Summary
Este trabalho apresenta um método simples e visual para detectar polimorfismos multi-nucleotídeos em uma plataforma de manipulação gota pneumático. Com o método proposto, toda a experiência, incluindo gota de manipulação e de detecção de polimorfismos de vários nucleótidos, pode ser realizada próximo de 23 ° C, sem o auxílio de instrumentos avançados.
Abstract
Um método simples e visual para detectar polimorfismo de multi-nucleótido (MNP) foi realizada sobre uma plataforma de manipulação gota pneumática sobre uma superfície aberta. Esta abordagem para a detecção de ADN foi colorimétrico baseado no crescimento mediada por hibridação de sondas de nanopartulas de ouro (sondas AUNP). O tamanho e a configuração do crescimento do AUNP são dominadas pelo número de amostras de DNA hibridaram com as sondas. Com base nas propriedades ópticas e SIZE- dependente da forma específica das nanopartículas, o número de desemparelhamentos de um fragmento de ADN da amostra com as sondas é capaz de ser discriminado. Os testes foram realizados através de gotículas contendo os reagentes e as amostras de ADN, respectivamente, e foram transportadas e misturado na plataforma pneumática com a sucção pneumática controlada da membrana hidrofóbicas à base de PDMS flexíveis. Gotículas podem ser entregues simultaneamente e, precisamente, numa superfície aberta na plataforma pneumática proposta que é altamente biocompatível sem FEP ladoect de amostras de ADN no interior das gotas. A combinação dos dois métodos propostos, o polimorfismo de multi-nucleótido pode ser detectada à vista sobre a plataforma de manipulação gota pneumático; nenhum instrumento adicional é necessária. O procedimento de instalação das gotas na plataforma para o resultado final leva menos de cinco minutos, muito menos do que os métodos existentes. Além disso, esta abordagem combinada de detecção MNP exige um volume de amostra de apenas 10 ul em cada operação, o que é notavelmente menos do que a de um sistema de macro.
Introduction
-polimorfismo de um único nucleótido (SNP), que é uma única diferença de par de bases numa sequência de ADN, é uma das variações genéticas mais comuns. Estudos atuais relatam que SNPs estão associados com o risco de doença, a eficácia da droga e os efeitos colaterais dos indivíduos por afetar a função do gene. 1,2 Estudos recentes também revelou que as mutações de dois ou multi-ponto (polimorfismo multi-nucleotídeo) causam doenças específicas e individuais diferenças nos efeitos da doença 3,4 A detecção de polimorfismo de nucleotídeo. é, portanto, imperativo prescreening doença. Métodos simples e eficientes para a detecção rápida de oligonucleotídeos específicos de sequência foram altamente desenvolvido nas últimas duas décadas. 1,5 As abordagens atuais para identificar mutações no DNA tipicamente procedimentos, incluindo a imobilização da sonda, rotulagem de fluorescência, eletroforese em gel, etc. envolvem, 6,7 mas estes métodos requerem geralmente um processo analítico de comprimento, expenequipamentos sive, os técnicos bem treinados e consumo significativo de amostras e reagentes.
Uma nanopartícula com uma grande proporção de área de superfície para volume e propriedades físico-químicas únicas é um material ideal como uma plataforma de detecção altamente sensível e barato para biomarcadores específicos. As nanopartículas de ouro (AUNP) são amplamente utilizados para a detecção de DNA devido à sua grande capacidade de ser modificado com sondas de oligonucleotídeos. 8-10 técnicas de detecção de SNP também foram desenvolvidos usando AUNP. 11-13 Neste trabalho adotamos uma nova abordagem colorimétrico para detectar a polimorfismo multi-nucleótido (MNP) através do DNA crescimento mediada por hibridação de sondas AUNP. 14 Este método de sondagem simples e rápida é baseada na teoria de que os comprimentos variados de ADN de cadeia simples (ssDNA) ou de ADN de cadeia dupla (dsDNA), conjugada com AUNP influenciar o crescimento do tamanho e forma do AUNP (ver Figura 1). 15 Este método de detecção de ADNapresenta um pequeno consumo de reagentes, um ensaio de duração pequena (alguns minutos), e um processo simples, sem controlo térmico que é aplicável prospectivamente para o diagnóstico clínico e um exame médico interno.
Vários sistemas de microfluido para detectar a sequência de ADN ter sido desenvolvido; 16 Estes sistemas de microfluidos, evoluíram a partir de protocolos experimentais tradicionais, necessária menos peças de equipamento de grandes dimensões e simplificada os protocolos experimentais, de modo a melhorar a sensibilidade, limite de detecção e especificidade do ADN biossensor. Métodos de detecção de DNA nos sistemas microfluídicos ainda exigem, no entanto, instrumentos de um processo subsequente, como a PCR (reação em cadeia da polimerase) máquinas para a amplificação de sinal e um leitor de fluorescência para uma única leitura para identificar o SNP heterogêneo. 17,18 Desenvolvimento de uma simples plataforma sem o processamento subsequente para ler diretamente os resultados de polimorfismo multi-nucleotídeoé altamente desejável. Comparado ao bem utilizado, convencional, fechou sistemas microfluídicos, o open-superfície dispositivos microfluídicos oferecem promissora várias vantagens, tais como um caminho óptico claro, uma maneira fácil de acessar a amostra, a acessibilidade ambiental direta e cavitação não facilmente formadas ou obstrução interfacial em o canal. 19 o nosso trabalho anterior apresentou uma plataforma pneumático simples para a manipulação da superfície aberta gotícula (ver Figura 2). 20 Nesta plataforma, as gotas podem ser simultaneamente transportadas e manipulado sem interferência a partir de uma energia motriz usando uma força de sucção, que tem um grande potencial em aplicações biológicas e químicas. Esta plataforma pneumático foi assim utilizada para executar a manipulação de amostras de ADN para a detecção de MNP em combinação com a abordagem colorimétrico utilizando o conceito de ADN crescimento mediada por hibridação de sondas AUNP.
O protocolo apresentado neste artigo descreveuma detecção visual simples de polimorfismos multi-nucleotídeos na plataforma manipulação gota pneumático em uma superfície aberta. Este trabalho confirma que o polimorfismo multi-nucleotídeo é detectável a olho nu; a plataforma pneumático proposto é adequado para aplicações biológicas e químicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Método para Detectar MNP
Nota: Esta secção descreve o procedimento para detectar a MNP com base no crescimento mediada por hibridação de nanopartículas de ouro.
- Prepara-se o ADN da sonda (5'-tiol-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 ') solução a uma concentração de 100 uM.
- Prepare o partículas AUNP sonda de DNA modificado (sonda AUNP). 21
Nota: O volume utilizado aqui depende da exigência de AUNP sonda de DNA modificado (sonda AUNP) partículas. É, por conseguinte, dependente do número de experiências para ser realizado. Nós normalmente preparar partículas da sonda AUNP excesso como peças de reposição. O volume utilizado nestes passos é ajustável e flexível.- Adicionar ADN sonda (100 pM, preparada no passo 1.1) a uma solução de nanopartículas de ouro (13 nM, 17 nM) a uma concentração de DO / ml.
- Traga as concentrações finais de sulfato de dodecilo de sódio (NAC 12 H 25 SO 4, SDS) e tampão de fosfato (PBS) a 0,01% e 0,01 M, respectively.
- Após 20 minutos, trazer a concentração de cloreto de sódio (NaCl) a 0,05 M com uma solução de cloreto de sódio (2 M) e PBS (0,01 M), mantendo a SDS a 0,01% e incubar durante 20 min.
- Aumentar a concentração de NaCl em incrementos de 0,1 M para uma concentração final de 1 M de mais de 20 intervalos mínimo.
- Incubar durante a noite com agitação num misturador de vortex a 23 ° C. A velocidade de agitação não afecta a experiência, enquanto as amostras de ADN e sondas AUNP tornar hibridada.
- Centrifugar as nanopartículas de ouro a 7.000 xg durante 30 segundos e remover o sobrenadante.
- Adicionar partículas sonda AUNP em água desionizada (água Dl) a uma concentração de 25 nM (solução de sonda AUNP).
- Preparar as amostras de ADN alvo totalmente complementares (: 5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 '; três pares de bases incompatíveis: 5'-TTT CTTGCCTAC ACCAGCTC-3'; seis pares de bases incompatíveis: 5'-TTTTTT CTTGCCT CCAGCTC-3 ') em concentraçõesde 0,06, 0,11, 0,17, 0,20, 0,30, 0,50 uM, respectivamente.
- Adicionar solução de sonda AUNP (6 ul, 25 nM) nas amostras de ADN (350 ul) com NaCl (14 uM).
- Agitar a mistura de amostras de ADN e sondas AUNP com um misturador de vórtice a 23 ° C durante 5 min para hibridação de ADN.
- Para o crescimento AUNP, adicionar NH 2 OH (6 mL, 400 mM) e HAuCl 4 (6 mL, 25,4 mM) à solução de (a mistura de amostras de ADN e sondas AUNP). O crescimento de AUNP leva cerca de 30 seg para conclusão. A mudança constante de coloração mantém mais do que 1 h.
CUIDADO: O contato da pele com HAuCl 4 pode produzir efeitos tóxicos graves. Por favor, consulte as folhas de dados de segurança de material (MSDS) antes do uso. Por favor, use luvas e utilizar um exaustor quando se utiliza HAuCl 4.
2. Fabricação de uma plataforma de Manipulação pneumática Gota
Nota: A plataforma de manipulação gota PDMS baseada compreende duas componentes: a Pmembrana de DMS (100 um) com uma superfície super-hidrófoba e uma camada de ar do canal (5 mm). Sem um processo de MEMS, os processos de maquinagem comuns foram utilizados para fabricar este dispositivo, que inclui o controlo por computador numérico micromaquinagem (CNC), para fazer um molde, a carcaça de PDMS e de replicação para prototipagem rápida dos componentes de microfluidos, e micromaquinação por laser para a fabricação de uma superfície super-hidrófoba (ver Figura 3).
- Use a máquina de CNC equipado com uma broca (0,5 mm) para produzir moldes de mestre à base de PMMA (ver Figura 3) com microestruturas. Use uma velocidade de alimentação da broca bit 7 mm / seg e uma velocidade de rotação de 26.000 rpm. Usar um ventilador de ar e água desionizada para remover a sucata de PMMA e para limpar a superfície dos moldes mestres.
- Prepara-se uma mistura da base de PDMS e o agente de cura na proporção de 10: 1. Desgaseificar a mistura no interior de um exsicador durante 30 minutos, ou até que todas as bolhas de ar são removidas.
- Despeje o PDMS em the mestre de molde e assar o PDMS durante 3 horas a 60 ° C no forno para se obter as microstruturas inversas das câmaras de ar (membrana PDMS) e os canais de ar (camada de PDMS).
- Retirar a camada de PDMS do molde mestre (à mão). Faça furos na camada de PDMS para entradas de ar de sucção.
- Colocar a membrana PDMS, a camada de PDMS e o substrato de vidro dentro da câmara do sistema de tratamento de plasma de oxigénio. Após o tratamento por plasma de oxigénio, ligar-se a membrana de PDMS, a camada de PDMS e o substrato de vidro em conjunto numa placa de aquecimento (90 ° C) durante 10 min.
- Coloque o chip compósitos para a máquina de corte a laser (PDMS lado da membrana para cima). Importar o arquivo .dwg para definir a área hidrofóbicas (15 mm × 12 mm). Veja a Figura 3. Diretamente gravar a membrana PDMS com uma máquina -Laser CO 2 para criar a área hidrofóbicas na membrana PDMS (potência de 12 W, velocidade de varredura 106,68 mm / seg).
- Limpe a superfície hidrofóbicas com água DI para lavardistância os resíduos carbonizados na superfície.
- Ligue a entrada de ar de sucção e a bomba de vácuo através de uma válvula de solenóide (ver Figura 4). Conectar-se a válvula solenóide para o computador e controle com um módulo USB I / O digital.
3. Operação para a detecção de MNP na Plataforma Pneumática
Nota: Esta secção descreve a operação para identificar rapidamente o colorimetricamente e MNP na plataforma de manipulação gota pneumático (consulte a Figura 5). Todos os passos de ter lugar a 23 ° C (temperatura ambiente) e humidade relativa de 85%.
- Coloque a gota de amostra de ADN alvo (10 ul, 0,5 uM) sobre a área hidrofóbicas da plataforma de manipulação gota pneumático.
- Coloque a gota AUNP sonda (10 ul, 25 nM) sobre a área hidrofóbicas da plataforma de manipulação gota pneumático.
- Controlar a sucção de ar para fazer com que a deflexão da membrana PDMS com uma válvula solenóide e uma Siprograma mple (por exemplo, o LabVIEW). Fornecer de sucção de ar em cada câmara de ar ao longo do caminho de migração das gotículas (contendo DNA alvo e as sondas AUNP respectivamente) sobre a membrana de PDMS de tal modo que as gotículas colidem uns com os outros e coalescer. Usar uma pressão de funcionamento da bomba de vácuo de -80 kPa (pressão manométrica).
- Em alternativa, controlar a sucção de ar manualmente, desde que a gotícula é completamente misturado. Ao lado, ligar ou desligar a bomba de vácuo e entradas de câmara de ar com tubos nas fases iniciais de testes.
- Controlar o rolo de sucção de ar para a gotícula coalescida frente e para trás para aumentar a eficácia da mistura durante 3 min utilizando o sistema de controlo da válvula de solenóide. O DNA alvo e as sondas AUNP tornar-se bem misturados e hibridizados dentro de 3 min. Utilize uma frequência de condução e uma pressão de trabalho de 5 Hz e -80 kPa (pressão manométrica), respectivamente.
- Coloque uma gota contendo NH 2 OH (2 mL, 400 mM) e HAuCl4 (2 mL, 25,4 mM) sobre a área hidrofóbicas da plataforma de manipulação gota pneumático.
- Controlar a sucção de ar (-80 kPa pressão gauge) para permitir que as gotículas colidem uns com os outros e se aglutinam. Em seguida, controlar a sucção de ar (5 Hz e -80 kPa de pressão) para permitir que o rolo coalescida gota a frente e para trás para aumentar a eficiência de mistura durante 1 min.
- Meça e registre a cor da gota coalesceram com o olho nu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neste trabalho, três amostras de DNA foram testadas utilizando um método simples e inovador de detecção através do crescimento de DNA mediada por hibridação das sondas AUNP. As sequências de DNA sonda e amostras de DNA de três tipos, especificamente, o cDNA (totalmente complementar à sonda de DNA), TMDNA (três pares de bases de DNA incompatíveis) e SixMDNA (seis pares de bases de DNA incompatíveis) estão listados no Protocolo etapa 1. os desemparelhamentos para a sonda de ADN das amostras testadas aqui são tanto nos segmentos médios das amostras de DNA. a Figura 6 mostra as cores das soluções de crescimento AUNP para as amostras de ADN a uma concentração variada. Para o ADN perfeitamente combinados (ADNc), as tonalidades de soluções variam de rosa para índigo e, em seguida, para transparente com o aumento da concentração de ADN. Para TMDNA, a cor das soluções vai do rosa ao roxo escuro e depois para índigo, e por SixMDNA, a cor vai do rosa ao rosa escuro com o aumento da concentração de DNA. O separada D amostras de NA possuem afinidades de hibridização variadas ao DNA sonda que causou tamanho de crescimento variado de AUNP e cor variada de soluções. A amostra TMDNA, com três mutações de pares de bases da sonda, tem menos afinidade de hibridização do que a amostra de cDNA, o que causou um tamanho menor crescimento do AUNP. Como os resultados na Figura 6 mostram, existem distinções de cor entre as amostras de cDNA e TMDNA, especialmente a uma concentração de ADN grande. Através de muitos erros de emparelhamento com a sonda, a amostra SixMDNA tem uma fraca afinidade de hibridização com a sonda, o que resultou em alguns conjugados com dsADN AUNP, mesmo com a concentração de DNA maior do que 0,2 uM. O tamanho de crescimento de AUNP é pequena, por conseguinte, neste exemplo SixMDNA, fazendo com que a solução AUNP para mudar de cor de rosa para amaranto, que não é, obviamente, medido a olho nu. Com base nas imagens a cores, o ADNc, TMDNA SixMDNA e são mais ou menos diferenciada para uma concentração de DNA 0,11-0,50 uM.
_content "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Com os protocolos e métodos apresentados aqui, uma plataforma de manipulação baseada gota simples e inovador para a microfluídica-superfície aberta foi demonstrada usando sucção pneumática como uma força para gerar o. deformação da superfície da membrana de PDMS, o transporte fácil e manipulação de gotículas pode ser alcançado sem interrupção para o bio-amostra, de ADN, neste caso, nas gotículas (ver Figura 7A). a nova e visual detecção de MNP é demonstrada nesta pneumática plataforma de manipulação gota-superfície aberta. como resultado, como mostrado na Figura 7B, a detecção de uma emparelhamentos incorrectos do ADN pode ser facilmente observado a olho nu. no estado original, a sonda gota AUNP exibia uma cor vermelha. a absorção óptica máxima de sondas AUNP ocorre a 520 nm, o que é atribuído a uma ressonância de plasmon de superfície (SPR). Após a hibridação com as várias gotas de amostra de ADN, o duplex ADN-alvo-sonda de AUNP com um c totalmente omplementary DNA (cDNA) gota de amostra se tornou transparente como a característica SPR do aumento AUNP desapareceu. Em contraste, AUNP hibridizado com o DNA de três pares de bases incompatíveis (TMDNA) e seis pares de bases de DNA incompatíveis (SixMDNA) foram azul e roxo, respectivamente. Com esta abordagem, a plataforma proposta e método de detecção de ADN são combinados e feita de uma forma simples.
Figura 1. Princípio de detecção colorimétrica de MNP. O ADN de cadeia simples modificado com tiol (ssDNA) ou de ADN de cadeia dupla (dsDNA) da hibridização do ssADN modificado por tiol em AUNP influenciado o crescimento tamanho e forma do AUNP, e causaram propriedades ópticas variadas do AUNP. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Diagrama esquemático da plataforma de manipulação gota pneumático. Com um sistema de sucção pneumática como uma força para causar uma deflexão da membrana hidrofóbicas baseado em PDMS flexíveis, a gota sobre a membrana torna-se, assim, activado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.
Figura 3. A fabricação de uma plataforma de manipulação gota pneumático. A fabricação incluídos computador-numérico-controle micromachining (CNC), fundição ou replicação técnicas PDMS, e micromachining laser. Por favor clique aqui para ver uma largversão er desta figura.
Figura 4. Instalação experimental da plataforma de manipulação gota pneumático. A bomba de vácuo gerada uma sucção de ar para proporcionar uma pressão reduzida na câmara de ar e para fazer com que a deflexão da membrana PDMS para manipulação gota. A bomba de vácuo e a entrada do canal de ar estão conectados através da válvula solenóide. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Ilustração esquemática da operação desta técnica de detecção MNP. As gotículas contendo DNA alvo e as sondas AUNP são carregados na plataforma, misto e hybridized. A gotícula contendo ambos NH 2 OH e HAuCl 4 é carregado sobre a plataforma e misturou-se para o crescimento AUNP. Finalmente, o duplex de DNA alvo-sonda de AUNP deslocou o máximo de absorção e alterou a cor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. A variação de cor de várias amostras de DNA com a concentração. Para o ADN totalmente complementar (ADNc), as tonalidades de soluções variam de rosa para índigo com o aumento da concentração de ADN. Para TMDNA, a cor das soluções vai do rosa ao roxo escuro, e por SixMDNA, a cor vai do rosa ao rosa escuro com o aumento da concentração de DNA. Por favor clique aqui para ver um larversão ger desta figura.
Figura 7. Imagens de gotas na pneumática plataforma. A) imagens seriadas de transporte de gotas na plataforma pneumática com controle de ar de aspiração. B) Imagens da correspondente duplex DNA-alvo sonda de AUNP na plataforma manipulação gota pneumática proposto. As condições de funcionamento da frequência de excitação e a pressão de trabalho foram de 5 Hz e -80 kPa (pressão manométrica), respectivamente. No estado original, a sonda gota AUNP apresenta uma cor vermelha. O duplex de ADN-sonda de alvo AUNP na presença do ADNc era transparente. As sondas AUNP hibridizaram com o TMDNA e SixMDNA eram azul e roxo, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </ A>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste protocolo, um método colorimétrico simples para detectar MNP pode ser implementado em concentrações que variam de 0.11-0.50 uM em tubos de microcentrífuga. Além disso, o método de detecção MNP proposto é conduzida sobre uma plataforma de manipulação gota pneumático que tem um elevado potencial para o rastreio de ADN e outras aplicações biomédicas. Na prática, o intervalo da concentração detectável de ADN da amostra depende da eficiência de mistura dos plataformas operacionais. Para assegurar que a gota de coalescente é completamente misturado, o passo crítico neste protocolo é o controlo da aspiração de ar (pressão e frequência) que depende do tamanho da gotícula coalescida. A discrepância de afinidade de hibridação entre o ADN da amostra totalmente complementar e o ADN da amostra não correspondente é difícil distinguir a olho nu por um fragmento de sequência de ADN longa. A limitação desta técnica é a detecção, portanto, o comprimento do fragmento do ADN da amostra. Para amostras com longa DNA sequências, os tamanhos ou conformação do AUNP crescimento são semelhantes aos de amostras de ADN contendo vários desfasamentos variadas. Os descasamentos de amostras de DNA para a sonda aparecem no segmento médio neste protocolo. No caso de comprimentos idênticos e desemparelhamentos homoméricos de ADN da amostra, a posição dos desemparelhamentos podem também afectar o tamanho de afinidade de hibridização e de crescimento AUNP. Muitas doenças estão sendo rastreados para determinados genes defeituosos. As bases de dados do genoma para doenças específicas ainda estão se expandindo e melhorando. Uma vez que a variação da sequência de ADN do fragmento de ADN específico é confirmado para ser responsável por uma doença específica, a sonda especificamente concebida (com um comprimento apropriado e posição incompatibilidade do ADN) pode ser utilizado para adquirir o número de desemparelhamentos de ADN amostra para a sonda dentro da gama de concentração detectável com base já testados neste trabalho.
A plataforma de manipulação gota pneumático é proposto realizared em um ambiente aberto. A evaporação das gotículas aumenta a concentração de amostras de DNA e afecta a precisão da leitura colorimétrica. Para melhorar a precisão da análise de MNP, uma temperatura ambiente controlada e humidade são necessários. micromaquinação por laser foi aplicado para fabricar uma superfície hidrofóbicas na plataforma apresentada. O superhydrophobicity da membrana de PDMS não persiste sob várias iterações da manipulação de gotícula (> 20 vezes). A perda de superhydrophobicity diminui a mobilidade e manobrabilidade desta plataforma manipulação gota. Uma vez que a plataforma de manipulação gota perde a superhydrophobicity na superfície, o remodifying superhydrophobicity da membrana PDMS (Repita os passos 2,6-2,8) é necessária. A fabricação simples de uma superfície hidrofóbicas mais durável está sob consideração futura. Neste protocolo, usamos uma válvula solenóide e um programa de controle simples (com equipamentos de aquisição de dados) para controlar the de sucção de ar. O controlo de sucção de ar pode ser utilizado em outras formas, ou com equipamentos, incluindo mas não se limitando à utilização de uma válvula de solenóide.
Neste artigo, nós introduzimos a combinação de um método colorimétrico simples de detecção de DNA e uma plataforma de manipulação gota pneumático. Ambas as técnicas são únicos e altamente prospectiva; não foi encontrada método de detecção de ADN alternativa (que é rápida e visual) para alcançar os mesmos resultados. Várias técnicas de manipulação de gotas sobre uma superfície aberta incluindo optowetting, 22 dieletroforese, 23 electrowetting, 24 vibração 25 e térmicas capilares de atuação 26 foram relatados. As desvantagens de todas estas técnicas de manipulação de gotículas foram discutidos em nosso trabalho anterior. 20 A plataforma pneumática proposta é mais biocompatível do que os métodos acima mencionados.
Esta técnica para detectar polimorfismos de nucleótidos multi-óna plataforma gota manipulação pneumática é fácil para os pesquisadores da área bioquímica, o que significa que as amostras e reagentes podem ser directamente carregado e coletadas com pipetas. A integração da plataforma apresentada está sendo realizado com um sistema de controle automático e um design de uma interface de usuário para uso melhorado e ampla no futuro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| benchtop engravers | Roland DG | EGX-400 | |
| laser cutting machine | Universal Laser Systems, Inc. | VLS 3.50 | |
| Oxygen plasma treatment system | Femto Science Inc. Korea | CUTE-MPR | |
| solenoid valve | home built | ||
| vacuum pump | ULVAC KIKO, Inc. | DA-30D | |
| 13-nm AuNP solution | TAN Bead Inc., Taiwan | NG-13 | |
| DNA (with 5'-end labeled thiol) | MDBio, Inc., Taiwan | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | UniRegion Bio-Tech,. Taiwan | PBS001-1L | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | J. T. baker | 4095-04 | |
| Hydroxylamine solution (NH2OH) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Chloroauric acid (HAuCl4) | Sigma-Aldrich | G4022 | |
| sodium chloride (NaCl) | |||
| vortex mixer | Digisystem Laboratory Instruments Inc. | VM-2000 | |
| centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH. | Z 216 MK |
References
- Chorley, B. N., et al. Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies. Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).
- Hinds, D. A., et al. Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations. Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).
- Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. , 408 (2010).
- Whelan, S., Goldman, N. Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes. Genetics. 167 (4), 2027-2043 (2004).
- Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).
- Kim, S., Misra, A. SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).
- Kwok, P. Y., Chen, X. Detection of single nucleotide polymorphisms. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60 (2003).
- Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).
- Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles. Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).
- Storhoff, J. J., et al. Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system. Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).
- Bao, Y. P., et al. SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes. Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).
- Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases. Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).
- Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).
- Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes. Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).
- Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers. Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).
- Chen, L., Manz, A., Day, P. J. Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices. Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).
- Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform. Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).
- Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads. Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).
- Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics. Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).
- Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism. Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).
- Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).
- Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface. Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).
- Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation. J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).
- Lee, J., Kim, C. J. C. Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting. J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).
- Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes. Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).
- Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. Microfluidic actuation by modulation of surface stresses. Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).
