We present a protocol for identifying and quantifying the components in mixtures of species possessing similar proteins. Mass spectrometry detects peptides for identification, and gives relative quantitation by ratios of peak areas. As a tool food for fraud detection, the method can detect 1% horse in beef.
We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. Central to the method is the identification of ‘corresponding proteins’ in the species of interest, in other words proteins that are nominally the same but possess species-specific sequence differences. When subject to proteolysis, corresponding proteins will give rise to some peptides which are likewise similar but with species-specific variants. These are ‘corresponding peptides’. Species-specific peptides can be used as markers for species determination, while pairs of corresponding peptides permit relative quantitation of two species in a mixture. The peptides are detected using multiple reaction monitoring (MRM) mass spectrometry, a highly specific technique that enables peptide-based species determination even in complex systems. In addition, the ratio of MRM peak areas deriving from corresponding peptides supports relative quantitation. Since corresponding proteins and peptides will, in the main, behave similarly in both processing and in experimental extraction and sample preparation, the relative quantitation should remain comparatively robust. In addition, this approach does not need the standards and calibrations required by absolute quantitation methods. The protocol is described in the context of red meats, which have convenient corresponding proteins in the form of their respective myoglobins. This application is relevant to food fraud detection: the method can detect 1% weight for weight of horse meat in beef. The corresponding protein, corresponding peptide (CPCP) relative quantitation using MRM peak area ratios gives good estimates of the weight for weight composition of a horse plus beef mixture.
The European horse meat scandal of 2013, in which undeclared horse meat was found in a number of supermarket beef products1, highlights the need for testing methods capable of detecting and measuring food fraud in meat. Several technologies have been explored, especially enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and DNA-based methods2. An alternative route, based on mass spectrometry, targets species-specific peptides which in turn arise from species-specific proteins. Here we outline one such peptide-based approach that offers both identification and relative quantitation of the adulterant species in a meat mixture3.
The protocol is framed in the context of red meats and the desire to determine the presence of one in another at the level of 1% by weight, the level considered by some to represent fraudulent food adulteration as opposed to contamination4. The method relies in the first instance on identifying a protein which is nominally ‘the same’ in all target meats. Myoglobin, the protein responsible for the red color of meat, is a good candidate since it is abundant, relatively heat tolerant and water soluble, and has been used for species determination of meat previously5,6. The myoglobins for beef (Bos Taurus), pork (Sus scrofa), horse (Equus caballus) and lamb (Ovis aries)3, for instance, are nominally the same, as required, but their sequences are not identical. Such groups of ‘similar but different’ proteins, like these four myoglobins, can conveniently be described as ‘corresponding proteins’. The sequence differences in these four myoglobins are species-specific: for example, the full myoglobin proteins for beef and horse, P02192 and P68082 respectively, each comprise 154 amino acids with 18 sequence differences between the two. Subject to proteolysis using trypsin these proteins produce two sets of peptides, some of which are identical, and some which show one or more species-specific amino acid differences: corresponding proteins therefore give rise to corresponding peptides.
The CPCP approach, therefore, seeks first to identify proteins from two or more species where these proteins exhibit limited species-specific sequence variants. These are corresponding proteins. Following proteolysis, corresponding proteins give rise to peptides, some of which likewise display species-specific sequence variants inherited from the parent protein. These are corresponding peptides. The CPCP approach can be used to compare levels of two corresponding proteins in a mixed species sample by monitoring the levels of corresponding peptides.
The natural technology for the detection of known peptides is multiple reaction monitoring mass spectrometry, or MRM-MS7. Species-specific peptides yield precursor ions, which along with their mass spectrometry fragment ions, are easily itemized in advance by software tools. These lists are then used to instruct the mass spectrometer to record only specific precursor plus fragment ion pairs, called transitions. A particular target peptide is therefore identified not only by its retention time in the chromatography preceding the mass spectrometer, but also by a set of transitions sharing a common precursor ion. This is a highly selective means of detecting known peptides that makes efficient use of the mass spectrometer resource.
Other authors have used mass spectrometry to test for meat adulteration via peptide markers but from disparate proteins8-14. Using the corresponding proteins, corresponding peptides (CPCP) scheme, however, means experimental conditions can be optimized, aiding identification of the species in the mixture from known species-specific transitions. In addition, corresponding proteins and peptides will generally behave similarly in the extraction, proteolysis and detection stages. Since transition peak areas are quantitative and reproducible, ratios of peak areas arising from pairs of corresponding peptides from different species provide a direct estimate of the relative quantities of two meats in a mixture. In contrast, more traditional quantitation routes exploit calibrations based on reference materials to establish absolute quantitation14,15.
Though the protocol is outlined in the context of myoglobin and meat, proteins other than myoglobin could be used for identification and relative quantitation via the CPCP strategy in meat mixtures, though potentially with modifications to the protocol. In addition the strategy is also applicable to binary mixtures of other species sharing one or more corresponding proteins.
The starting point for the protocol is purified ‘reference’ myoglobin, which for some species can be purchased but which for others must be prepared by conventional size-exclusion chromatography. The procedure for preparing reference myoglobin is not included in the protocol, but is described elsewhere3. Software tools16 are used to list candidate peptides and transitions arising from myoglobins of interest. Each reference myoglobin is subjected to proteolysis and the resultant peptides analyzed by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) to discover which of the candidate precursor ions and transitions are most useful, and to determine the matching peptide retention times. The outcome of this stage is a revised list of target peptides with their transitions, suitable for species determination, and a list of CPCP pairs, suitable for relative quantitation. To test real meats, sample extractions are prepared then subjected to proteolysis to generate peptides both from myoglobin and other extraneous proteins. The myoglobin-based peptides are then monitored by LC-ESI-MS/MS based on their listed transitions. The species present in a mixture are identified by the transition peaks associated with marker peptides. Estimates of the relative amounts of two meats in a binary mixture are calculated using ratios of transition peak areas. A set of test mixtures of pairs of meats will allow the ratio of peak areas for a given pair of transitions to be checked and calibrated against actual mixtures.
Valet av ett lämpligt målprotein är viktig. En bra målprotein måste ha motsvarande former i arter av intresse, tillräcklig arter beroende sekvensvariation, artspecificitet, och finns i tillgängliga kvantiteter inom organismerna. För bedömning av blandningar som har bearbetats (till exempel värmebehandling), är önskvärt ett protein som har en sekvens relativt immun mot att behandling. Myoglobin är en bra kandidat för rött kött, inklusive kokt rött kött, men är inte den enda möjligheten. När målproteinet avgörs, är den mest kritiska delen av protokollet protein proteolys. Ett protein skiljer sig från myoglobin kan mycket väl kräva en alternativ proteolys protokoll.
Protokollet som beskrivs innefattar ett segment baserat på referens renade proteinet. Detta syftar till att upptäcka behålla tidsfönster och lämpliga prekursor och fragmentjoner. Detta segment är mycket hjälpsam men inte nödvändigt.
<pclass = "jove_content"> Även om motsvarande peptid par från två arter av intresse kan listas även utan experiment, är det ibland så att en sekvens skillnad har dramatiska konsekvenser för matsmältningen profil. Till exempel, peptidparet VLGFHG (nötkött) och ELGFQG (häst) ge en avvikande kvantifiering resultat (manifest som en gradient mindre än en i figur 2). Detta beror på att den senare peptiden härrör från en relativt undertryckt KE klyvning, vilket orsakar en underskattning av nivån på hästen i blandningen. Motsvarande peptider som börjar med olika aminosyror därför bäst att undvika. Ofta fragmenten från två motsvarande peptider har identiska aminosyrasekvenser och är hjälpsökande, men detta är inte alltid fallet och behöver kontrolleras under metodutvecklingen. Artbestämning är mycket mindre känsliga för dessa frågor än relativ kvantifiering.Protokollet har visats för fyra rött kötts 3. Ytterligare köttarter kan ingå, även om kvaliteten på övergångstoppformen kan försämras om alltför många markörpeptider co-elueras, vilket effektivt minskar uppehållstiden och slutligen förnedrande relativa kvantifiering uppskattningar. Förbättrad instrumentering, som redan finns, kommer att förbättra detta. En relaterad fråga är att inte alla kött har olika myoglobins. Till exempel, häst, åsna och zebra myoglobins är identiska och därmed strängt taget metoden är endast kapabel att detektera häst eller åsna eller zebra i nötkött. I vissa fall, även om myoglobins inte är identiska, kan vissa viktiga peptider vara. Till exempel, vissa lamm myoglobin härrörande markörpeptider visas också i get.
En komplikation inför denna och alla andra proteinbaserade kvantifiering metod är att proteinnivå måste antas vara konstant över alla arter, om protein- eller peptidnivåer är att jämställa trivialt till nivåer av kött i en blandning. För myoglobin och fyra röda mäter detta är inte allmängiltigt. Nivåerna är i allmänhet arter som är beroende, med fläsk som uppvisar den lägsta nivån på fyra. Dessutom varierar myoglobin i nivå med köttet styckas och djur ålder. Så även om förhållanden av övergångstoppareor karta tillförlitligt till förhållanden av myoglobin, kartläggning till förhållandet mellan faktiska kött är en uppskattning som drar på antaganden om sannolika källor till kött i blandningen.
Det tillvägagångssätt som beskrivs i detta arbete skiljer sig på flera sätt från andra publicerade bidrag. En mer typisk väg är att använda proteomik metoder för att identifiera olika disparata arter beroende markör peptider, varvid markörer för olika arter besitter någon särskild relation med varandra 8-12,14,19. Däremot har vi valt proteiner som är gemensamma för alla arter av intresse upp arter beroende sekvensvarianter 3. Bortsett från att vara central för vår relativa kvantifiering strategi, har detta fördelen att provetförberedelse strategier kan optimeras. Dessutom kan sådana motsvarande proteiner förväntas uppföra sig på liknande sätt, till exempel, i extraktion eller i kommersiell bearbetning av prover såsom matlagning eller konservering. Artidentifiering då normalt fortskrider via detektion av disparata markörpeptider, medan det i de CPCP inflygningsidentifierings arter skrider via detektering av nära besläktade peptider som besitter typiskt en eller två sekvensskillnader. Slutligen, för att kvantifiering av proteiner uppskatta viktprocent av en art i en annan kan konventionellt fortskrida via absolut kvantifiering av varje protein separat baserat på kända standarder 7,14,15. Men med hjälp av CPCP metoden finns det inget behov för kalibreringsmetoder. Istället är relativa nivåer beräknas genom att jämföra signalstyrkor av två motsvarande peptider från de två arterna, förbi absolut mätning scenen helt och hållet. Eftersom det slutliga målet är en viktprocent av en art i anoTher, en relativ kvantifiering, då CPCP är både mer direkt och enklare än att jämföra två absoluta kvantifiering. Dessa funktioner översätta till korta experiment gånger, förväntade att vara ungefär två timmar med hjälp av raffinerade protokoll, vilket gör tekniken användbar som en snabb verktyg övervakning i sfären för upptäckt mat bedrägeri.
The authors have nothing to disclose.
We acknowledge financial support from Institute of Food research BBSRC Core Strategic Grant funds, BBSRC Project BB/J004545/1.
Uniprot database | www.uniprot.org | Freely accessible database of protein sequences | |
Skyline software | www.skyline.gs.washington.edu | Free software to download that enables the creation of targeted methods for proteomic studies, peptide and fragment prediction | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | O9830 | |
Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 10674922 | |
Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 10010010 | |
Urea | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | U5378 | |
Trypsin(from bovine pancreas treated with TPCK) | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | T1426 | |
Formic acid | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | F0507 | |
Coomassie Plus Protein Assay Reagent | Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com | 1856210 | |
Protein standard | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | P0914 | |
Ultra Turrax homogeniser T25 | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 13190693 | |
Edmund and Buhler KS10 lab shaker | |||
Heraeus Fresco 17 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com | 75002420 | |
Vacuum centrifuge RC 1022 | Jouan | ||
Plate Reader | |||
Strata-X 33u polymeric reversed-phase cartridges 60 mg/3 ml tubes | Phenomenex, Macclesfield, UK | 8B-S100-UBJ | |
4000 QTrap triple-quadrupole mass spectrometer | AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com | ||
1200 rapid resolution LC system | Agilent, Stockport, UK | ||
XB C18 reversed-phase capillary column (100 x 2.1mm, 2.6µ particle size) | Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com | ||
Analyst 1.6.2 software | AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com | QTrap data acquisition and analysis, including peak area integration | |
Autosampler vials |