Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

נחישות כימות המינים בשנת תערובות שימוש ספקטרומטריית מסה MRM של פפטידים יישומית כדי אימות בשר

doi: 10.3791/54420 Published: September 20, 2016

Protocol

1. Proteolysis וניתוח של הפניה Myoglobins

  1. Proteolysis של myoglobins הפניה
    1. הכינו פתרונות של myoglobins התייחסות מטוהרים (טווח 0.2 - 0.5 מ"ג / מ"ל ב אמוניום ביקרבונט 25 מ"מ) 3.
    2. העברת 1 מ"ל aliquots של כל דגימה 2 מ"ל צינורות צנטריפוגות.
    3. תרמית לפגל את החלבונים שחולצו על ידי חימום המדגם בתוך גוש חם ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מצננים את המדגם עבור כ -15 דקות עד שהוא מגיע לטמפרטורת החדר. הוסף 30 מ"ג של אוריאה (ריכוז סופי 0.5 M) כדי לשפר את העיכול, ואז לערבב.
  2. proteolysis tryptic
    1. הכן פתרון 1 מ"ג / מ"ל ​​של טריפסין ב אמוניום ביקרבונט 25 מ"מ ולאחסן על הקרח כנדרש. הוספת נפח מספיק של טריפסין כך פעילות האנזים הסופי הוא 420 BAEE (בנזואיל-L-arginine N- hydrochloride אתיל אסתר) יחידות / מ"ג חלבון חילוץ, ואז לערבב ידי vortexing עדין ולאפשר proteolyze לילה בשעה 37 ° C.
    2. לבצע ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-PAGE) 17 כדי להדגים את השלמות של proteolysis.
  3. Desalting של המדגם-proteolysis פוסט
    1. לדלל את המדגם 1: 2 v: v עם מים.
    2. הפעל מחסנית התהפכה פאזיים פולימריים (RP) מלאים בחומר RP 30 מ"ג על ידי הוספת 1 מ"ל של מתנול, ולאחר מכן לאזן את המחסנית על ידי הוספת חומצה 1 מ"ל של 1% פורמית.
    3. טען את המדגם על המחסנית תחת כובד.
    4. לשטוף עם 1 מ"ל של חומצה פורמית מתנול 5% / 1% תחת הכובד.
    5. Elute פפטידים עם 1 מ"ל של אצטוניטריל / מים (90:10 v: v; 0.1% חומצה פורמית) תחת הכבידה לתוך 2 מ"ל צינורות microcentrifuge מלא מראש עם 5 μl dimethylsulphoxide (DMSO).
    6. הסר את הממס תחת ואקום ב 50 מעלות צלזיוס באמצעות המאייד צנטריפוגלי עבור 120 דקות, ולאחר מכן redissolve שאריות 250 μl אצטוניטריל / מים (3:97 v: v; 0.1% חומצה פורמית).
    7. לְהַעֲבִירפתרון בקבוקון סמפלר אוטומטי נמוך נפח.
      הערה: דוגמאות ניתן לאחסן ב 4 ° C עד מוכן ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה נוזלית (LC / MS) ניתוח.
  4. דור של רשימות מעבר MRM
    1. אתר את רצפי מיוגלובין עבור בשרים שונים ממסד הנתונים UniProt.
    2. הזן את רצפי מיוגלובין לתיבה 'היעד' של התוכנה תחזית פפטיד מעבר (למשל, קו רקיע). במידת הצורך, תרחף מעל פפטיד לחשוף רשימת שבר שלה.
    3. לחץ על 'הגדרות' ובחר 'הגדרות פפטיד'. הזן את ההעדפות לעיכול (כלומר, טריפסין) ומספר השסעים החמיצו (0). הזן את הבחירה הנדרשת פרמטרים נוספים, בפרט, אורך פפטיד (6 - 25), הכללות N-terminal (0) והניחו שינויים חומצת אמינו (ללא).
    4. לחץ על 'הגדרות' ובחר 'מעבר הגדרות'. בחר את ההעדפותסוג המכשיר המשמש בניתוח LC / MS.
