pileux. Ce procédé est également adapté pour la visualisation des sébocytes utilisant une coloration rouge Nil, malgré l'élimination des lipides des tissus au cours de la procédure de clarification. Une limitation importante de cette méthode est la disponibilité d'anticorps efficace de liaison et permettant la visualisation de leurs protéines cibles respectives en utilisant ce processus de clarification de la peau. En outre, les fichiers d'images et de films générés sont grandes, et de bonnes ressources informatiques tels que les ordinateurs équipés de processeurs puissants et un grand espace de stockage de données sont essentielles.
Une étape critique dans la procédure est la préparation des biopsies de la peau. Pour visualiser les follicules pileux intacts anatomie, l'orientation de la biopsie de peau doit être prise en compte, et la longueur des biopsies doit être coupée parallèlement à la direction de la longueur des follicules pileux. En outre, les petites et très mince skin biopsies sont difficiles à monter correctement pour la microscopie. Grandes biopsies, il faudra plus de temps pour effacer, et peuvent entraîner des problèmes de pénétration d'anticorps résultant dans des objets de détection de l'antigène. Il est donc conseillé de couper, clair et taches multiples biopsies par expérience.
Il est également important de sceller hermétiquement les tubes tout en préparant les solutions CUBES pour empêcher l'évaporation du contenu pendant le processus de chauffage, ce qui entraîne des changements dans les concentrations de réactifs et peuvent causer la compensation tissulaire altérée. La prochaine étape importante est que le tissu sera clarifié à 37 ° C pour accélérer le processus de compensation. Après 7 jours, la solution de CUBIC1 devra être préparé frais pour remplacer l'ancien.
À l'avenir, plus d'anticorps seront identifiés qui sont compatibles avec la peau procédure de clarification CUBIC, et les analyses peuvent être étendues à la visualisation et la quantification de l'épiderme et des mélanocytes (tige) marqueur de cellules et dermiques protéines. Cette technique va également jouer un rôle fondamental dans les études 3D de la pathologie et de l'anatomie peau, et l'aide dans l'élucidation des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la biologie de l'épiderme anormal et normal dans la peau de souris mutantes et modèles transgéniques journaliste de souris, y compris les interactions de signalisation entre le derme et l'épiderme.
Le protocole CUBIC 5-7 est susceptible d'être applicable à la peau des autres modèles animaux vertébrés, et de biopsies de la peau humaine. Fiche microscopie optique permettra la visualisation de l'épiderme anatomie, les profils d'expression de la protéine, et la progression des étapes du cycle du follicule pileux dans les plus grands échantillons de peau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions Australian Bio-Resources (Garvan Institute, Australie), le Centre de ressources biologiques (UNSW Australie) et le soin des animaux et Comité d'éthique pour le soutien à l'expérimentation animale. Ce travail a été soutenu par le Conseil national de la santé et de la recherche médicale de l'Australie (Grant Project APP1062720). Dr. Cesar P. Canales est récipiendaires d'une bourse CONICYT-Becas Chile (# 72101076). M. Bassem Akladios est récipiendaire du Prix international de l'Université d'études supérieures par UNSW Australie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 - Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
- Fuchs, E.
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
