Summary
Dit werk geeft een eenvoudige en visuele methode om multi-nucleotide polymorfismen detecteren op een pneumatische druppel manipulatie platform. Met de voorgestelde werkwijze, het gehele experiment, met inbegrip druppeltje manipulatie en detectie van multi-nucleotide polymorfismen dergelijke kunnen bij 23 ° C zonder behulp van geavanceerde instrumenten.
Abstract
Een eenvoudige en visuele methode om multi-nucleotide polymorfisme (MNP) sporen werd uitgevoerd op een pneumatische druppel manipulatie platform een open oppervlak. Deze benadering van DNA colorimetrische detectie werd gebaseerd op de hybridisatie-gemedieerde groei van goud nanodeeltjes probes (AuNP probes). De groei afmeting en configuratie van de AuNP worden gedomineerd door het aantal DNA-monsters gehybridiseerd met de probes. Gebaseerd op de specifieke grootte-en vorm-afhankelijke optische eigenschappen van de nanodeeltjes, het aantal verkeerde paringen in een DNA-monster fragment de probes kan worden onderscheiden. De tests werden uitgevoerd via druppeltjes bevattende reagentia en DNA-monsters respectievelijk, en werden getransporteerd en gemengd op de pneumatische platform met de bediende pneumatische zuigkracht van de flexibele PDMS-gebaseerde superhydrophobic membraan. Druppeltjes gelijktijdig en nauwkeurig worden afgeleverd op een open-oppervlak op de voorgestelde pneumatische platform dat is zeer biocompatibel zonder zijde effect van DNA-monsters in de druppels. De combinatie van de twee voorgestelde methoden, kan de multi-nucleotide polymorfismen worden gedetecteerd op zicht op de pneumatische druppel manipulatie platform; geen extra instrument noodzakelijk. De procedure van het installeren van de druppels op het platform om het eindresultaat duurt minder dan 5 minuten, veel minder dan bij bestaande werkwijzen. Bovendien is deze gecombineerde MNP detectiebenadering vereist een monstervolume van 10 pl in elke operatie, hetgeen opmerkelijk lager is dan die van een macro systeem.
Introduction
Enkele nucleotide polymorfisme (SNP), dat een enkele basepaar verschil in een DNA-sequentie, is een van de meest voorkomende genetische variaties. Huidige studies rapporteren dat SNPs geassocieerd met de ziekte risico, drug werkzaamheid en bijwerkingen van individuen door beïnvloeding genfunctie. 1,2 recent onderzoek is ook gebleken dat twee of meerdere puntmutaties (multi-nucleotide polymorfisme) bepaalde ziekte veroorzaakt en individuele verschillen in de effecten van de ziekte. 3.4 de detectie van nucleotide polymorfisme is daarom noodzakelijk in prescreening ziekte. Eenvoudige en efficiënte werkwijzen voor de snelle detectie van sequentie-specifieke oligonucleotiden werden sterk ontwikkeld in de laatste twee decennia. 1,5 Huidige benaderingen voor DNA-mutaties typisch procedures waaronder probe immobilisatie fluorescentie labeling, gelelektroforese, etc. identificeren betrekken 6,7 maar deze methoden vereisen over het algemeen een lange analytisch proces, uitgasive apparatuur, goed opgeleide technici, en een aanzienlijk verbruik van de monsters en reagentia.
Een nanodeeltjes met een grote verhouding van oppervlak tot volume en unieke fysisch-chemische eigenschappen is een ideaal materiaal als een zeer gevoelige en goedkope detectie platform voor specifieke biomarkers. Gouden nanodeeltjes (AuNP) worden veel gebruikt voor DNA detectie vanwege hun grote vermogen om te worden gemodificeerd met oligonucleotideprobes. 8-10 SNP detectie technieken werden ontwikkeld met AuNP. 11-13 In dit werk wij een nieuwe benadering voor de colorimetrische detectie aangenomen multi-nucleotide polymorfisme (MNP) door middel van DNA-hybridisatie-gemedieerde groei van AuNP probes. 14 Deze eenvoudige en snelle indringende methode is gebaseerd op de theorie dat verschillende lengten van enkelstrengs DNA (ssDNA) of dubbelstrengs DNA (dsDNA) geconjugeerd aan AuNP invloed op de groei grootte en vorm van de AuNP (zie figuur 1). 15 Deze methode van detectie DNAheeft een klein verbruik van reagentia, een kleine test periode (enkele minuten), en een eenvoudige procedure zonder temperatuurregeling die prospectief toepasbaar voor klinische diagnose en huishoudelijke medische screening.
Verscheidene microfluïdische systemen voor de DNA-sequentie te detecteren zijn ontwikkeld; 16 deze microfluïdische systemen geëvolueerd van traditionele experimentele protocollen vereist minder stukken grootschalige apparatuur en vereenvoudigde de testprotocollen teneinde de gevoeligheid, detectielimiet en specificiteit van de DNA verbeteren biosensor. DNA detectiemethoden in de microfluïdische systemen nog vereisen echter instrumenten van een volgend proces, zoals een PCR (polymerasekettingreactie) machine voor signaalversterking en een fluorescentie lezer voor een uitlezing van de heterogene SNP identificeren. 17,18 ontwikkelen van een eenvoudige platform zonder verdere verwerking direct uitlezen van de resultaten van de multi-nucleotide polymorfismeis zeer gewenst. Vergeleken met goed gebruikt, conventioneel, gesloten microfluïdische systemen, de open oppervlak microfluïdische inrichtingen verscheidene voordelen, zoals een heldere optische pad een eenvoudige toegang tot het monster, een rechtstreekse milieu toegankelijkheid en niet gemakkelijk gevormd cavitatie of grensvlak obstructie in bieden veelbelovend het kanaal. 19 Ons voorgaand onderzoek werd een eenvoudige pneumatische platform open oppervlak druppel manipulatie (zie figuur 2). 20 op dit platform, druppeltjes kunnen gelijktijdig worden getransporteerd en gemanipuleerd zonder inmenging van een aandrijfenergie via een zuigkracht die een heeft een groot potentieel in de biologische en chemische toepassingen. Deze pneumatische platform wordt aldus gebruikt voor de manipulatie van DNA-monsters uitgevoerd voor MNP detectie in combinatie met de colorimetrische benadering hand van het begrip van DNA-hybridisatie-gemedieerde groei van AuNP probes.
Het protocol in dit document beschrijfteen eenvoudige visuele detectie van multi-nucleotide polymorfismen op de pneumatische druppel manipulatie platform een open oppervlak. Dit werk bevestigd dat meerdere nucleotide polymorfisme detecteerbaar met het blote oog; de voorgestelde pneumatische platform is geschikt voor biologische en chemische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Methode om MNP Detect
Let op: Dit gedeelte beschrijft de procedure voor het MNP te detecteren op basis van de hybridisatie-gemedieerde groei van goud nanodeeltjes.
- Bereid de DNA probe (5'-thiol-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 ') oplossing bij een concentratie van 100 uM.
- Bereid de probe DNA-gemodificeerde AuNP (AuNP sonde) deeltjes. 21
Opmerking: Het volume hier hangt af van de vereiste DNA probe-gemodificeerde AuNP (AuNP probe) deeltjes. Het is derhalve afhankelijk van het aantal experimenten uitgevoerd. We bereiden meestal overtollige AuNP sonde deeltjes als reserve. Het volume dat in deze stappen instelbaar en flexibel.- Voeg probe-DNA (100 uM, bereid in stap 1,1) een oplossing van gouden nanodeeltjes (13 nm, 17 nM) bij concentraties 1 OD / ml.
- Breng de eindconcentraties van natriumdodecylsulfaat (NaCl 12 H 25 SO 4, SDS) en fosfaatbuffer (PBS) met 0,01% en 0,01 M, respectively.
- Na 20 min, brengt de concentratie van natriumchloride (NaCl) tot 0,05 M met een oplossing van NaCI (2 M) en PBS (0,01 M) terwijl SDS bij 0,01% en incubeer gedurende 20 minuten.
- Verhoging van de NaCl-concentratie in stappen van 0,1 M tot een uiteindelijke concentratie van 1 M gedurende 20 minuten intervallen.
- Incubeer overnacht onder schudden op een vortex menger bij 23 ° C. De schudsnelheid niet zolang de DNA-monsters en AuNP probes worden gehybridiseerd beïnvloeden het experiment.
- Centrifugeer de gouden nanodeeltjes bij 7000 xg gedurende 30 seconden en de bovenstaande vloeistof.
- Voeg AuNP probe deeltjes in gedeïoniseerd water (DI water) bij een concentratie van 25 nM (AuNP probe-oplossing).
- Bereid doel DNA monsters (volledig complementair: 5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 ', drie basenpaar mismatched: 5'-TTT CTTGCCTAC ACCAGCTC-3', zes basenparen mismatched: 5'-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 ') bij concentratiesvan 0,06, 0,11, 0,17, 0,20, 0,30, 0,50 uM, respectievelijk.
- Voeg AuNP probe-oplossing (6 pl, 25 nM) in de DNA-monsters (350 ul) met NaCl (14 uM).
- Schud het mengsel van DNA-monsters en AuNP probes met een vortex menger bij 23 ° C gedurende 5 min voor DNA hybridisatie.
- Voor AuNP groei, voeg NH 2 OH (6 pl, 400 mM) en HAuCl 4 (6 pl, 25,4 mmol) aan de oplossing (het mengsel van DNA-monsters en AuNP probes). De groei van AuNP duurt ongeveer 30 seconden voor de voltooiing. De gestage verandering van kleur onderhoudt meer dan 1 uur.
LET OP: Huid contact met HAuCl 4 zou ernstige toxische effecten veroorzaken. Raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Draag handschoenen en gebruik een zuurkast bij het gebruik van HAuCl 4.
2. Fabricage van een pneumatische Droplet Manipulation Platform
Opmerking: De PDMS gebaseerde druppel manipulatie platform bestaat uit twee componenten: een PDMS membraan (100 pm) met een super-hydrofoob oppervlak en een lucht-kanaallaag (5 mm). Zonder MEMS proces werden de gemeenschappelijke bewerkingsprocessen gebruikt om deze inrichting die computer-numerieke besturing (CNC) micromachining omvat voor het maken van een mal, PDMS gieten en replicatie voor rapid prototyping van de microfluïdische componenten en laser micromachining fabriceren voor de vervaardiging van een super-hydrofoob oppervlak (zie Figuur 3).
- Gebruik de CNC machine voorzien van een boorkop (0,5 mm) tot PMMA-gebaseerde meester mallen (zie figuur 3) met microstructuren te produceren. Met een toevoersnelheid van de boorbeitel 7 mm / s en een rotatiesnelheid 26.000 rpm. Gebruik een luchtblazer en DI-water te verwijderen van de PMMA schroot en aan het oppervlak van de meester mallen te reinigen.
- Maak een mengsel van PDMS basis en de verharder in verhouding 10: 1. Ontgas het mengsel in een exsiccator gedurende 30 minuten of totdat alle luchtbellen worden verwijderd.
- Giet de PDMS in the meester schimmel en bak de PDMS gedurende 3 uur bij 60 ° C in de oven om de inverse microstructuren van de luchtkamers (PDMS membraan) en luchtkanalen (PDMS laag) te verkrijgen.
- Verwijder de PDMS laag van de meester mal (met de hand). Punch gaten in de PDMS laag voor lucht-zuig inhammen.
- Doe de PDMS membraan, de PDMS-laag en het glassubstraat in de kamer van de zuurstof-plasmabehandelsysteem. Na zuurstof plasmabehandeling, bond de PDMS membraan, de PDMS-laag en het glassubstraat samen op een verwarmingsplaat (90 ° C) gedurende 10 min.
- Zet de samengestelde chip in de laser-snijmachine (PDMS membraan naar boven). Importeer het DWG-bestand naar de superhydrophobic gebied (15 mm x 12 mm) te definiëren. Zie figuur 3. Direct graveren de PDMS membraan met een CO2-laser machine naar de superhydrophobic gebied op het PDMS membraan (vermogen 12 W, aftastsnelheid 106,68 mm / sec) te creëren.
- Reinig het superhydrophobic oppervlak met DI-water te wassenweg van de verkoolde resten aan de oppervlakte.
- Sluit de air-aanzuigmond en vacuümpomp via een magneetklep (zie figuur 4). Sluit de elektromagnetische klep naar de computer en controle met het digitale I / O-module USB.
3. Gebruik voor de detectie van MNP op de Pneumatische Platform
Opmerking: Dit hoofdstuk beschrijft de operatie om colorimetrisch en snel kan identificeren het MNP op de pneumatische druppel manipulatie platform (zie figuur 5). Alle stappen vinden plaats bij 23 ° C (omgevingstemperatuur) en relatieve vochtigheid 85%.
- Plaats het doelwit DNA monster druppel (10 ui, 0,5 uM) op het superhydrofobe oppervlak van de pneumatische druppel manipulatie platform.
- Plaats de sonde AuNP druppel (10 pi, 25 nM) aan het superhydrofobe oppervlak van de pneumatische druppel manipulatie platform.
- Controle van de lucht afzuigen om de afbuiging van de PDMS membraan veroorzaken met een elektromagnetische klep en een simple programma (bijvoorbeeld Labview). Verschaffen luchtaanzuiging in elke luchtkamer langs de migratie van de druppels (bevattende doel-DNA en AuNP probes respectievelijk) op de PDMS membraan zodat de druppeltjes botsen met elkaar samensmelten. Gebruik een bedrijfsdruk van de vacuümpomp van -80 kPa (overdruk).
- Als alternatief, de controle van de luchtaanzuiging handmatig zolang de druppel volledig gemengd. Met de hand, sluiten of te ontkoppelen van de vacuümpomp en inhammen van de luchtkamer met buizen in de vroege stadia van het testen.
- Controle van de lucht afzuigen van de samengevoegde druppel te rollen naar voren en naar achteren om het mengen van efficiëntie te verbeteren gedurende 3 minuten met behulp van het controlerende systeem van de elektromagnetische klep. Het doelwit DNA en AuNP sondes worden goed gemengd en gehybridiseerd binnen 3 min. Gebruik een aandrijffrequentie en een werkdruk van 5 Hz en -80 kPa (overdruk), respectievelijk.
- Plaats een druppel met NH 2 OH (2 pl, 400 mm) en HAuCl4 (2 pl, 25,4 mM) aan het superhydrofobe oppervlak van de pneumatische druppel manipulatie platform.
- Controle van de lucht afzuigen (-80 kPa overdruk) te laten de druppeltjes botsen met elkaar en samenvloeien. controle dan de lucht zuigkracht (5 Hz en -80 kPa overdruk) te laten de samengevoegde druppel roll naar voren en naar achteren om het mengen van efficiëntie te verbeteren gedurende 1 min.
- Meet en noteer de kleur van de samengevoegde druppel met het blote oog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit werk werden drie DNA monsters getest met een eenvoudige en nieuwe detectie- door DNA-hybridisatie-gemedieerde groei van de AuNP probes. De sequenties van de probe DNA en DNA-monsters van drie soorten specifiek cDNA (volledig complementair aan DNA sonde), TMDNA (drie basenparen mismatched DNA) en SixMDNA (zes basenparen mismatched DNA) zijn vermeld in Protocol stap 1. de mismatches met de sonde van de hier geteste DNA monsters zowel het middensegment van de DNA-monsters. Figuur 6 toont de kleuren van de groei AuNP oplossingen voor de DNA monsters bij verschillende concentraties. De perfect passende DNA (cDNA), de tinten van oplossingen variëren van roze tot indigo en transparant met toenemende DNA-concentratie. Voor TMDNA, de kleur van de oplossing gaat van roze tot donkerpaars en vervolgens indigo en voor SixMDNA, de kleur gaat van roze tot donkerroze met toenemende DNA-concentratie. De afzonderlijke D NA monsters bezitten gevarieerd hybridisatie affiniteiten aan de sonde DNA dat gevarieerde groei omvang van AuNP en gevarieerde kleur van oplossingen veroorzaakt. TMDNA het monster met drie basenpaar mutatie van de probe hybridisatie minder affiniteit dan het cDNA monster dat een kleinere toename van de omvang AuNP veroorzaakt. Zoals de resultaten in Figuur 6 tonen, zijn er verschillen tussen kleuren CDNA en TMDNA monsters, vooral bij een groot DNA-concentratie. Door vele mismatches met de probe, SixMDNA monster een zwak hybridisatie affiniteit voor de sonde, waardoor een paar dsDNA geconjugeerd aan AuNP, zelfs met de DNA concentratie dan 0,2 uM. De groei grootte van AuNP derhalve klein in deze SixMDNA monster, waardoor de AuNP oplossing verandert van roze tot amarant, die niet duidelijk wordt gemeten met het blote oog. Op basis van de kleurenbeelden, het cDNA, TMDNA en SixMDNA ruwweg gesplitste een DNA-concentratie 0,11-0,50 uM.
_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Met de protocollen en methoden die hier gepresenteerd, een eenvoudige en nieuwe-druppel op basis van manipulatie platform voor open-oppervlak microfluidics werd aangetoond met behulp van pneumatische zuigkracht als een kracht om het te genereren. oppervlak vervorming van de PDMS membraan, het gemakkelijke transport en manipulatie van druppeltjes kan worden bereikt zonder onderbreking van de bio-monster DNA in dit geval, in de druppeltjes (zie figuur 7A). de nieuwe visuele detectie van MNP wordt gedemonstreerd op deze pneumatische open oppervlak druppel manipulatie platform. Hierdoor zoals getoond in figuur 7B, de detectie van een DNA mismatch gemakkelijk waarneembaar met het blote oog. in het origineel, de AuNP probe druppel vertoonde een rode kleur. de maximale optische absorptie van AuNP probes optreedt bij 520 nm, die wordt toegeschreven aan een oppervlak-plasmon resonantie (SPR). Na hybridisatie met de verschillende DNA-monster druppeltjes, de target-probe-DNA duplex van AuNP met een volledig c ANVULLENDE DNA (CDNA) sample druppeltje werd transparant als de SPR kenmerk van de toegenomen AuNP verdwenen. Daarentegen AuNP hybridiseerde met de drie basenparen mismatched DNA (TMDNA) en zes basenparen mismatched DNA (SixMDNA) waren respectievelijk blauw en paars. Met deze benadering, het voorgestelde platform en werkwijze voor DNA detectie gecombineerd en bereikt op een eenvoudige manier.
Figuur 1. Principe van colorimetrische detectie van MNP. De thiol-gemodificeerde enkelstrengs DNA (ssDNA) of dubbelstrengs DNA (dsDNA) van de hybridisatie van de thiol-gemodificeerde ssDNA op AuNP beïnvloed de groei grootte en vorm van de AuNP, en veroorzaakte verschillende optische eigenschappen van de AuNP. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Schematische weergave van de pneumatische druppel manipulatie platform. Met een pneumatische zuigkracht als een kracht tot een verlegging van de flexibele PDMS-gebaseerde superhydrophobic membraan veroorzaken, de druppel op het membraan wordt daarbij ingeschakeld. Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.
Figuur 3. Fabricage van een pneumatische druppel manipulatie platform. De fabricage opgenomen computer-numerieke-control (CNC) micromachining, PDMS gieten of replicatie technieken, en laser micromachining. Klik hier om een larg bekijkenER versie van deze figuur.
Figuur 4. Experimentele opzet van de pneumatische druppel manipulatie platform. De vacuümpomp genereerde een luchtaanzuiging een verminderde druk in de luchtkamer en om de doorbuiging van het PDMS membraan druppel manipulatie veroorzaken. De vacuümpomp en de inlaat van het luchtkanaal zijn verbonden door middel van het magneetventiel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Schematische weergave van de werking van deze MNP detectietechniek. De druppels bevattende doel-DNA en de AuNP probes worden geladen op het platform, gemengd en hybridized. De druppel die zowel NH 2 OH en HAuCl 4 is geplaatst op het platform en gemengd AuNP groei. Ten slotte is de target-probe-DNA-duplex van AuNP verschoof de maximale absorptie en veranderde de kleur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. variatie van de kleur van verschillende DNA monsters met de concentratie. Voor het volledig complementair DNA (cDNA), de tinten van oplossingen variëren van roze tot indigo met toenemende DNA-concentratie. Voor TMDNA, de kleur van de oplossingen gaat van roze tot donkerpaars, en voor SixMDNA, de kleur gaat van roze tot donkerroze met toenemende DNA-concentratie. Klik hier om een LAR bekijkenger versie van deze figuur.
Figuur 7. Beelden van druppel op de pneumatische platform. A) Serial beelden van de druppel transport op de pneumatische platform met controle door de lucht afzuigen. B) Foto's van de corresponderende target-probe-DNA-duplex van AuNP over de voorgestelde pneumatische druppel manipulatie platform. De werkomstandigheden van de drijvende frequentie en de werkdruk waren 5 Hz en -80 kPa (overdruk), respectievelijk. In de oorspronkelijke staat, de AuNP sonde druppel vertoont een rode kleur. Het doelwit-DNA probe duplex van AuNP in aanwezigheid van het cDNA was transparant. De AuNP probes gehybridiseerd met de TMDNA en SixMDNA waren blauw en respectievelijk paars. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien. </ A>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol, een eenvoudige colorimetrische methode voor het opsporen MNP kunnen in concentraties variërend 0,11-0,50 uM in reactievaatjes uitgevoerd. Verder is de voorgestelde MNP detectiemethode uitgevoerd op een pneumatische druppel manipulatie platform met een sterk vermogen voor het screenen van DNA en andere biomedische toepassingen heeft. In de praktijk, het detecteerbare bereik van het monster DNA-concentratie is afhankelijk van het mengrendement van de besturingsplatformen. Opdat de samengevoegde druppel volledig gemengd, de kritische stap in dit protocol is de controle van de luchtzuiging (spanning en frequentie) die afhankelijk van de grootte van de samengevoegde druppels. Het verschil van hybridisatie affiniteit tussen de volledig complementair monster DNA en de niet passende monster DNA is moeilijk te onderscheiden met het blote oog voor een lange DNA-fragment. De beperking van deze detectietechniek is derhalve het fragment lengte van het monster DNA. Voor monsters met een lange DNA sequenties, de grootte of conformatie van de groei AuNP zijn vergelijkbaar met die van verschillende DNA monsters met verschillende mismatches. De mismatches van DNA-monsters aan de sonde verschijnen in het middensegment in dit protocol. Van gelijke lengte en homomere mismatches monster DNA, kan de positie van de mismatches beïnvloeden ook de hybridisatie affiniteit en groei omvang van AuNP. Veel ziekten worden momenteel terug te voeren op bepaalde defecte genen. Het genoom databanken voor specifieke ziekten zijn nog steeds uit te breiden en te verbeteren. Zodra de DNA sequentie variatie van het specifieke DNA fragment wordt bevestigd verantwoordelijk voor een specifieke ziekte te zijn, kan het specifiek probe (met een geschikte lengte en mismatch positie van het DNA) worden gebruikt om het aantal mismatches monster DNA de verwerven sonde binnen het detecteerbare concentratiebereik op basis reeds onderzocht met dit werk.
De voorgestelde pneumatische druppel manipulatie platform is uit te voerened in een open omgeving. De verdamping van druppels verhoogt de concentratie van DNA-monsters en kan de nauwkeurigheid van de colorimetrische uitlezing. Om de nauwkeurigheid van MNP analyse te verbeteren, een gecontroleerde omgevingstemperatuur en vochtigheid vereist. Laser micromachining werd aangebracht op een superhydrofoob oppervlak fabriceren in de gepresenteerde platform. De superhydrophobicity van het PDMS membraan niet blijven bestaan onder vele iteraties van de druppel manipulatie (> 20 keer). Het verlies van superhydrophobicity vermindert de mobiliteit en wendbaarheid van deze druppel manipulatie platform. Zodra de druppel manipulatie platform de superhydrophobicity verliest aan de oppervlakte, remodifying de superhydrophobicity van de PDMS membraan (herhaal stappen 2,6-2,8) is vereist. De eenvoudige fabricage van een meer duurzame superhydrophobic oppervlak is bij toekomstige overweging. In dit protocol, gebruikten we een solenoïdeklep en een eenvoudige controle programma (met data acquisitie apparatuur) te controleren the lucht afzuigen. De controle van luchtzuiging kan worden toegepast op andere manieren of met apparatuur waaronder maar niet beperkt tot het gebruik van een elektromagnetische klep.
In dit manuscript introduceerden we de combinatie van een eenvoudige colorimetrische werkwijze voor DNA detectie en pneumatische druppel manipulatie platform. Beide technieken zijn uniek en zeer prospectieve; We vonden geen andere DNA detectiemethode (die zowel snel en visueel) om dezelfde resultaten te bereiken. Verscheidene druppeltje manipulatietechnieken op een open oppervlak zoals optowetting, 22 dielectrophoresis, 23 electrowetting, 24 en 25 trillingen thermos-capillaire bediening 26 gemeld. De nadelen van al deze druppel manipulatietechnieken werden in ons eerdere werk besproken. 20 De voorgestelde pneumatische platform is meer biocompatibel dan de hiervoor genoemde methoden.
Deze techniek om meerdere nucleotide polymorfismen detecteren ona pneumatische druppeltje manipulatie platform is eenvoudiger voor onderzoekers op het gebied van biochemische, wat betekent dat monsters en reagentia direct kunnen worden geladen en verzameld pipetten. De integratie van de gepresenteerde platform wordt uitgevoerd met een automatisch controlesysteem en een ontwerp van een gebruikersinterface voor verbeterde en breed gebruik in de toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| benchtop engravers | Roland DG | EGX-400 | |
| laser cutting machine | Universal Laser Systems, Inc. | VLS 3.50 | |
| Oxygen plasma treatment system | Femto Science Inc. Korea | CUTE-MPR | |
| solenoid valve | home built | ||
| vacuum pump | ULVAC KIKO, Inc. | DA-30D | |
| 13-nm AuNP solution | TAN Bead Inc., Taiwan | NG-13 | |
| DNA (with 5'-end labeled thiol) | MDBio, Inc., Taiwan | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | UniRegion Bio-Tech,. Taiwan | PBS001-1L | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | J. T. baker | 4095-04 | |
| Hydroxylamine solution (NH2OH) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Chloroauric acid (HAuCl4) | Sigma-Aldrich | G4022 | |
| sodium chloride (NaCl) | |||
| vortex mixer | Digisystem Laboratory Instruments Inc. | VM-2000 | |
| centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH. | Z 216 MK |
References
- Chorley, B. N., et al. Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies. Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).
- Hinds, D. A., et al. Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations. Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).
- Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. , 408 (2010).
- Whelan, S., Goldman, N. Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes. Genetics. 167 (4), 2027-2043 (2004).
- Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).
- Kim, S., Misra, A. SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).
- Kwok, P. Y., Chen, X.
- Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).
- Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles. Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).
- Storhoff, J. J., et al. Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system. Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).
- Bao, Y. P., et al. SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes. Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).
- Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases. Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).
- Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).
- Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes. Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).
- Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers. Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).
- Chen, L., Manz, A., Day, P. J. Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices. Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).
- Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform. Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).
- Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads. Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).
- Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics. Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).
- Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism. Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).
- Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).
- Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface. Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).
- Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation. J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).
- Lee, J., Kim, C. J. C. Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting. J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).
- Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes. Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).
- Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. Microfluidic actuation by modulation of surface stresses. Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).