    5. לחץ על 'יצוא' ובחר 'מעבר רשימה' כדי ליצור גיליון אלקטרוני המכיל את מעברי MRM שנוצרו ופרמטרים.
  5. ניתוח על פי LC / MS
    1. להקים מערכת של שיפוע בינארי (מים (א) ו אצטוניטריל (B), כל אחד עם נ חומצה 0.1% פורמית: נ) כרומטוגרף נוזלי בעל יעילות גבוהה (HPLC) עם סמפלר אוטומטי, טור HPLC פגז הליבה C18 (10 ס"מ x 2.1 מ"מ , 2.6 מיקרומטר חלקיקים גדלים) מחוברים ספקטרומטר מסת quadrupole משולש מופעל במצב electrospray חיובי עם זיהוי MRM.
    2. בתוכנת איסוף נתונים (למשל, אנליסט), בחר 'קובץ' ו 'חדש' ולחץ על 'שיטת רכישה' בתיבה המוקפצת ולאחר מכן לחץ על 'אישור'.
      הערה: פעולה זו פותחת את עורך שיטות המכשיר, אשר מכיל רשימה של ההתקנים המחוברים שיאפשר הקמה של השיטה LC / MS חדש.
    3. הקישו על 'משאבה בינארי' ואניNput ערך קצב זרימה (300 μl / min) ואת פעמי השיפוע בטבלה, הגדרת פרופיל שיפוע בינארי של B 3% ל- B 30% מעל 22 דקות, כדי להגדיל ב 100% ב 23 דקות במשך 5 דקות לשטוף החוצה לפני החזרה לתנאים מחדש איזון ראשוניים עבור מינימום 6 נוסף.
    4. הקישו על 'autosampler' ולהכניס את עוצמת הזריקה (5 μl). הפעל את 'מחזור מחט Wash' והזן את 'הזמן לשטוף' (30 שניות) ובחר "Flush נמל '.
    5. הקש על 'בקר טור Thermostatted' וב 'טור תנור מאפיינים' להגדיר את 'טמפרטורת שמאל' ו 'ימין הטמפרטורה' (40 מעלות צלזיוס).
    6. הקש על 'ההמוני ספקטרומטר' ולאחר מכן לחץ על 'עריכת פרמטרים' להיכנס תנאי גז המקור. בחר את 'סוג סרוק "כמו' MRM (MRM) 'ואת' הקוטביות 'כמו' חיובי '. עבור אל 'סיכום בתק' והזן את 'זמן משך', את סך כל הזמן על ניתוח LCאיזון ד (35 דק ').
    7. בטבלה קליק ימני ובחר "Declustering פוטנציאליות (DP) 'ו' התנגשות אנרגיה (CP) 'כדי להוסיף עמודות אלה השולחן. הזן את Q1, Q3, זמן (msec), זהות, הערכים העקורים ו- CE עבור כל המעברים, עבור מיני בשר אחת, נוצרו ברשימת המעבר (ראה שלב 1.4.5).
      הערה: זמן (msec) מתייחס להתעכב הזמן, זמן ספקטרומטר המסה מבלה סוקר כל מעבר, הסיכום של אשר לא יעלה על 3 שניות.
    8. שמור את קובץ שיטת הרכישה (.dam סיומת קובץ).
      הערה: שלבים 1.5.2 - 1.5.8 צורך לחזור על כל מין בשר. פעולה זו תיצור קובץ שיטה אחת עבור כל מין בשר במצב מסך כהכנה לניתוח להלן.
    9. בתוכנת איסוף נתונים, לחץ על 'רוכש' ובחר 'לאזן'. בתיבת הדו שנפתח, בחר את שיטת הרכישה הנדרש כדי להתחיל את איזון המכשיר.
    10. שים את בקבוקוני מדגם arACK של סמפלר האוטומטי.
    11. לחץ על 'קובץ' ובחר 'חדשה' ולאחר מכן 'יצווה רכישה'. בלשונית 'לדוגמא' בחר 'הוסף סט' ואז 'הוסף דוגמאות ". הכנס את מספר הדגימות להיות מנותח ולחץ על 'אישור'. בתיבה 'הרכישה' ובחר בקובץ השיטה אשר ישמש לניתוח מן התפריט הנפתח.
    12. בטבלה, בחר 'קוד פלייט' ובחר את תצורת מגש המתאים מתוך התפריט הנפתח. קליק שמאלי בתוך קליק 'פלייט קוד' כותרת העמודה ואז ימינה ובחר "מלא דאון '. בחיבורו "עמדתו ויאל 'להזין את המיקום של כל דגימה של סמפלר האוטומטי בשורות.
    13. ב 'קובץ נתונים' ציינו את שם הקובץ עבור הרכישה, ואז לחץ על שמאל בכותרת העמודה ואחריו קליק ימני ובחר "מלא דאון '. ב 'שם לדוגמא "להכניס את הזהות של כל אחד הדגימות להיות מנותחת. שמור כקובץ יצווה רכישה (ה קובץxtension .dab).
    14. לחץ על הכרטיסייה 'שלח' ולאחר מכן סמן את הדגימות כי צריך להיות מנותחים על LC / MS. לחץ על 'שלח'. הקש על 'רוכש' או 'התחל לדוגמא' כדי להתחיל את הניתוח.
      הערה: כל שיטת רכישה תסרוק עבור מעברי MRM ברחבי אורכו של כרומטוגרף עבור מיני בשר אחת. הגדרות ספקטרומטר מסה על רכישת MRM להשתנות בהתאם לסוג פפטיד מכשיר.
    15. הצג קבצי נתונים שנוצרו באמצעות תוכנת צפיית נתונים. לחץ על (יוני חילוץ) XIC וב רשימה הנפתח לסמן את כל שהברים (ערכי Q3) עבור מבשר יחיד (Q1). שמשה חדשה יפתח המציג את המעברים הנבחרים בלבד.
    16. רשום את זמן השמירה (R T) עבור קבוצות של מעברים במקביל שכן אלה מתאימות פפטיד יחיד.
    17. חזור על שני השלבים הקודמים עבור כל קבוצה של מעברים על מנת להקצות את הפסגות לפפטיד שלהם עבור כלשל מיני בשר.
    18. רשום את פפטידים סמן אשר מתאימים למתן זיהוי מינים (למשל, הפפטיד HPGDFGADAQGAMTK, מבשר m / z = 752, R t = 12.0 דק ', עבור סוס), יחד עם פעמים השמירה שלהם, ושים לב המהווים המתאים זוגות מתאימים כדי לכמת את יחסי .
      הערה: לדוגמה, הפפטיד סוס סמן (מבשר m / z = 752) יש פפטיד בשר המקביל, HPSDFGADAQAAMSK (מבשר m / z = 767, R t = 13.2 דקות).
    19. על מנת ליצור שיטה דינמית יחידה בקבלה כל המינים בבשר, את תוכנת צפיית נתונים, עבור כל מין בשר בתורו, לפתוח את נתוני מעבר XIC לכל מבשר (שהוקצה פפטיד מסוים 1.5.8).
    20. קרב על אשכול השיא בזמן השמירה שנבחר על-ידי לחיצה שמאלה גרירת הסמן מתחת באשכול. זהה את המעברים האינטנסיביים ביותר (על ידי לחיצה ימנית על תווית השיא).
    21. ידני להקליט את המעבריםו פעמי שמירה בגיליון אלקטרוני.
    22. כדי להזין את פרמטרי כשיטה דינמית חדשה על תוכנת LC / MS, לחץ על 'המוני ספקטרומטר' ולאחר מכן לחץ על 'ערוך פרמטרים' כדי להזין את תנאי גז המקור. בחר את 'סוג סרוק "כמו' MRM (MRM) 'ואת' הקוטביות 'כמו' חיובי '.
    23. עבור אל 'סיכום בתק' והזן את משך הזמן (כפי שנקבע הזמן הכולל לניתוח LC ו האיזון). בטבלה קליק ימני ובחר "Declustering פוטנציאליות (DP) 'ו' התנגשות אנרגיה (CP) 'כדי להוסיף עמודות אלה השולחן.
      הערה: העמודה 'הזמן' עכשיו מתייחסת זמן השמירה הצפויה (דקות) עבור כל מעבר.
    24. בקטע 'עריכת הפרמטרים' של תוכנת איסוף נתוני LC / MS, סמן את התיבה 'MRM מתוזמן ". הזן את Q1, Q3, זמן (דקות), זהות, ערכים עקורים ו- CE עבור המעברים נוצרו בגיליון האלקטרוני (1.5.21) ולשמור את שיטת הרכישה (filהדואר רחב .dam).
      הערה: שיטה זו בדרך כלל מפחיתה את מספר MRM מעבר אל אינטנסיבי 4 ביותר לכל פפטיד והסורק רק על פני חלון שמירת זמן שיא כל פפטיד, מתן רגישות ואיכות משופרות של הנתונים. שיטה 'דינמית' היא שיטה 'מודרך שמירת זמן חלונאית', לפעמים תזמון שנקרא.

2. הכנה וניתוח דוגמאות כיול

  1. הפקת תערובות בשר
    1. באמצעות הבשר הקפוא בעבר ומעבדים לאבקה, להכין מגוון של תערובות בשר בשקילת כמויות בהתאמה של בשר (מסה כוללת של כ -300 מ"ג) לתוך צינורות צנטריפוגות פלסטיק 15 מיליליטר.
    2. הוסף 4 מ"ל של מיצוי חיץ (0.15 M אשלגן כלורי + 0.15 M פוספט חיץ ב- pH 6.5). וורטקס למשך 30 שניות. חלץ על שייקר מעבדה בטמפרטורת החדר למשך שעה 2 ב 250 מחזורים / דקה.
      הערה: מחזורי / min מתייחס תנועה תנודתית.
    3. העבר 2 מ"ל שללחלץ לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 4 ° C ב 17,000 x ז.
    4. העברת 200 aliquots μl של supernatant (בהזמנת כמות קטנה עבור assay חלבון, ראה 2.2) לתוך 2 צינורות מ"ל צנטריפוגות ומיבשים צנטריפוגלי המאייד (תוכנית שנקבע מראש: 50 ° C, ללא אוורור ו -120 משך דקות).
  2. assay חלבון
    1. העברה 7 aliquots μl של supernatant השמורה (ראה 2.1.4) בשלושה עותקים לתוך הבארות של צלחת 96 באר.
    2. העברת 7 aliquots μl של סדרת תקנים חלבון בשלושה עותקים, בטווח 0 - 1.0 מ"ג / מ"ל ​​אלבומין בסרום שור (BSA), לאותו 96 הצלחת היטב.
    3. הוסף 200 μl של Coomassie פלוס מגיב חלבון assay זה טוב.
    4. ראייה להשוות את הצבע של בארות מדגם לתקני החלבון כדי לבדוק את הדגימות הן בטווח של סטנדרטי הכיול. במידת הצורך, חזור עם מדגם בדילול כך הוא הופך להיות בטווח.
    5. השאירו את הצלחת כדי stו 3 דקות.
    6. פרץ כל בועות כי יצרו עם מחט מזרק.
    7. לנתח את הצלחת על קורא הצלחת באמצעות פרוטוקול קצה סטנדרטי באורך גל של 595 ננומטר.
    8. קביעת ריכוז החלבון של הדגימות באמצעות נתוני כיול מן סטנדרטי החלבון.
      הערה: זה נדרש עבור חישוב הסכום של טריפסין משמש בתקציר tryptic.
  3. Proteolysis תערובות בשר
    1. Redissolve שאריות יבשות משלב 2.1.4 ב 1 מ"ל של תמיסת אמוניום ביקרבונט 25 מ"מ. מערבבים היטב על rotamixer.
    2. פעל על פי פרוטוקול משלב 1.1.3 כדי 1.3.7.
  4. ניתוח על פי LC / MS
    1. הגדרת LC / MS כמו בעבר (שלב 1.5.1).
    2. צורו אצווה רכישה חדש כפי שתואר קודם לכן (שלבי 1.5.9 - 1.5.14), בחירת שיטת הרכישה נוצרה בשלב ב 1.5.24 המשתמשת בשיטת LC / MS דינמי שילוב של כל מין הבשר, ולרכוש את הנתונים עבור digesדגימות בשר טד.
    3. הצג את הכרומתוגרמה מלא את תוכנת הצפייה נתונים. הצג את XIC לכל מעבר להגדיר בתורו. ראייה לאשר כל אשכול מכיל מספר ראוי של פסגות בצורת פעמון בזמן השמירה צפוי, ובכך אישר את קיומה של הפפטיד שנבחרו.
    4. בצע quantitation תוך שימוש בנתוני צפיית תוכנה לשלב באזורי שיא עבור כל המעברים של ריבית על ידי לחיצה כפולה על "לבנות שיטת כימות" בסרגל הניווט.
    5. בחלונית 'לדוגמא בחירה' בחר 'קובץ נתונים' ואת 'לדוגמא' להיות מנותח כדי ליצור את הטבלה 'analytes'.
    6. לחץ על הכרטיסייה 'שילוב' כדי להציג את הראשון של מעברים (analytes) כדי להיות משולב.
    7. לחץ על התיבה 'אנליטי' כדי להציג את הרשימה הנפתחת של מעברים. בחר כל מעבר בתורו להצגתו חזותי לאשר את השיא הנכון נבחר לשילוב. מ'odify או לאלץ את לחץ האינטגרציה, שמאלי וגררו את הסמן מעל שיא היעד (זה יהיה מסומן בירוק). לחץ על כפתור 'בחר שיא' ולחץ על 'החל'.
    8. שמור את סביבת העבודה כקובץ שיטה (.qmf).
      הערה: פעולה זו יוצרת קובץ שיטת כימות לחישוב הבא של אזורי שיא מדגם.
    9. לחץ לחיצה כפולה 'אשף כימות "בסרגל הניווט. בחלון 'דוגמאות בחירה' ליצור 'כימות סט' על-ידי בחירת 'קובץ נתונים' אחת, אז אחד או יותר 'דוגמאות זמינות'. בחר 'הבא' כדי להציג 'בחר הגדרות השאילתה' קופסא. השאר עם ברירות מחדל, בחר 'הבא' כדי להציג 'שיטת בחירה'. מתוך התיבה הנפתחת 'השיטה' ובחרי בקובץ 'שילוב השיטה' שנוצר בשלב 2.4.8, ולאחר מכן בחר 'סיום'.
      הערה: פעולה זו יוצרת "לוח תוצאות", לרבות באזורים שיא המעבר הנובעים תערובות בשר.
    10. <li> שמור את 'לוח תוצאות "(.rdb סיומת הקובץ), יצוא כקובץ טקסט (.txt) ופתח אותו גיליון אלקטרוני כדי לבדוק את הנתונים.
    11. גרפים מגרשים של האחוז (על ידי אזור שיא מעבר) של בשר אחד אחר לעומת אחוז המדודה (w / w) של שני בשרים על MRM שנבחר עבור מעברים נבחרים מתוך פפטידים מתאים, תוך התמקדות באותם מקרים שבהם שני שהברים להכיל את אותו מספר של חומצות אמינו כמו לספור מסוף בטרמינל C-.
      הערה: שברים זהים עם אתרי פיצול זהים לתת תוצאות אופטימליות.
    12. בדוק את החלקות מ 2.4.11 לעיל. כך או חזותי, או באמצעות כלי שורת מגמה בחבילה הזוממת, לזהות קבוצה של מגרשים אשר הם ליניאריות של שיפוע דומה. השתמש בכל אחד או יותר של שילובי CPCP בתוספת שבר אלה לכיול בדגימות בשר אמיתי.
      הערה: עלילה מראה שיפוע יוצא דופן עשויה להצביע על פפטיד או דיכוי שבר עם ירידה סוגרת stre אותngth. מגרשים שאינו לינארי עשויים להצביע על זיהוי שיא עני או בעיות אחרות.

3. דוגמאות בשר

  1. הפקת חלבונים ממדגמים בשר היעד
    1. במקרים רלוונטי, חומר זרים שאינם בשר בלו מן המדגם בעזרת מרית. לדוגמא, לגרד ממנו רוטב פסטה לזניה צוננים.
    2. לשקול 20 גרם של בשר לתוך מבחנה מתכת.
    3. הוספת 100 מ"ל של 0.15 כלוריד M אשלגן / 0.15 חיץ monophosphate M אשלגן ב- pH 6.5.
    4. חלץ את החלבונים על ידי ערבוב את הבשר homogenizer במהירות גבוהה דקות 1.
    5. פעל על פי פרוטוקול משלב 2.1.4 - 2.3.2.
  2. ניתוח של דגימות ידי LC / MS
    1. חזור על שלב 2.4.2 לרכוש נתונים בשיטת LC / MS הדינמית.
    2. זהה את פפטידים מכל מיוגלובין בשר כפי שבוצע בשלב 2.4.3.
    3. כדי לכמת, תוכנת quantitation להשתמש כדי לשלב את תחומי השיא עבור כל מעבר של עניין,כפי שמתואר בשלב 2.4.9.
    4. עבור זיהוי מינים בתערובת, ולהקליט אותם פפטידים סמן העונים לקריטריונים מוסכמים מספר מעברים לאותת רעש למעברים אלה.
    5. כדי לכמת, להשתמש באזורי שיא מעבר משולבים כפי שהוסכם משלב 2.4.12 ו, באמצעות אחוז עד אזור שיא מעבר, לחשב את אחוז מיוגלובין משני המינים בתערובת.
    6. השתמש בידע מוקדם מהספרות 18 רמות מיוגלובין סבירות הבשרים להעריך את כמויות w / w היחסיות של שני בשרים נוכחיים במדגם.

Representative Results

בניסוי MRM דינמי במצב יחיד בכל מעבר מתוכנת נרשם בנפרד (כמו ספירת גלאי לכל שניות, CPS) מעל חלון זמן השמירה שצוין. לכן, מכל הנתונים שנאספו בניסוי אחד, את עוצמת השיא עבור כל מעבר ניתן לחלץ בנפרד. ואז ניתן האות הסופית רק עבור חלון שמירה המועד שנקבע מעבר. מחוץ לחלון, האות היא אפס מעצם הגדרתו. האות עבור כל מעבר אחד, למשל, 752 → 1269 מסוס (פפטיד monoisotopic המוני 1,501.66 Daltons, מבשר יון m / z 751.84 Daltons, לחייב המדינה = 2, שבר יון y 13) בדרך כלל יש להתחרות רק עם רעש המדידה ולא מן הפסגות מעבר אחרות שעשויות אולי להיות ממינים אחרים. הפלט הוא אפוא מערכת של פסגות נקיות, אחת בכל מעבר, בכל פעם החזקת משותף המעברים אלה החולקים יון מבשר משותף.

ss = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 1 מציג את הפלט עבור קבוצה של ארבעה מעברים 752 → (1269, 706, 248, 1366) עבור תערובת של 1% w / w סוס בשר. מאז ארבעת המעברים המוצגים המשויכים סוס, והם נעדרים בדגימות של בשר בקר, כבש או חזיר טהור, הפסגות האלה מסמלים את נוכחותו של סוס. בהתאם לקריטריונים איתנים, קבוצה של שתיים או יותר מעברים כל עולה על כמה אותות שצוינו רמת רעש קובעת זיהוי. נתון זה ולכן קובע את הנוכחות של סוס בתערובת של 1% w / w סוס בשר.

לעתים, מעבר מבודד יחיד מזוהה. דבר זה מצביע על התאמת סיכוי היון מבשר ושבר יחיד, ואולי מתוך חלבון זר, עם אלה צפויים מהמערכת programed לתוך ספקטרומטר המסה. האופי הייחודי של הפסגה, התרחשותו לעבר זמן שמירה לא צפוי, הוא סיgnature של מעבר תאונתי ניתן להתעלם.

השטח מתחת שיא כל מעבר ניתן לחשב בנפרד. בהתבסס על שבר מתאים, היחס של סוס לאזורי שיא מעבר בשר, למשל, 752 → 1269 (סוס) כדי 767 → 1299 (בקר), יהיה ביחס ליחס של בשרים בפועל בתערובת. איור 2 מראה העלילה של אחוז עד אזור השיא עבור שני מעברים אלו לעומת משקל אחוז למשקל של סוס בתערובת של סוס עם בשר בקר. אם אזורי שיא אחוז המעבר להתאים את משקל האחוז עבור משקל של בשר אז השיפוע הוא 1. השיפוע בחלקה זו הוא 1.03, המעיד על כך, למעברים אלה CPCP זוג, אזורי השיא המעבר לתת מדד אמין של כמויות היחסיות של שני בשרים בתערובת. אם בשר הסוס במדגם היה כפליים עשיר מיוגלובין כמו הבשר ואז, עם גורמים אחרים ללא שינוי, השיפוע קו יהיה גדול מ.

איור 1
איור 1. עוצמות המעבר MRM לעומת זמן השמירה על 1% w / w סוס בשר. המעברים הם 752 → (1269, 706, 248, 1366), המוצג כתום, שחור, כחול וירוק, בהתאמה. הפפטיד סמן הוא HPGDFGADAQGAMTK. ארבעת שברי המעבר יכול להיות מצוין y 13, y 7, y 2 ו- y 14, בהתאמה, כאשר y n מציין לספור בחומצות אמינו n מסוף בטרמינל C-peptide. האות לרעש נעה בין 23 ל 53 במהלך ארבעת המעברים. קו אדום נוסף מציין את המעבר 752 → 1269 עבור 0% סוס, 100% בשר בקר להשוואה. רק באזור שאינו אפס של זמן השמירה מוצג. נתון זה יש הבדל בין ווטסון et al. 3.es / ftp_upload / 54,420 / 54420fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. מגרש של סוס בשר בקר, כמו אחוז משקל משקל, לעומת סוס בשר כמו אזור שיא מעבר אחוזים. העלילה משתמשת זוג בשר פפטידים (767) ואת הסוס (752) ואת יון שבר y 13 עבור שניהם. אם A מציין אזור השיא אז לתאם הוא 100 A H / (A H + A B). השיפוע של הקו בכושר הטוב ביותר (R 2 = 0.99) הוא 1.03. נתון זה יש הבדל בין ווטסון et al. 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הבחירה של חלבון מטרה מתאים חשובה. חלבון מטרה טוב צריך להיות צורות המקבילה מינים של עניין, וריאצית רצף מינים תלויים מספיק, סגולי מינים, ולהתקיים בכמויות נגישות בתוך אורגניזמים. להערכת תערובות שעברו עיבוד (למשל, טיפול בחום), חלבון בעל רצף יחסית חסין בפני העיבוד כי רצוי. מיוגלובין הוא מועמד טוב בשר אדום, כולל בשר אדום מבושל, אבל הוא לא האפשרות היחידה. לאחר חלבון המטרה היא החליטה, החלק הקריטי ביותר של פרוטוקול הוא proteolysis חלבון. חלבון שונה מיוגלובין עשוי לדרוש פרוטוקול proteolysis חלופי.

הפרוטוקול כמתואר כולל קטע המבוסס על חלבון מן מטוהרי התייחסות. זה שמטרתו לגלות חלון שמירת זמן ויונים מבשרים שבר מתאימים. מגזר זה מאוד עוזר אך לא הכרחי.

איור 2). הסיבה לכך היא כי הפפטיד האחרון נובע מחשוף KE מורחק יחסית, גרימת אומדן חסר של רמת הסוס בתערובת. פפטידים מקבילים החל חומצות אמינו שונות ולכן נמנע הטוב ביותר. לעתים קרובות שהברים משני פפטידים מתאימים יש רצפי חומצות האמיניות זהים והם מחונכים, אבל זה לא תמיד מקרה צריך להיבדק במהלך פיתוח שיטות. זיהוי מינים הוא הרבה פחות רגישה לנושאים אלה מ quantitation יחסית.

הפרוטוקול הודגם במשך ארבעה בשר אדוםים 3. מיני בשר נוספים ניתן לכלול, על פי האיכות של צורת שיא המעבר עלולה להידרדר אם פפטידים סמן רבים מדי שיתוף elute, ובכך מפחיתה ביעילות את הזמן להתעכב, ובסופו של דבר משפיל ערכות quantitation יחסית. מכשור משופר, כבר זמין, ישפר זו. סוגייה נלווית היא כי אין כל סוגי הבשר myoglobins שונים. לדוגמה, הסוס, החמור myoglobins זברה זהים ובכך מדבר השיטה בקפדנות הוא רק מסוגל לאתר סוס או חמור או זברה בשר בקר. במקרים מסוימים, למרות myoglobins אינו זהה, יכולים להיות כמה פפטידים מפתח. לדוגמא, כמה פפטידים סמנו כבש נגזרות מיוגלובין מופיעים גם עז.

סיבוך מול זה, וכל שיטת quantitation אחרת מבוסס חלבון הוא שרמת החלבון יש להניח קבועה על פני כל המינים אם רמות החלבון או הפפטיד הם משווים טריוויאלית לרמות של בשרים בתערובת. עבור מיוגלובין ואת מ 'הארבע אדוםאוכל זה לא נכון אוניוורסלי. הרמות בכלל הם מינים תלויים, עם חזיר מציגים את הרמה הנמוכה ביותר מבין הארבע. בנוסף, רמת מיוגלובין משתנית עם חתך בשר וגיל חיה. אז למרות יחס בין אזורי שיא המעבר למפות באופן מהימן ליחסים של מיוגלובין, מיפוי יחס של בשרים בפועל הוא ציור אומדן על הנחות לגבי מקורות סבירים של הבשרים בתערובת.

שהגישה המתוארת בעבודה זו שונה במספר דרכים מתרומות שפורסם אחרות. מסלול אופייני יותר הוא להשתמש בשיטות proteomic לזהות פפטידים סמנו מינים תלויים מפורד שונים, ובמקרה הסמנים עבור מינים שונים להחזיק שום קשר מסוים עם אחד 8-12,14,19 אחרת. לעומת זאת, בחרנו חלבונים המשותפים לכל המינים של עניין עד מינים תלויים רצף גרסות 3. מלבד היותו מרכזי באסטרטגיה quantitation היחסי שלנו, זה יש את היתרון כי המדגםיכולות להיות מותאמות אסטרטגיות הכנות. בנוסף, חלבונים מתאימים כזה עלולים להיות צפוי להתנהג באופן דומה, למשל, מיצוי או בעיבוד המסחרי של דגימות כגון בישול או שימורים. מיני זיהוי אז בדרך כלל ממשיך באמצעות זיהוי של פפטידים סמנו מפורד, ואילו תמורת זיהוי מיני גישת CPCP באמצעות זיהוי של פפטידים קשור קשר הדוק בעל בדרך כלל הבדלי רצף אחד או שניים. לבסוף, כדי לכמת את החלבונים להעריך את האחוז לפי משקל של מין אחד אחר שאולי כמקובל להמשיך דרך לכמת מוחלט של כל חלבון מבוסס בנפרד על סטנדרטים ידועים 7,14,15. עם זאת בשיטת CPCP אין צורך בשיטות כיול. במקום זאת, רמות יחסית נאמדות על ידי השוואת עוצמות אות של שני פפטידים מתאימים משני המינים, תוך עקיפת שלב המדידה המוחלטת לגמרי. מאחר והמטרה הסופית היא אחוז לפי משקל של אחד המינים anoיס, quantitation יחסית, אז CPCP הוא גם יותר ישירה ופשוטה יותר השוואה בין שתי מדידות quantitation מוחלטות. תכונות אלה לתרגם פעמים ניסיוניות קצרות, שצפויות להיות כשני hr תוך שימוש בפרוטוקולים מעודנים, מה שהופך את הטכניקה שימושית ככלי מעקב מהיר בתחום איתור הונאות מזון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uniprot database www.uniprot.org Freely accessible database of protein sequences
Skyline software www.skyline.gs.washington.edu Free software to download that enables the creation of targeted methods for proteomic studies, peptide and fragment prediction 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com O9830
Methanol, HPLC grade Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk 10674922
Acetonitrile, HPLC grade Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk 10010010
Urea Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com U5378
Trypsin(from bovine pancreas treated with TPCK) Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com T1426
Formic acid  Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com F0507
Coomassie Plus Protein Assay Reagent Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com 1856210
Protein standard Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com P0914
Ultra Turrax homogeniser T25 Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk 13190693
Edmund and Buhler KS10 lab shaker
Heraeus Fresco 17 Centrifuge Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com 75002420
Vacuum centrifuge RC 1022 Jouan
Plate Reader
Strata-X 33u polymeric reversed-phase cartridges 60 mg/3 ml tubes Phenomenex, Macclesfield, UK 8B-S100-UBJ
4000 QTrap triple-quadrupole mass spectrometer AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com
1200 rapid resolution LC system Agilent, Stockport, UK
XB C18 reversed-phase capillary column (100 mm x 2.1 mm, 2.6 µm particle size) Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com
Analyst 1.6.2 software AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com QTrap data acquisition and analysis, including peak area integration
Autosampler vials

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Mahony, P. J. Finding horse meat in beef products-a global problem. QJM-An Int. J. Med. 106, 595-597 (2013).
  2. Sentandreu, M. A., Sentandreu, E. Authenticity of meat products: Tools against fraud. Food Res. Int. 60, 19-29 (2014).
  3. Watson, A. D., Gunning, Y., Rigby, N. M., Philo, M., Kemsley, E. K. Meat Authentication via Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry of Myoglobin Peptides. Anal. Chem. 87, 10315-10322 (2015).
  4. Food Standards Agency. Report of the investigation by the Food Standards Agency into incidents of adulteration of comminuted beef products with horse meat and DNA. (2013).
  5. Taylor, A. J., Linforth, R., Weir, O., Hutton, T., Green, B. Potential of electrospray mass-spectrometry for meat pigment identification. Meat Science. 33, 75-83 (1993).
  6. Ponce-Alquicira, E., Taylor, A. J. Extraction and ESI-CID-MS/MS analysis of myoglobins from different meat species. Food Chem. 69, 81-86 (2000).
  7. Gallien, S., Duriez, E., Domon, B. Selected reaction monitoring applied to proteomics. J. Mass Spectrom. 46, 298-312 (2011).
  8. Orduna, A. R., Husby, E., Yang, C. T., Ghosh, D., Beaudry, F. Assessment of meat authenticity using bioinformatics, targeted peptide biomarkers and high-resolution mass spectrometry. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1709-1717 (2015).
  9. Claydon, A. J., Grundy, H. H., Charlton, A. J., Romero, M. R. Identification of novel peptides for horse meat speciation in highly processed foodstuffs. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1718-1729 (2015).
  10. von Bargen, C., Brockmeyer, J., Humpf, H. U. Meat Authentication: A New HPLC-MS/MS Based Method for the Fast and Sensitive Detection of Horse and Pork in Highly Processed Food. J. Agric. Food Chem. 62, 9428-9435 (2014).
  11. von Bargen, C., Dojahn, J., Waidelich, D., Humpf, H. U., Brockmeyer, J. New Sensitive High-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Method for the Detection of Horse and Pork in Halal Beef. J. Agric. Food Chem. 61, 11986-11994 (2013).
  12. Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Authentication of processed meat products by peptidomic analysis using rapid ambient mass spectrometry. Food Chem. 187, 297-304 (2015).
  13. Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid detection of Peptide markers for authentication purposes in raw and cooked meat using ambient liquid extraction surface analysis mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).
  14. Sentandreu, M. A., Fraser, P. D., Halket, J., Patel, R., Bramley, P. M. A Proteomic-Based Approach for Detection of Chicken in Meat Mixes. J. Proteome Res. 9, 3374-3383 (2010).
  15. Elliott, M. H., Smith, D. S., Parker, C. E., Borchers, C. Current trends in quantitative proteomics. J. Mass Spectrom. 44, 1637-1660 (2009).
  16. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
  17. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. JoVE, Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2016).
  18. Keeton, J. T., Ellerbeck, S. M., Nunez de Gonzalez, M. T. Encyclopedia of Meat Sciences. Devine, C., Dikeman, M. 1, Academic Press. 235-243 (2014).
  19. Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid Detection of Peptide Markers for Authentication Purposes in Raw and Cooked Meat Using Ambient Liquid Extraction Surface Analysis Mass Spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).
נחישות כימות המינים בשנת תערובות שימוש ספקטרומטריית מסה MRM של פפטידים יישומית כדי אימות בשר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gunning, Y., Watson, A. D., Rigby, N. M., Philo, M., Peazer, J. K., Kemsley, E. K. Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication. J. Vis. Exp. (115), e54420, doi:10.3791/54420 (2016).More

Gunning, Y., Watson, A. D., Rigby, N. M., Philo, M., Peazer, J. K., Kemsley, E. K. Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication. J. Vis. Exp. (115), e54420, doi:10.3791/54420 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter