Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

كشف اللونية البصرية من متعدد النوكليوتيدات تعدد الأشكال على منصة التلاعب هوائي القطرة

Published: September 27, 2016 doi: 10.3791/54424
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Mechanical Engineering, National Taiwan University

Summary

يعرض هذا العمل طريقة بسيطة والبصرية للكشف عن الأشكال المتعددة النوكليوتيدات على منصة قطرة التلاعب الهوائية. مع الطريقة المقترحة، التجربة بأكملها، بما في ذلك التلاعب الحبرية والكشف عن الأشكال المتعددة النوكليوتيدات، لا يمكن أن يؤديها قرب 23 درجة مئوية بدون مساعدة من الأدوات المتقدمة.

Abstract

تم تنفيذ وهناك طريقة بسيطة والبصرية للكشف عن تعدد الأشكال المتعددة النوكليوتيدات (MNP) على منصة قطرة التلاعب الهوائية على سطح مفتوح. واستند هذا النهج لاكتشاف الحمض النووي اللونية على النمو بوساطة التهجين تحقيقات جسيمات متناهية الصغر الذهب (تحقيقات AuNP). ويهيمن على حجم النمو وتكوين AuNP من قبل عدد من عينات من الحمض النووي تهجين مع تحقيقات. وبناء على الخصائص البصرية size- والتي تعتمد على شكل معينة من الجسيمات النانوية، وعدد من عدم التطابق في جزء عينة من الحمض النووي للتحقيقات قادر على ان يكون هناك تمييز. وأجريت الاختبارات عبر قطرات تحتوي على الكواشف وعينات من الحمض النووي على التوالي، وتم نقلها ومختلطة على منصة الهوائية مع شفط هوائي تسيطر الغشاء superhydrophobic أساس PDMS مرنة. قطرات يمكن تسليمها في وقت واحد وعلى وجه التحديد على سطح الطلق على منصة الهوائية المقترحة التي هي حيويا للغاية مع أي ممثل المؤسسة الجانبإلخ من عينات من الحمض النووي داخل قطرات. الجمع بين الأساليب المقترحة اثنين، يمكن أن يتم الكشف عن تعدد الأشكال المتعددة النوكليوتيدات وهلة على منصة الهوائية قطرة التلاعب. لا يلزم أداة إضافية. الإجراء من تثبيت قطرات على منصة إلى النتيجة النهائية تستغرق أقل من 5 دقائق، وأقل بكثير من الطرق الحالية. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج المشترك كشف حركة الأشخاص الطبيعيين يتطلب حجم العينة من ميكرولتر 10 فقط في كل عملية، وهو أقل بشكل ملحوظ من أن نظام الكلي.

Introduction

وحيدة النكليوتيد تعدد الأشكال (SNP)، وهو فارق قاعدة زوج واحد في تسلسل الحمض النووي، هي واحدة من التغيرات الجينية الأكثر شيوعا. وتفيد الدراسات الحالية أن تعدد الأشكال ترتبط مع خطر المرض، نجاعة الأدوية والآثار الجانبية للأفراد عن طريق التأثير في وظيفة الجين. وكشف 1،2 الدراسات الحديثة أيضا أن الطفرات سنتين أو متعددة النقاط (متعدد النوكليوتيدات تعدد الأشكال) تسبب أمراض معينة، والفرد الاختلافات في آثار المرض. 3،4 والكشف عن تعدد الأشكال النوكليوتيدات ذلك فمن الضروري في الغربلة المرض. طرق بسيطة وفعالة للكشف السريع للأليغنوكليوتيد] تسلسل معين ودرجة عالية من التطور في العقدين الماضيين. 1،5 المناهج الحالية لتحديد الطفرات الحمض النووي عادة ما ينطوي على إجراءات بما في ذلك تجميد التحقيق، مضان وضع العلامات، وهلام الكهربائي، وما إلى ذلك، 6،7 ولكن هذه الأساليب تتطلب عادة عملية تحليلية طويلة، expenمعدات SIVE والفنيين المدربين تدريبا جيدا، واستهلاك كبير من العينات والكواشف.

