Summary
ويصف هذا التقرير بروتوكول مكعب الى توضيح كامل خزعات الجلد سماكة الماوس، وتصور أنماط التعبير البروتين، والخلايا المتكاثرة، وsebocytes في قرار خلية واحدة في 3D. تمكن هذه الطريقة تقييم دقيق لعلم التشريح وعلم الأمراض الجلدية، ومن الظواهر البشرة غير طبيعية في خطوط الماوس المعدلة وراثيا.
Abstract
الجلد هو ضروري لبقائنا. تتكون طبقة البشرة الخارجية للبشرة البيني، وهو ظهارة الحرشفية الطبقية التي تغطي معظم الجسم، والزوائد البشرة مثل بصيلات الشعر والغدد العرقية. البشرة يخضع تجديد في جميع مراحل الحياة، واستجابة لإصابات. يتم تمكين هذا عن طريق K14، معربا عن القاعدية البشرة السكان الجذعية / خلايا السلف التي تنظم بإحكام من قبل آليات تنظيمية متعددة نشطة داخل البشرة وبين البشرة والأدمة. توضح هذه المقالة طريقة بسيطة لتوضيح كامل خزعات الجلد سماكة الماوس، وتصور أنماط التعبير البروتين K14، Ki67 المعنون باسم الخلايا المتكاثرة، وصفت النيل الأحمر sebocytes، ووضع العلامات النووي دابي في قرار خلية واحدة في 3D. تمكن هذه الطريقة تقييم دقيق وتقدير من الجلد التشريح وعلم الأمراض، ومن الظواهر البشرة غير طبيعية في خطوط الماوس المعدلة وراثيا. بروتوكول CUBIC هو اله أفضل وسيلة متاحة حتى الآن لتحقيق التفاعلات الجزيئية والخلوية في خزعات الجلد سمك كامل في قرار خلية واحدة.
Introduction
الجلد هو ضروري لبقائنا. وهو يتألف من ثلاث طبقات رئيسية البشرة الخارجية، الأدمة واللحمة. البشرة هي الأنسجة التجدد للغاية. وهو ظهارة طبقية الحرشفية، وتتألف في معظمها من الخلايا الكيراتينية. يولدون الخلايا الكيراتينية في الطبقة القاعدية، والتحرك صعودا من خلال طبقات suprabasal بينما التفريق، وفي نهاية المطاف يتم تسليط هم في الطبقة الخارجية متقرن بعد حوالي شهر من ولادتهم. البشرة تطور عدد من الزوائد بما في بصيلات الشعر والغدد الدهنية. تجديد بصيلات الشعر أيضا بطريقة الدوري في جميع مراحل الحياة 1. يتم تمكين القدرة التجديدية للبشرة بسبب وجود الخلايا الجذعية والسلف التي تقع في الطبقة القاعدية من البشرة البيني وبصيلات الشعر 2.
قد تورطت العديد من مسارات إشارات في التنمية البشرة وتجديدها. بعض هذه تحدث داخلالبشرة فقط، مثل مسار القنفذ. الأحداث يشير أخرى تجري بين الأدمة والبشرة 3. على سبيل المثال، يعتقد أن إشارات WNT من الأدمة إلى أن تكون مهمة لتنمية بصيلات الشعر، وتفرز من قبل الحليمة الأدمية في بداية طور التنامي لتنشيط بصيلات الشعر انتفاخ الجذعية / السلف خلية تكاثر ونمو بصيلات الشعر (4). من المهم أن نفهم الآليات الخلوية والجزيئية التي تتحكم في تطوير البشرة وتجديد لفهم أفضل لكيفية أنها قد تكون منزعجة في أمراض الجلد التجدد مثل سرطان الجلد.
توضح هذه المقالة لير C، B nobstructed يو المطر أنا الكوكتيلات maging وتحليل omputational (المكعب) بروتوكول C 5-7 لتوضيح كامل الاستعدادات الجلد جبل، وتصور أنماط التعبير البروتين في 3 أبعاد على قرار خلية واحدة بواسطة المجهر متحد البؤر. الأسلوب ينطوي على CUBIC غمر الجلدالأنسجة في اثنين من زجاجات المواد الكيميائية على أساس aminoalcohol. هذه الحلول ضبط مؤشرات الانكسار في عينة من الجلد، وترك الأنسجة شفافة والبروتينات سليمة، مما يسمح للمناعي في قرار خلية واحدة.
باستخدام هذا البروتوكول مكعب، والقاعدية وتكاثر السكان القرنية في البشرة البيني وفي بصيلات الشعر وتصويرها في الخزعات سماكة الجلد كامل من الفئران wildtype باستخدام مكافحة Keratin14 (K14) وأضداد Ki67. وتصور الغدد الدهنية في خزعات الجلد wildtype أيضا باستخدام النيل الأحمر تلطيخ. وأخيرا، تمت مقارنة السكان الخلايا الكيراتينية القاعدية في wildtype والمفرطة التصنع خزعات الجلد YAP2-5SA-ΔC 8.
يتيح هذا البروتوكول CUBIC التقييم البصري للتعبير البروتين في خزعات الجلد سمك كامل في قرار وحيد الخلية، وأداة مهمة لتقدير التشريح ابيديرمي epidermal والعيوب الشكلية في جلد معدلة وراثياالفئران، والتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء تطوير البشرة وتجديدها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أخلاقيات الإعلان: جميع الإجراءات التي تجرى على الحيوانات يتبع المبادئ التوجيهية للجنة الرعاية والأخلاق الحيوانية (ACEC) في نيو ساوث ويلز أستراليا تحت وافق بروتوكول ACEC 13 / 64B.
1. إعداد وشفافة ماوس الجلد الأنسجة
ملاحظة: وكانت جميع الفئران المستخدمة في هذه الدراسة على C57BL / 6 الخلفية الوراثية
- مجموعة من أنسجة الجلد الماوس.
- إنسانية الموت ببطء الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم.
- إزالة بعناية الشعر من منطقة الجلد ذات الصلة مع الانتهازي مع الحرص على عدم جرح الجلد.
- غسل البشرة ليطهر مع 70٪ من الإيثانول في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- رفع جلد الرقبة الظهري مع ملقط وجعل شق بالمقص.
- تشريح مساحة كبيرة من الجلد الظهري الماوس (حوالي 1.5 × 4 سم).
- تتسطح على جانب الأدمة الجلد لأسفل على ورق الترشيح، وجعل علما التوجه الأمامي الخلفي من العينة.
- ثلاثيورقة م مرشح في جميع أنحاء الجلد تشريح، ومكان في أنبوب 15 مل مليئة الطازجة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) حل في برنامج تلفزيوني.
- إصلاح لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في الثلاجة على 4 درجات مئوية.
- غسل الجلد 2 × 5 دقائق في برنامج تلفزيوني في أنبوب 15 مل.
ملاحظة: وفيما يلي (1.1.10 - 1.1.12) هي الخطوات الاختيارية للتخزين على المدى الطويل من الأنسجة. - يذوى الجلد تشريح في برنامج تلفزيوني مع زيادة تركيز الإيثانول (25٪، 50٪ 70٪) في أنبوب 15 مل خلال خطوات غسل 1-ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تخزين البشرة بالجفاف في 70٪ من الإيثانول في برنامج تلفزيوني في أنبوب 15 مل عند 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
- قبل 4 ساعات المقاصة وترطيب أنسجة الجلد في برنامج تلفزيوني مع تناقص تركيز الإيثانول (70٪، 50٪، 25٪، 0٪) في أنبوب 15 مل خلال خطوات غسل 1-ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تطهير خزعات الجلد الماوس
- إعداد الحل CUBIC1 المقاصة عن طريق إذابة 3.85 ز اليوريا و3.85 ز ن، ن، ن '، N'-tetrakis (2-هيدروكسي) الإيثيلين في 5.38 مل من الماء المقطر على سخان المقرر أن 60-70 درجة مئوية. استخدام النمام الساخن.
- إضافة 2.31 ز البولي ايثيلين جلايكول الأحادي ف isooctylphenyl الأثير / تريتون X-100 إلى الحل مرة واحدة فمن الواضح وتبريده إلى درجة حرارة الغرفة.
- قطع الجلد الماوس بشفرة حلاقة حادة في الخزعات الأبعاد التقريبية 0.2 X 0.5 سم، ويغرق في 5 مل من محلول CUBIC1 المقاصة في أنبوب 15 مل. لتحسين التصور من بصيلات الشعر، تأكد من أن الجانب الأطول من الخزعة هو قطع على طول اتجاه انتيرو الخلفي من العينة.
- وضع على منصة دوارة في فرن التهجين عند 37 درجة مئوية.
- تغيير الحل المقاصة بعد 7 أيام. يعد حل CUBIC1 الطازجة قبل استخدامها.
- تحقق الشفافية في الأنسجة بعد 7 أيام. إذا لزم الأمر، وترك الخزعات في CUBIC1 حل المقاصة حتى الأنسجة شفافة تماما.
- مرة واحدة في خزعة الجلد شفافا،إزالة حل CUBIC1، وإضافة 4 مل من 1 × برنامج تلفزيوني لغسل الأنسجة 4 مرات عن 6 ساعات عند 37 درجة مئوية.
- غسل أنسجة الجلد في 20٪ ث / السكروز الخامس في برنامج تلفزيوني في أنبوب 15 مل لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية.
- تجميد الأنسجة في تصاعد متوسطة مجمع الأمثل قطع درجة الحرارة (أكتوبر) في أنبوب 15 مل بين عشية وضحاها في الثلاجة -80 درجة مئوية.
ملاحظة: هذه الخطوة سوف تزيد من نفاذية خزعة لاختراق الأجسام المضادة في الخطوات اللاحقة.
2. المناعي تلطيخ
- ذوبان الجليد الأنسجة من 1.2.9) إلى درجة حرارة الغرفة ل2-3 ساعة.
- غسل الأنسجة في أنبوب 15 مل مع 5 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 8 ساعات في درجة حرارة الغرفة لإزالة أكتوبر مجمع.
- الخزعات نقل إلى أنبوب 2 مل، واحتضان الأنسجة في 1 مل أرنب مكافحة Keratin14 أو أرنب مكافحة Ki67 الأجسام المضادة، سواء المخفف 1: 100 في PBST (PBS + 0.1٪ تريتون-X100) لمدة 3 أيام على شاكر في 37 ° C الفرن.
- الخزعات نقل إلى 15 مل أنبوب، لالثانية غسل الأنسجة 4 مرات عن 6 ساعات في 5 مل من PBST على شاكر في 37 درجة مئوية الفرن.
- الخزعات نقل إلى أنبوب 2 مل، إضافة 1 مل المضادة للأرنب Alexa594 الأجسام المضادة الثانوية المخفف 1: 100 في PBST واحتضان 3 أيام على شاكر في 37 درجة مئوية الفرن.
- الخزعات نقل إلى أنبوب 15 مل، وغسل الأنسجة 4 مرات عن 6 ساعات في 5ML من PBST على شاكر في 37 درجة مئوية الفرن.
- الخزعات نقل إلى أنبوب 2 مل، إضافة 1 مل 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) حل النووي مباين (1: 1000) في PBST واحتضان بين عشية وضحاها على شاكر في 37 درجة مئوية الفرن.
- إزالة دابي حل counterstaining، وإضافة 1 مل من PBST إلى أنبوب 2 مل لغسل الأنسجة 4 مرات عن 6 ساعات على شاكر في 37 درجة مئوية الفرن.
ملاحظة: خطوة اختيارية: يمكن تخزين التحليلات في الظلام في برنامج تلفزيوني 1X مع 0.02٪ أزيد الصوديوم لمدة 3 أسابيع على الأقل.
3. النيل الأحمر تلطيخ
- حل مسحوق النيل الأحمر في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى تركيز النهائي من 1 مز / مل
- إضافة 1 ميكرولتر حل النيل الأحمر إلى 1 مل برنامج تلفزيوني إلى تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل.
- الأنسجة ذوبان الجليد من 1.2.9) إلى درجة حرارة الغرفة ل2-3 ساعة، ويغسل مع 5 مل برنامج تلفزيوني لمدة 8 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
- نقل الخزعات إلى أنبوب 2 مل، وغمر الأنسجة في 1 مل النيل الأحمر حل تلطيخ لمدة 2.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل خزعات الجلد في أنبوب 2 مل مع 1 مل PBST 4 مرات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة حل PBST من أنبوب 2 مل، إضافة 1 مل من محلول دابي النووي counterstaining (1: 1000) في PBST واحتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة دابي حل counterstaining، وإضافة 1ml من PBST في أنبوب 2 مل لغسل أنسجة الجلد 4 مرات عن 6 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: خطوة اختيارية: يمكن تخزين التحليلات في الظلام في برنامج تلفزيوني 1X مع 0.02٪ أزيد الصوديوم لمدة 3 أسابيع على الأقل.
4. التصوير
- إعداد الحل CUBIC2 المقاصة، الذي يحتوي على 50٪ (ث / ت) السكروز، 25٪ (ث / ت) اليوريا، و 10٪ (ث / ت) 2،2 '، 2' '- nitrilotriethanol، و 0.1٪ (ت / ت) تريتون X-100.
- احتضان أنسجة الجلد في 1 مل حل CUBIC2 في أنبوب 2 مل على شاكر لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية الفرن. وهذه الخطوة حتى معامل الانكسار من الأنسجة.
- تحقق من وضوح الأنسجة. مرة واحدة فمن الواضح، ضع خزعة الجلد بأكمله (0.2 X 0.5 سم) على الجانب الأطول لها على ساترة الزجاج، بحيث يكون اتجاه طول بصيلات الشعر موازية للسطح ساترة (رقم 1 24 × 60 مم)
ملاحظة: خطوة اختيارية: يمكن تخزين الخزعات ملطخة الأجسام المضادة في حل CUBIC2 لمدة 7 أيام. لا يمكن إلا أن الخزعات الملون الأحمر النيل يتم تخزينها في حل CUBIC2 لمدة تصل إلى 1 في اليوم، ويجب تصويرها في أقرب وقت ممكن. - إعداد غرفة التصوير (الشكل 1)
ملاحظة: المواد الاستهلاكية المطلوبة لإعداد غرفة التصوير هي: تك الأزرق، ولعب العجين أو ما شابه ذلك، و 2 coverslips (24 × 50 ملم) (Figure 1A).- إعداد اثنين من شرائح رقيقة من تك الأزرق (قطر حوالي 1 ملم × 2 سم)، واثنين من coverslips (الشكل 1B).
- وضع شرائط تك زرقاء على غطاء واحد الانزلاق، مما يتيح مساحة كافية لخزعة الجلد (الشكل 1C). 4.4.3)
- وضع خزعة الجلد بين شرائح على ساترة في قطرة من حل CUBIC2 (الشكل 1C).
- تغطية خزعة الجلد مع ساترة الثانية (1D الشكل).
- وضع غرفة التصوير مع خزعة الجلد التي شنت على خشبة المسرح المجهر متحد البؤر ونقل الأنسجة في مسار الضوء.
- مسح العينة باستخدام الزئبق أو الهالوجين مصدر الضوء والمرشحات epifluorescence القياسية (على سبيل المثال، دابي / GFP / CY3 / CY5) لتحديد المناطق الملون fluorescently من الفائدة.
- المناطق صورة من الاهتمام باستخدام الهدف 10X 20X و(NA 0.75) وتقنيات التصوير متحد البؤر مضان القياسية (على سبيل المثال، مع DAPI الملون عينات تضيء مع ليزر 405 نانومتر، وجمع إشارة مضان بين 425-475 نانومتر، ومع فلور اليكسا 594 أو عينات الملون الأحمر النيل تضيء مع ليزر 561 نانومتر، وجمع إشارة مضان بين 570-620 نانومتر).
- توليد صورة Z-أكوام من كل منطقة من الاهتمام باستخدام المجهر Z كومة برنامج الحصول على الصور (على سبيل المثال، باستخدام عناصر شيكل التصوير البرمجيات 4.13 كما هو موضح أدناه).
- تم اختيارها ضمان قوة الليزر الأمثل وPMT HV / الأوفست الإعدادات لجمع عينة مضان.
- فتح "ND اقتناء" شريط الأدوات من "الضوابط اقتناء".
- حدد "إعداد سلسلة Z" علامة التبويب (ضمان كافة علامات التبويب الأخرى غير محددة).
- أثناء المسح الحية، والتركيز على الجزء العلوي من العينة والضغط على "أعلى" زر.
- التركيز على الجزء السفلي من العينة واضغط على زر "أسفل".
- المدخلات المطلوبة حجم الخطوة (أو اضغط على المفتاح الأمثل خطوة زر حجم).
- قبلSS "تشغيل الآن" زر.
- حفظ الناتجة Z-مداخن كما مداخن صورة المشاجرة الفردية (1 تألقي في صورة Z كومة).
- استخدام صورة Z-مداخن لإعادة بناء المناطق حجم 3D ذات الاهتمام باستخدام برامج التحليل 3D (على سبيل المثال، باستخدام Imaris إلى x64 7.2.3 كما هو موضح أدناه).
- بدء برنامج التحليل.
- اختيار "تفوق" زر في شريط الأدوات لتوليد حجم 3D.
- فتح أول صورة ملونة Z المكدس (على سبيل المثال، دابي).
- استخدام "إضافة قناة" أداة لإضافة قنوات اللون إضافية، قناة واحدة لكل تألقي. وهكذا عينة تحتوي على كل دابي واليكسا فلور 594 fluorochromes سيتطلب قناتين.
- استخدام "خصائص الصورة" أداة لضبط بكسل الصحيح (فوكسل) الأبعاد (XYZ)، كما هو محدد في 4.7 أعلاه.
- استخدام أداة "تعديل العرض" لتغيير الألوان قناة حسب الحاجة (على سبيل المثال، تعيين قناة دابي إلى اللون الأزرق، اليكسا فلور 594 قناة لأحمر).
- إلى بوsition حجم 3D في نافذة الصورة، استخدام فأرة الكمبيوتر لانقر وحجم السحب على النحو المطلوب.
- استخدام "لقطة" أداة في شريط الأدوات لتوليد لقطات الشاشة من صورة 3D.
- استخدام "الرسوم المتحركة" أداة في شريط الأدوات لتوليد أفلام من عينة دوران 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم توضيح كامل خزعات الجلد سماكة ظهري من الفئران wildtype الكبار، ملطخة الأجسام المضادة ملزمة القاعدية القرنية علامة Keratin14 (K14)، وكانت counterstained نوى مع دابي تلطيخ حل (الشكل 2 وفيلم 1).
كانت نواة دابي إيجابية واضحة في جميع أنحاء عينة (الشكل 2A، C)، وكان K14 تلطيخ مرئية حصرا في خلية واحدة طبقة القاعدية سميكة من البشرة البيني، وتحديد الغدد الدهنية (النجمة السوداء)، والأغماد الجذر الخارجي بصيلات الشعر، والجراثيم الشعر الثانوية (الشكل 2B، C)، كما تنطبق 9. وكانت K14 تلطيخ كثافة عالية في البشرة البيني، والبعيدة بصيلات الشعر والجراثيم الشعر الثانوية (النجمة البيضاء)، وأنه كان منخفضا نسبيا في المنطقة انتفاخ في بصيلات الشعر (بو في الشكل 2C). كان الحليمات الجلدية أيضا للعيان بشكل واضحه من خلال وضع العلامات دابي (السهم في الشكل 2C).
لتصور الخلايا المتكاثرة، سمك الكامل خزعات الجلد الظهري في تساقط الشعر لدى الفئران wildtype الكبار تم توضيح والملون مع الأجسام المضادة لمكافحة Ki67، وكانت counterstained نوى مع دابي الحل (الشكل 3، وفيلم 2).
تم الكشف عن الخلايا الكيراتينية المنتشرة في البشرة بين الجريبات القاعدية (IFE في الشكل 3C)، وفي البرزخ (هل في الشكل 3C) من بصيلات الشعر، ولكن ليس في المنطقة انتفاخ (بو في الشكل 3C).
لتصور الغدد الدهنية، وسمك الكامل خزعات الجلد الظهري في طور التنامي من الفئران wildtype الكبار تم توضيح وملطخة النيل الأحمر التي تصف محتوى الدهون من sebocytes، وكانت counterstained نوى مع حل تلطيخ دابي (الشكل 4 و فيلم 3). sebaceou النيل الأحمر إيجابيةوقد لوحظت الصورة الغدد في منطقة برزخ بصيلات الشعر (SB في الشكل 4C)، وتبين أن بروتوكول CUBIC لا تؤثر تأثيرا كبيرا على التشكل من هذه الهياكل التي تحتوي على الدهون. بشكل غير متوقع، وصفت مهاوي الشعر أيضا مع النيل الأحمر (HS في الشكل 4C).
لتصور التغيرات الشكلية في البشرة من YAP2-5SA-ΔC الفئران المعدلة وراثيا معربا عن مفرط البروتين ياب متحولة من الخلايا الكيراتينية القاعدية 8، وقد تم توضيح سمك الكامل الخزعات ظهري الجلد من wildtype الكبار وYAP2-5SA-ΔC الفئران المعدلة وراثيا littermate وملطخة مع تم counterstained مكافحة K14 الأجسام المضادة، ونوى مع حل دابي (الشكل 5، والفيلم 4 (wildtype) وفيلم (5 YAP2-5SA-ΔC)).
في الجلد المعدلة وراثيا YAP2-5SA-ΔC، وتضخم البشرة البيني (رأس السهم المزدوج في الشكل 4F الشكل 5F)، التي تمثل الموسع السكان الخلايا الجذعية، كما هو موضح سابقا 8.
الشكل 1: إعداد غرفة التصوير. A: المواد الاستهلاكية المطلوبة لإعداد غرفة التصوير هي تك الأزرق، ولعب العجين أو ما شابه ذلك، و 2 coverslips (24 × 50 ملم) ب: إعداد اثنين من شرائح رقيقة من تك الأزرق (قطر حوالي 2 مم × 2 سم)، و اثنين coverslips C: مكان شرائط تك الأزرق على غطاء واحد الانزلاق، مما يتيح مساحة كافية لخزعة الجلد. وضع خزعة الجلد في قطرة من حل CUBIC2 في بين شرائح اثنين D: مكان ساترة الثانية على شرائط تك الزرقاء لتغطية خزعة الجلد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: K14 / دابي تسمية جي من جلد ظهري في طور الراحة من الفئران الكبار Wildtype إعادة الإعمار 3D حجم خزعة ظهري الجلد في طور الراحة من ماوس wildtype الكبار المسمى مع الأجسام المضادة K14 (الأحمر في B، C)، ومباين النووية دابي. (الأزرق في A، C). K14 تلطيخ قوية في البشرة البيني (IFE)، والبرزخ والغدد الدهنية (النجمة السوداء)، والجراثيم الشعر الثانوية (النجمة البيضاء)، والانخفاض النسبي في انتفاخ المنطقة (بو). على نطاق ويمنع 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: Ki67 وصفها في ظهري الجلد في طور الراحة من الكبار Wildtype الفئران إعادة البناء حجم 3D من خزعة ظهري الجلد من الماوس wildtype الكبار المسمى مع الأجسام المضادة Ki67 (الأحمر في B، C)، ومباين النووية دابي (الأزرق في A، C). المتكاثرة Ki67 إيجابية الخلايا الكيراتينية واضحة في البشرة بين الجريبات القاعدية (IFE)، وفي منطقة البرزخ (هل)، ولكن ليس في انتفاخ (بو) من بصيلات الشعر في طور الراحة. على نطاق ويمنع 50 ميكرون.r يمكنك الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النيل الأحمر تلون الجلد الظهرية في طور التنامي من الفئران الكبار Wildtype إعادة الإعمار 3D حجم خزعة ظهري الجلد في طور التنامي من ماوس wildtype الكبار المسمى مع النيل الأحمر (الأحمر في B، C)، ومباين النووية دابي (الأزرق في. A، C). النيل الأحمر تلطيخ مرئيا في sebocytes (SB) وفي جذع الشعرة (HS). على نطاق ويمنع 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل5: المورفولوجية شذوذ في YAP2-5SA-ΔC البشرة إعادة البناء حجم 3D من الخزعات ظهري الجلد من wildtype الكبار (A - C) وYAP2-5SA-ΔC الفئران المعدلة وراثيا littermate (D - F) المسمى مع الأجسام المضادة K14 (الأحمر في. B، C، E، F)، ودابي مباين النووية (الأزرق في A، C، D، F). وتضخم البشرة للبشرة YAP2-5SA-ΔC هو واضح في البشرة البيني (رأس الأسهم المزدوجة في F) وفي بصيلات الشعر، والتي تعرض الجماهير الخلايا الجذعية / السلف مميزة قريب (الأسهم المزدوجة أقل في واو) 8. على نطاق ويمنع 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم 1. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيلم.
فيلم 2. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيلم.
فيلم 3. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيلم.
01movie4.jpg "/>
فيلم 4. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الآليات التنظيمية السيطرة على تنمية الجلد والتوازن هي الأكثر شيوعا درس في 2D باستخدام باجتزاء الأنسجة وتلطيخ النسيجي أو وضع العلامات مع الأجسام المضادة، والتي تمكن فقط من التقدير محدودة من التشكل الجلد، سكان الخلية أو تعبير البروتين. وقد تم تطوير عدد من الطرق لتحسين التصور من التنظيم المكاني للخلايا والبروتينات في قرار خلية واحدة في 3 أبعاد في البشرة يتصاعد كلها 10-13. ولكن بعض هذه تنطوي على انفصال البشرة عن الأدمة، والذي يشكل تحديا تقنيا وخاصة باستخدام الجلد شعر، وغالبا ما يؤدي إلى تلف الأنسجة وتمزق في بصيلات الشعر. أيضا، والفصل بين البشرة والأدمة يعوق دراسة التفاعلات الخلوية والجزيئية التي تحدث بينهما أثناء التطور الجنيني وتوازن الأنسجة.
«المنهج جبل مسطح" هو طريقة أخرى حيث الماوس سمك الكامليتم تشريح الجلد وimmunostained، ومن ثم توضيح استخدام بنزوات البنزيل والبنزيل الكحول (BBBA) مع الحفاظ على إشارات مناعي 14. لا يتطلب هذا الأسلوب الفصل تحديا تقنيا من البشرة من الأدمة. ومع ذلك، BBBA شديدة السمية، فإنه يبدل طبيعة بعض البروتينات الفلورية، وأنه يلوث أهداف المجهر، وعدم السماح للالتصوير ذات الدقة العالية من العينات المطلوبة للتحقيق في التفاعلات الخلوية والجزيئية في الأنسجة.
ويصف هذا التقرير بروتوكول CUBIC 5-7 لتوضيح كامل خزعات الجلد سمك الماوس من أي منطقة تشريحية المطلوبة والعمر باستخدام الكواشف آمنة ورخيصة نسبيا. يسمح هذا البروتوكول بسيط من الناحية الفنية التصور التعبير وانتشار أنماط البروتين المناعي في خزعات الجلد كامل سماكة counterstained مع دابي في ثلاثة أبعاد على قرار خلية واحدة، مما لم يسبق له مثيل، ودرجة عالية من الدقة التأهيليةتقييم itative النوعي والكمي لتعبير البروتين، والانتشار، مورفولوجيا الأنسجة وأبعاد بصيلات الشعر. هذا الأسلوب هو أيضا مناسبة لرؤية sebocytes باستخدام النيل الأحمر تلطيخ على الرغم من إزالة الأنسجة الشحمية أثناء إجراء التوضيح. قيود هاما من هذا الأسلوب هو توافر الأجسام المضادة ملزمة بكفاءة والسماح التصور من البروتينات الهدف منهما باستخدام هذه العملية توضيح الجلد. وبالإضافة إلى ذلك، الصورة والأفلام الملفات التي تم إنشاؤها كبيرة، وموارد تكنولوجيا جيدة مثل أجهزة الكمبيوتر مع معالجات قوية ومساحة واسعة لتخزين البيانات ضرورية.
خطوة حاسمة في هذا الإجراء هو إعداد خزعات الجلد. لتصور سليمة تشريح بصيلات الشعر، ينبغي أن تؤخذ في اتجاه خزعة الجلد في الاعتبار، وطول الخزعات يجب أن تقطع مواز لاتجاه طول بصيلات الشعر. وبالإضافة إلى ذلك، التزلج الصغيرة ورقيقة جدان الخزعات هي صعبة لتركيب بشكل صحيح للفحص المجهري. والخزعات أكبر تتطلب المزيد من الوقت لمسح، وقد تستلزم مشاكل اختراق الأجسام المضادة الناتجة في المصنوعات اليدوية كشف مستضد. ولذلك فمن المستحسن أن يقطع، واضحة وصمة عار خزعات متعددة في التجربة.
ومن المهم أيضا أن يختم بإحكام الأنابيب أثناء إعداد حلول مكعب لمنع التبخر من محتويات أثناء عملية التسخين، مما يؤدي إلى تغييرات في تركيزات كاشف ويمكن أن يسبب ضعف المقاصة الأنسجة. الخطوة التالية المهمة هي أن الأنسجة وسيتم توضيح عند 37 درجة مئوية لتسريع عملية المقاصة. بعد 7 أيام، وسوف تحتاج إلى أن تكون مستعدة جديدة لتحل محل القديمة الحل CUBIC1.
في المستقبل، وسوف يتم تحديد المزيد من الأجسام المضادة التي تتوافق مع الجلد CUBIC الإجراء التوضيح، ويجوز تمديدها تحليلات لتصور وتقدير من البشرة والخلايا الصباغية (الجذعية) علامة الخليةالصورة والجلد البروتينات. وهذه التقنية أيضا أن تلعب دورا أساسيا في الدراسات 3D من أمراض الجلد والتشريح، والمساعدة في توضيح من الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة غير طبيعي وعادي البيولوجيا البشرة في الجلد من الفئران الطافرة ونماذج مراسل الماوس المعدلة وراثيا، بما في ذلك إشارات التفاعلات بين الأدمة و البشرة.
ومن المرجح أن تكون قابلة للتطبيق على الجلد من النماذج الحيوانية الفقاريات الأخرى، والخزعات لكمة الجلد البشري بروتوكول CUBIC 5-7. وضوء ورقة المجهر تمكين التصور التشريح البشرة، وأنماط التعبير البروتين، وتطور مراحل دورة بصيلات الشعر في عينات الجلد بشكل اكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر استراليا بيو الموارد (معهد جارفان، أستراليا)، ومركز الموارد البيولوجية (نيو ساوث ويلز أستراليا) ورعاية الحيوان وجنة الأخلاقيات لدعم مع التجارب على الحيوانات. وأيد هذا العمل من قبل المجلس الوطني للصحة والأبحاث الطبية من استراليا (مشروع غرانت APP1062720). الدكتور سيزار P. كاناليس غير المستفيدين من منحة دراسية CONICYT-Becas شيلي (# 72101076). السيد باسم Akladios هي المستفيدة من جائزة الدراسات العليا الدولية جامعة نيو ساوث ويلز من أستراليا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 - Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
- Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