وجسيمات متناهية الصغر مع نسبة كبيرة من المساحة السطحية لحجم وخصائص الفيزيائية فريدة من نوعها هو مادة مثالية كمنصة كشف حساسة للغاية ورخيصة للمؤشرات حيوية محددة. وتستخدم جزيئات الذهب (AuNP) على نطاق واسع للكشف عن الحمض النووي نظرا لقدرتها الكبيرة التي يمكن تعديلها مع تحقيقات قليل النوكليوتيد. وقد وضعت 8-10 تقنيات الكشف SNP أيضا باستخدام AuNP 11-13 في هذا العمل اعتمدنا نهجا اللونية رواية للكشف عن متعددة النوكليوتيدات تعدد الأشكال (MNP) من خلال الحمض النووي النمو بوساطة التهجين تحقيقات AuNP 14 يستند هذا الأسلوب يحقق بسيط وسريع على النظرية القائلة بأن أطوال مختلفة من الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل (ssDNA) أو المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي (dsDNA) مترافق ل AuNP التأثير على حجم النمو وشكل AuNP (انظر الشكل 1). 15 هذه الطريقة في الكشف عن الحمض النووييتميز استهلاك قليل من الكواشف، مدة الفحص صغيرة (بضع دقائق)، وإجراء بسيط دون رقابة الحرارية التي تنطبق بأثر رجعي للتشخيص السريري والفحص الطبي المحلي.

وقد تم تطوير عدة أنظمة الموائع الدقيقة للكشف عن تسلسل الحمض النووي (16)؛ تلك النظم الموائع الدقيقة، تطورت من البروتوكولات التجريبية التقليدية، مطلوب قطع أقل من معدات واسعة النطاق وتبسيط البروتوكولات التجريبية وذلك لتحسين حساسية، والحد من الكشف وخصوصية الحمض النووي جهاز الاستشعار البيولوجي. طرق اكتشاف الحمض النووي في أنظمة الموائع الدقيقة لا تزال تتطلب، ومع ذلك، أدوات عملية لاحقة مثل PCR (تفاعل البلمرة المتسلسل) آلة لتضخيم إشارة وقارئ مضان لقراءات واحدة لتحديد SNP غير المتجانسة. 17،18 تطوير بسيط منصة دون معالجة لاحقة لقراءة مباشرة من نتائج تعدد الأشكال المتعددة النوكليوتيداتغير مرغوب فيه للغاية. مقارنة مع استخدامها بشكل جيد، التقليدية، أغلقت أنظمة الموائع الدقيقة، وأرض مفتوحة أجهزة ميكروفلويديك تقدم اعدة العديد من المزايا، مثل مسار واضح البصرية، وسيلة سهلة للوصول إلى عينة، والوصول البيئي المباشر والتجويف لا يسهل تشكيلها أو عرقلة بينية في عرض قناة 19 عملنا السابق منصة الهوائية بسيطة لسطح مفتوح قطرة التلاعب (انظر الشكل 2). 20 وعلى هذا المنبر، قطرات يمكن نقلها في وقت واحد والتلاعب به دون تدخل من الطاقة الدافعة باستخدام قوة شفط، والتي لديها امكانات كبيرة في التطبيقات البيولوجية والكيميائية. وهكذا تستخدم هذه المنصة الهوائية لتنفيذ التلاعب في عينات من الحمض النووي للكشف عن حركة الأشخاص الطبيعيين في تركيبة مع النهج اللونية باستخدام مفهوم الحمض النووي النمو بوساطة التهجين تحقيقات AuNP.

يصف بروتوكول المعروضة في هذه الورقةكشف بصري بسيط من الأشكال متعددة النوكليوتيدات على منصة الهوائية قطرة التلاعب على سطح مفتوح. هذا العمل يؤكد متعددة النوكليوتيدات تعدد الأشكال هو كشفها بالعين المجردة. منصة الهوائية المقترحة هي مناسبة للتطبيقات البيولوجية والكيميائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. طريقة لكشف حركة الأشخاص الطبيعيين

ملاحظة: يصف هذا القسم الإجراء للكشف عن حركة الأشخاص الطبيعيين على أساس النمو بوساطة التهجين من جزيئات الذهب.

  1. تحضير الحمض النووي التحقيق (5'-ثيول-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 ') الحل عند تركيز 100 ميكرومتر.
  2. إعداد AuNP تعديل الحمض النووي التحقيق (AuNP التحقيق) الجسيمات. 21
    ملاحظة: حجم المستخدمة هنا يعتمد على متطلبات الجسيمات AuNP تعديل الحمض النووي التحقيق (AuNP التحقيق). أنها تعتمد بالتالي على عدد من التجارب لإجراء. نحن نستعد عادة الزائدة جزيئات AuNP التحقيق كما قطع الغيار. الحجم المستخدم في هذه الخطوات هو قابل للتعديل ومرنة.
    1. إضافة الحمض النووي التحقيق (100 ميكرومتر، أعدت في الخطوة 1.1) إلى حل من جزيئات الذهب (13 نانومتر و 17 نانومتر) في تركيز 1 OD / مل.
    2. جلب تركيزات النهائي من كبريتات الصوديوم دوديسيل (NAC 12 H 25 SO 4، SDS) والفوسفات عازلة (PBS) إلى 0.01٪ و 0.01 م، التواليذ.
    3. بعد 20 دقيقة، وجلب تركيز كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) إلى 0.05 M مع محلول كلوريد الصوديوم (2 م) وبرنامج تلفزيوني (0.01 م) مع الحفاظ على SDS عند 0.01٪ واحتضان لمدة 20 دقيقة.
    4. زيادة تركيز كلوريد الصوديوم في الزيادات من 0.1 M إلى التركيز النهائي من 1 م أكثر من 20 فترات دقيقة.
    5. احتضان بين عشية وضحاها مع اهتزاز على خلاط دوامة في 23 درجة مئوية. سرعة اهتزاز لا يؤثر على التجربة طالما أن عينات الحمض النووي وتحقيقات AuNP تصبح المهجنة.
    6. أجهزة الطرد المركزي لجزيئات الذهب في 7000 x ج لمدة 30 ثانية، وإزالة طاف.
  3. إضافة جزيئات التحقيق AuNP في الماء منزوع الأيونات (DI الماء) بتركيز 25 نانومتر (AuNP تحقيق الحل).
  4. إعداد عينات من الحمض النووي الهدف (التكميلية بالكامل: 5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 '؛ ثلاثة قاعدة الزوج متطابقة: 5'-CTTGCCTAC TTT ACCAGCTC-3'؛ ستة قاعدة الزوج متطابقة: 5'-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 ') بتركيزات0.06، 0.11، 0.17، 0.20، 0.30، 0.50 ميكرومتر، على التوالي.
  5. إضافة حل التحقيق AuNP (6 ميكرولتر، 25 نانومتر) في عينات من الحمض النووي (350 ميكرولتر) مع كلوريد الصوديوم (14 ميكرومتر).
  6. يهز خليط من عينات الحمض النووي وتحقيقات AuNP مع خلاط دوامة في 23 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتهجين الحمض النووي.
  7. للنمو AuNP، إضافة NH 2 OH (6 ميكرولتر، 400 ملم) وHAuCl 4 (6 ميكرولتر، 25.4 ملم) في حل (خليط من عينات الحمض النووي وتحقيقات AuNP). نمو AuNP يستغرق حوالي 30 ثانية لإكمال. التغيير المستمر للتلوين يحافظ على أكثر من 1 ساعة.
    تنبيه: ملامسة الجلد مع HAuCl 4 قد تنتج تأثيرات سمية شديدة. يرجى الرجوع إلى بيانات سلامة المواد (MSDS) قبل الاستخدام. يرجى ارتداء القفازات واستخدام خزانة الدخان عند استخدام HAuCl 4.

2. تلفيق من منصة التلاعب هوائي القطرة

ملاحظة: وتضم منصة قطرة التلاعب القائم PDMS-عنصرين: Pغشاء DMS (100 ميكرون) مع سطح فائقة مسعور وطبقة الهواء قناة (5 ملم). دون عملية ممس، واستخدمت في عمليات تصنيع مشتركة لتصنيع هذا الجهاز، الذي يتضمن التحكم في الكمبيوتر العددي (CNC) متناهي الصغر لصنع القالب، صب PDMS والنسخ المتماثل لالنماذج الأولية السريعة من مكونات الموائع الدقيقة، ومتناهي الصغر ليزر لتصنيع سطح فائقة مسعور (انظر الشكل 3).

  1. استخدام آلة التصنيع باستخدام الحاسب الآلي مجهزة مثقاب (0.5 ملم) لإنتاج القوالب الرئيسية القائمة على PMMA (انظر الشكل 3) مع المجهرية. استخدام سرعة تغذية للمثقاب 7 ملم / ثانية ومعدل دوران 26،000 دورة في الدقيقة. استخدام منفاخ الهواء والماء DI لإزالة الخردة PMMA ولتنظيف السطح من القوالب الرئيسية.
  2. تحضير خليط من القاعدة PDMS وكيل علاج في نسبة 10: 1. ديغا الخليط داخل المجفف لمدة 30 دقيقة، أو حتى يتم إزالة جميع فقاعات الهواء.
  3. صب PDMS إلى عشرالبريد القالب الرئيسي وخبز PDMS لمدة 3 ساعة على 60 درجة مئوية في الفرن للحصول على المجهرية معكوس غرف الهواء (PDMS الغشاء) وقنوات الهواء (طبقة PDMS).
  4. إزالة طبقة PDMS من القالب الرئيسي (باليد). لكمة ثقوب في طبقة PDMS لمداخل الهواء شفط.
  5. وضع غشاء PDMS، وطبقة PDMS والركيزة الزجاج في غرفة من نظام معالجة الأكسجين البلازما. بعد العلاج الأكسجين البلازما، السندات الغشاء PDMS، وطبقة PDMS والركيزة الزجاج معا على موقد (90 درجة مئوية) لمدة 10 دقيقة.
  6. وضع رقاقة مركب في آلة القطع بالليزر (PDMS الجانب غشاء متابعة). استيراد الملف .dwg لتحديد منطقة superhydrophobic (15 ملم × 12 ملم). انظر الشكل 3. نقش مباشرة الغشاء PDMS مع آلة -laser CO 2 لإنشاء منطقة superhydrophobic على الغشاء PDMS (قوة 12 واط، والمسح الضوئي سرعة 106.68 ملم / ثانية).
  7. تنظيف السطح superhydrophobic بالماء DI لغسلبعيدا عن بقايا متفحمة على السطح.
  8. ربط مدخل الهواء شفط ومضخة فراغ من خلال صمام الملف اللولبي (انظر الشكل 4). ربط صمام الملف اللولبي إلى الكمبيوتر والتحكم مع I / O وحدة USB الرقمية.

3. عملية لكشف حركة الأشخاص الطبيعيين على منصة تعمل بالهواء المضغوط

ملاحظة: يصف هذا القسم عملية لتحديد colorimetrically وبسرعة حركة الأشخاص الطبيعيين على منصة الهوائية قطرة التلاعب (انظر الشكل 5). جميع الخطوات تجري في 23 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة) ورطوبة نسبية 85٪.

  1. وضع الحمض النووي الهدف عينة قطرة (10 ميكرولتر و 0.5 ميكرومتر) على المنطقة superhydrophobic للالهوائية منصة قطرة التلاعب.
  2. وضع مسبار قطرة AuNP (10 ميكرولتر، 25 نانومتر) على المنطقة superhydrophobic للالهوائية منصة قطرة التلاعب.
  3. السيطرة على شفط الهواء للتسبب في انحراف الغشاء PDMS مع صمام الملف اللولبي والاشتراكيةبرنامج mple (على سبيل المثال، ابفيف). توفير شفط الهواء في كل غرفة الهواء على طول مسار الهجرة من قطرات (التي تحتوي على الحمض النووي الهدف وتحقيقات AuNP على التوالي) على الغشاء PDMS بحيث قطرات تصطدم مع بعضها البعض، وتلتحم. استخدام ضغط العمل للمضخة فراغ -80 كيلو باسكال (قياس الضغط).
    1. بدلا من ذلك، والسيطرة على شفط الهواء يدويا طالما الحبرية مختلطة تماما. من جهة، ربط أو فصل مضخة فراغ ومداخل من غرفة الهواء مع أنابيب في المراحل المبكرة من الاختبار.
  4. السيطرة على شفط الهواء للفة قطرات ملتئم إلى الأمام والخلف لتعزيز كفاءة خلط لمدة 3 دقائق باستخدام نظام التحكم في صمام الملف اللولبي. الحمض النووي الهدف وتحقيقات AuNP أصبحت تمتزج جيدا والمهجنة خلال 3 دقائق. استخدام تردد القيادة وضغط العمل من 5 هرتز و-80 كيلو باسكال (قياس الضغط)، على التوالي.
  5. وضع قطرات تحتوي على NH 2 OH (2 ميكرولتر، 400 ملم) وHAuCl4 (2 ميكرولتر، 25.4 ملم) على المنطقة superhydrophobic للالهوائية منصة قطرة التلاعب.
  6. السيطرة على شفط الهواء (-80 كيلو باسكال قياس الضغط) للسماح للقطرات تصطدم مع بعضها البعض، وتتجمع. بعد ذلك السيطرة على شفط الهواء (5 هرتز و-80 كيلو باسكال قياس الضغط) للسماح لللفة قطرات ملتئم إلى الأمام والخلف لتعزيز كفاءة خلط لمدة 1 دقيقة.
  7. قياس وتسجيل لون قطرات ملتئم بالعين المجردة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا العمل، تم اختبار ثلاث عينات الحمض النووي باستخدام طريقة بسيطة ورواية الكشف من خلال النمو بوساطة التهجين الحمض النووي للتحقيقات AuNP. تسلسل الحمض النووي التحقيق وعينات من الحمض النووي من ثلاثة أنواع، على وجه التحديد، كدنا] (مكملة تماما للتحقيق DNA)، TMDNA (ثلاثة قاعدة الزوج الحمض النووي متطابقة)، وSixMDNA (ستة قاعدة الزوج الحمض النووي متطابقة) مدرجة في بروتوكول الخطوة 1. عدم التطابق في التحقيق في عينات من الحمض النووي اختبار هنا على حد سواء في القطاعات الوسطى من عينات من الحمض النووي. ويبين الشكل 6 ألوان حلول AuNP النمو لعينات من الحمض النووي في تركيز متنوع. لDNA مطابقة تماما (كدنا])، والأشكال من الحلول تختلف من الوردي إلى اللون النيلي ثم إلى شفاف مع زيادة تركيز الحمض النووي. لTMDNA، لون حلول يذهب من الوردي إلى البنفسجي الغامق ثم النيلي، ولSixMDNA، لون غني من الوردي إلى الوردي الداكن مع زيادة تركيز الحمض النووي. مد منفصل عينات NA تمتلك الانتماءات التهجين متنوعة على الحمض النووي التحقيق التي تسببت في حجم النمو المتنوع AuNP واللون متنوعة من الحلول. العينة TMDNA، مع ثلاثة طفرة قاعدة الزوج من التحقيق، وأقل تقارب تهجين من العينة كدنا]، والتي تسببت في حجم النمو أصغر من AuNP. كما أن النتائج في الشكل 6 المعرض، هناك فوارق اللون بين كدنا] وعينات TMDNA، لا سيما في تركيز الحمض النووي كبير. من خلال العديد من حالات عدم التطابق مع لجنة التحقيق، SixMDNA العينة لديها ضعف تقارب التهجين إلى التحقيق، والتي أسفرت عن عدد قليل من dsDNA مترافق إلى AuNP، حتى مع تركيز الحمض النووي أكبر من 0.2 ميكرومتر. حجم نمو AuNP هو بالتالي صغير في هذه العينة SixMDNA، مما تسبب في حل AuNP للتغيير من الوردي إلى قطيفة، التي لا تقاس الواضح مع بالعين المجردة. واستنادا إلى الصور الملونة، وكدنا]، TMDNA وSixMDNA هي متباينة تقريبا لتركيز الحمض النووي 0،11-0،50 ميكرومتر.

_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> مع البروتوكولات والأساليب المقدمة هنا، وقد تجلى منصة التلاعب القائم على قطرات بسيطة ومبتكرة لعلى microfluidics سطح مفتوح عن طريق شفط هوائي كقوة لتوليد. لا يمكن أن يتحقق تشوه سطح غشاء PDMS، ونقل سطحي والتلاعب من قطرات دون انقطاع إلى عينة الحيوية، الحمض النووي في هذه الحالة، في قطرات (انظر الشكل 7A). وتتجلى الكشف الجديد والبصرية من حركة الأشخاص الطبيعيين على هذا الهوائية سطح منصة مفتوحة قطرة التلاعب. ونتيجة لذلك كما هو مبين في الشكل 7B، والكشف عن عدم تطابق الحمض النووي يمكن ملاحظتها بسهولة بالعين المجردة. وفي الحالة الأصلية، والتحقيق قطرة AuNP أظهرت اللون الأحمر، وأقصى قدر من الاستيعاب البصري يحدث تحقيقات AuNP في 520 نانومتر، وهو ما يرجع إلى صدى سطح مأكل (SPR)، وبعد التهجين مع مختلف قطرات عينة من الحمض النووي، والهدف مسبار دوبلكس الحمض النووي من AuNP مع كامل ج أصبحت omplementary الحمض النووي (كدنا]) عينة قطرة شفافة كما اختفت ميزة البرنامج الخاصة لزيادة AuNP. في المقابل، تهجين AuNP مع ثلاثة قاعدة الزوج الحمض النووي متطابقة (TMDNA) وستة قاعدة الزوج كان الحمض النووي متطابقة (SixMDNA) الأزرق والأرجواني على التوالي. مع هذا النهج، ومنصة المقترحة وطريقة الكشف عن الحمض النووي يتم الجمع بين وتحقيقه بطريقة بسيطة.

شكل 1
الشكل 1. مبدأ الكشف اللونية من حركة الأشخاص الطبيعيين، واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي المعدلة ثيول (ssDNA) أو المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي (dsDNA) من التهجين من ssDNA المعدلة ثيول على AuNP أثرت على حجم النمو وشكل AuNP، وتسبب الخصائص البصرية المتنوعة من AuNP. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

"FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل 2
الشكل 2. رسم تخطيطي للالهوائية منصة قطرة التلاعب. مع شفط هوائي كقوة تتسبب في انحراف الغشاء superhydrophobic أساس PDMS مرنة، الحبرية على الغشاء يصبح بالتالي تنشيط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تصنيع منصة قطرة التلاعب الهوائية. وتضمن تصنيع الكمبيوتر العددية للسيطرة على (CNC) متناهي الصغر، الصب أو تكرار تقنيات PDMS، ومتناهي الصغر ليزر. الرجاء انقر هنا لعرض تأنسخة إيه من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. الإعداد التجريبية من منصة الهوائية قطرة التلاعب. لدت مضخة فراغ لشفط الهواء لتوفير ضغط تقلص في غرفة الهواء وتتسبب في انحراف الغشاء PDMS للتلاعب قطرة. مضخة فراغ ومدخل القناة الهواء ترتبط من خلال صمام الملف اللولبي. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
يتم تحميل الرقم 5. توضيح تخطيطي لتشغيل هذه التقنية كشف حركة الأشخاص الطبيعيين، وقطرات تحتوي على الحمض النووي الهدف وتحقيقات AuNP على المنصة، مختلطة وHYBridized. يتم تحميل قطرة تحتوي على كل NH 2 OH وHAuCl 4 على منصة ومختلطة للنمو AuNP. وأخيرا، وعلى الوجهين DNA الهدف مسبار من AuNP تحول أقصى امتصاص وتغيير اللون. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6. التغيير من لون مختلف عينات من الحمض النووي مع التركيز على سبيل الحمض النووي مكملة بالكامل (كدنا])، والأشكال من الحلول تختلف من الوردي إلى النيلي مع زيادة تركيز الحمض النووي. لTMDNA، لون حلول يذهب من الوردي إلى البنفسجي الغامق، ولSixMDNA، لون غني من الوردي إلى الوردي الداكن مع زيادة تركيز الحمض النووي. الرجاء انقر هنا لعرض لارنسخة الالماني من هذا الرقم.

الرقم 7
الشكل 7. صور قطرات على هوائي منصة. أ) صور المسلسل النقل قطرة على منصة الهوائية مع سيطرة شفط الهواء. ب) صور من المقابلة الهدف مسبار دوبلكس الحمض النووي من AuNP على الحبرية الهوائية منصة التلاعب المقترحة. كانت ظروف التشغيل للتردد القيادة وضغط العمل 5 هرتز و-80 كيلو باسكال (قياس الضغط)، على التوالي. في الحالة الأصلية، والتحقيق قطرة AuNP المعارض اللون الأحمر. كان دوبلكس DNA الهدف مسبار من AuNP في وجود كدنا] شفافة. وكانت تحقيقات AuNP تهجين مع TMDNA وSixMDNA الأزرق والأرجواني على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. </ أ>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول، وهي طريقة اللونية بسيط للكشف عن حركة الأشخاص الطبيعيين يمكن تنفيذها بتركيزات تتراوح بين 0،11-0،50 ميكرومتر في أنابيب microcentrifuge. وعلاوة على ذلك، يجري الطريقة المقترحة كشف حركة الأشخاص الطبيعيين على منصة التلاعب قطرات الهوائية التي لديها امكانات عالية لفحص الحمض النووي وغيرها من التطبيقات الطبية الحيوية. في الممارسة العملية، ومدى كشفها للتركيز عينة من الحمض النووي يعتمد على كفاءة اختلاط منصات التشغيل. للتأكد من أن قطرات ملتئم مختلطة تماما، وخطوة حاسمة في هذا البروتوكول هو السيطرة على شفط الهواء (الضغط والتردد) التي تعتمد على حجم قطرات ملتئم. التناقض من تقارب التهجين بين الحمض النووي عينة مكملة تماما وعينة من الحمض النووي متطابقة من الصعب التمييز بالعين المجردة لالحمض النووي طويل تسلسل شظية. الحد من هذه التقنية الكشف بالتالي طول جزء من الحمض النووي عينة. للعينات مع DN طويلوتسلسل، والأحجام أو التشكل من AuNP نمو مماثلة لتلك التي من عينات من الحمض النووي متنوعة تحتوي على عدم التطابق المختلفة. تظهر عدم تطابق عينات من الحمض النووي لجنة التحقيق في الجزء الأوسط في هذا البروتوكول. مع أطوال متطابقة وعدم التطابق homomeric من الحمض النووي عينة، يمكن أن موقف عدم التطابق تؤثر أيضا على حجم تقارب التهجين ونمو AuNP. ويجري حاليا تتبع كثير من الأمراض لبعينها الجينات المعيبة. قواعد بيانات الجينوم لأمراض معينة لا تزال تتوسع وتتحسن. مرة واحدة يتم تأكيد الاختلاف تسلسل الحمض النووي للجزء الحمض النووي محددة لتكون مسؤولة عن مرض معين، التحقيق مصممة خصيصا (مع طول مناسب وموقف عدم تطابق الحمض النووي) يمكن استخدامها للحصول على عدد من عدم تطابق عينة من الحمض النووي ل التحقيق في نطاق تركيز اكتشافها على أساس اختبار بالفعل في هذا العمل.

الحبرية الهوائية منصة التلاعب المقترحة أداءإد في بيئة مفتوحة. تبخر قطرات يزيد من تركيز عينات من الحمض النووي ويؤثر على دقة قراءات اللونية. لتحسين دقة تحليل حركة الأشخاص الطبيعيين، ويتطلب التحكم في درجة الحرارة والرطوبة البيئية. تم تطبيق الليزر متناهي الصغر إلى افتعال سطح superhydrophobic في منصة عرض. وsuperhydrophobicity الغشاء PDMS لا تزال قائمة في ظل الكثير من التكرار التلاعب قطرة (> 20 مرات). فقدان superhydrophobicity يقلل من الحركة والمناورة من هذا المنبر قطرة التلاعب. مرة واحدة يفقد منصة قطرة تلاعب superhydrophobicity على السطح، remodifying وsuperhydrophobicity الغشاء PDMS (كرر الخطوات 2،6-2،8) هو مطلوب. تصنيع بسيط من سطح superhydrophobic أكثر دواما هو قيد النظر في المستقبل. في هذا البروتوكول، ونحن استخدام صمام الملف اللولبي، وبرنامج السيطرة بسيط (مع المعدات الحصول على البيانات) للتحكم عشرالبريد شفط الهواء. ويمكن استخدام السيطرة على شفط الهواء بطرق أخرى أو مع المعدات بما في ذلك ولكن لا تقتصر على استخدام صمام الملف اللولبي.

في هذه المخطوطة، قدمنا ​​مجموعة من طريقة اللونية بسيط للكشف عن الحمض النووي والهوائية منصة قطرة التلاعب. كلتا الطريقتين هي فريدة من نوعها والمستقبلية للغاية. لم نعثر على أي طريقة اكتشاف الحمض النووي البديل (آن معا السريع والبصرية) لتحقيق نفس النتائج. عدة تقنيات التلاعب قطرات على سطح مفتوح بما في ذلك optowetting، 22 dielectrophoresis، 23 electrowetting، 24 الاهتزاز 25 وتم الإبلاغ الترمس-الشعرية يشتغل 26. وتمت مناقشة عيوب كل هذه التقنيات التلاعب قطرة في عملنا السابق 20 منصة الهوائية المقترحة هي أكثر حيويا من الطرق المذكورة أعلاه.

هذه التقنية للكشف عن الأشكال المتعددة النوكليوتيدات سنا منصة هوائي قطرة تلاعب واضح ومباشر للباحثين في مجال الكيمياء الحيوية، وهو ما يعني أن العينات والكواشف يمكن تحميل مباشر وجمع مع ماصات. ويجري دمج منصة عرض مع نظام التحكم الآلي وتصميم واجهة مستخدم محسنة واسعة استخدامها في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Dow Corning SYLGARD 184
benchtop engravers Roland DG EGX-400
laser cutting machine Universal Laser Systems, Inc. VLS 3.50
Oxygen plasma treatment system Femto Science Inc. Korea CUTE-MPR
solenoid valve home built
vacuum pump ULVAC KIKO, Inc. DA-30D
13-nm AuNP solution TAN Bead Inc., Taiwan NG-13
DNA (with 5'-end labeled thiol) MDBio, Inc., Taiwan
phosphate buffered saline (PBS) UniRegion Bio-Tech,. Taiwan PBS001-1L
sodium dodecyl sulfate (SDS) J. T. baker 4095-04
Hydroxylamine solution (NH2OH) Sigma-Aldrich 467804
Chloroauric acid (HAuCl4) Sigma-Aldrich G4022
sodium chloride (NaCl)
vortex mixer Digisystem Laboratory Instruments Inc. VM-2000
centrifuge Hermle Labortechnik GmbH. Z 216 MK

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chorley, B. N., et al. Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies. Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).
  2. Hinds, D. A., et al. Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations. Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).
  3. Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. , 408 (2010).
  4. Whelan, S., Goldman, N. Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes. Genetics. 167 (4), 2027-2043 (2004).
  5. Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).
  6. Kim, S., Misra, A. SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).
  7. Kwok, P. Y., Chen, X. Detection of single nucleotide polymorphisms. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60 (2003).
  8. Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).
  9. Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles. Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).
  10. Storhoff, J. J., et al. Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system. Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).
  11. Bao, Y. P., et al. SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes. Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).
  12. Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases. Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).
  13. Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).
  14. Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes. Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).
  15. Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers. Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).
  16. Chen, L., Manz, A., Day, P. J. Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices. Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).
  17. Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform. Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).
  18. Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads. Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).
  19. Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics. Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).
  20. Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism. Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).
  21. Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).
  22. Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface. Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).
  23. Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation. J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).
  24. Lee, J., Kim, C. J. C. Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting. J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).
  25. Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes. Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).
  26. Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. Microfluidic actuation by modulation of surface stresses. Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).

Tags

علم الوراثة، العدد 115، متعددة النوكليوتيدات تعدد الأشكال (حركة الأشخاص الطبيعيين)، جسيمات متناهية الصغر الذهب (AuNP)، وكشف اللونية، والتلاعب قطرة، منصة الهوائية، وأنظمة الموائع الدقيقة أرض مفتوحة، الهندسة الحيوية
كشف اللونية البصرية من متعدد النوكليوتيدات تعدد الأشكال على منصة التلاعب هوائي القطرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yeh, S. I., Fang, W. F., Huang, C.… More

Yeh, S. I., Fang, W. F., Huang, C. J., Wang, T. M., Yang, J. T. The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform. J. Vis. Exp. (115), e54424, doi:10.3791/54424 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter