Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

एक साँस बूंद हेरफेर मंच पर मल्टी nucleotide बहुरूपताओं के दृश्य वर्णमिति जांच

Published: September 27, 2016 doi: 10.3791/54424
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Mechanical Engineering, National Taiwan University

Summary

यह काम एक साँस छोटी बूंद हेरफेर मंच पर बहु ​​nucleotide बहुरूपताओं पता लगाने के लिए एक सरल और दृश्य विधि प्रस्तुत करता है। प्रस्तावित विधि, पूरे प्रयोग, छोटी बूंद हेरफेर और बहु ​​nucleotide बहुरूपताओं का पता लगाने सहित के साथ, उन्नत उपकरणों की सहायता के बिना 23 डिग्री सेल्सियस के पास प्रदर्शन किया जा सकता है।

Abstract

बहु न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एमएनपी) का पता लगाने के लिए एक सरल और दृश्य विधि एक खुली सतह पर एक साँस छोटी बूंद हेरफेर मंच पर प्रदर्शन किया गया था। वर्णमिति डीएनए का पता लगाने के लिए यह दृष्टिकोण सोने nanoparticle जांच (AuNP जांच) के संकरण की मध्यस्थता विकास पर आधारित था। विकास आकार और AuNP के विन्यास जांच के साथ संकरित डीएनए नमूनों की संख्या का प्रभुत्व है। नैनोकणों के विशिष्ट आकार- और आकार पर निर्भर ऑप्टिकल गुणों के आधार पर, जांच के लिए एक नमूना डीएनए टुकड़ा में बेमेल की संख्या भेदभाव किया जा करने में सक्षम है। परीक्षण क्रमश अभिकर्मकों और डीएनए नमूने युक्त बूंदों के माध्यम से आयोजित किया गया था, और ले जाया गया और लचीला PDMS आधारित superhydrophobic झिल्ली की नियंत्रित वायवीय सक्शन साथ वायवीय मंच पर मिलाया। बूंदों कि कोई साइड eff के साथ अत्यधिक biocompatible है प्रस्तावित वायवीय मंच पर एक खुली सतह पर एक साथ और ठीक दिया जा सकता हैबूंदों के अंदर डीएनए नमूनों की ect। दो प्रस्तावित तरीकों के संयोजन, बहु न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता वायवीय छोटी बूंद हेरफेर मंच पर नजर में पता लगाया जा सकता है; कोई अतिरिक्त साधन की आवश्यकता है। अंतिम परिणाम के लिए मंच पर स्थापित करने से बूंदों प्रक्रिया कम से कम 5 मिनट, मौजूदा तरीकों के साथ तुलना में काफी कम समय लगता है। इसके अलावा, इस संयुक्त एमएनपी पता लगाने के दृष्टिकोण प्रत्येक आपरेशन, जो एक मैक्रो प्रणाली की तुलना में उल्लेखनीय कम है में केवल 10 μl का एक नमूना मात्रा की आवश्यकता है।

Introduction

एकल nucleotide बहुरूपता (एसएनपी) है, जो एक डीएनए अनुक्रम में एक एकल आधार जोड़ी अंतर है, सबसे आम आनुवंशिक रूपों में से एक है। वर्तमान अध्ययन की रिपोर्ट है कि SNPs रोग के जोखिम, दवा प्रभावकारिता और जीन समारोह को प्रभावित करने से व्यक्तियों के साइड इफेक्ट के साथ जुड़े रहे हैं। 1,2 हाल के अध्ययनों से यह भी पता चला है कि दो या बहु बिंदु उत्परिवर्तन (बहु न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता) विशेष रूप से रोगों और व्यक्ति का कारण 3,4 न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता का पता लगाने के रोग के प्रभाव में मतभेद। इसलिए रोग prescreening में जरूरी है। अनुक्रम विशिष्ट ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स का तेजी से पता लगाने के लिए सरल और कुशल तरीके अत्यधिक पिछले दो दशकों में विकसित किया गया। डीएनए उत्परिवर्तन जांच स्थिरीकरण, प्रतिदीप्ति लेबलिंग, जेल वैद्युतकणसंचलन, आदि सहित प्रक्रियाओं की पहचान आम तौर पर शामिल करने के लिए 1,5 वर्तमान दृष्टिकोण, 6,7 लेकिन उन तरीकों को आम तौर पर एक लंबी प्रक्रिया विश्लेषणात्मक, expen की आवश्यकता होती हैनिर्णायक उपकरण, अच्छी तरह से प्रशिक्षित तकनीशियन, और नमूने और अभिकर्मकों के महत्वपूर्ण खपत।

मात्रा और अद्वितीय भौतिक गुणों के लिए सतह क्षेत्र का एक बड़ा अनुपात के साथ एक nanoparticle विशिष्ट बायोमार्कर के लिए एक बेहद संवेदनशील और सस्ते का पता लगाने के मंच के रूप में एक आदर्श सामग्री है। सोने के नैनोकणों (AuNP) व्यापक रूप से, क्योंकि उनके महान क्षमता के डीएनए का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है oligonucleotide जांच के साथ संशोधित किया जाना है। 8-10 एसएनपी पता लगाने की तकनीक भी AuNP का उपयोग कर विकसित किया गया। 11-13 इस काम में हम पता लगाने के लिए एक उपन्यास वर्णमिति दृष्टिकोण अपनाया बहु न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एमएनपी) के माध्यम से AuNP जांच के लिए डीएनए संकरण की मध्यस्थता वृद्धि हुई है। 14 यह सरल और तेजी से जांच कर रही विधि के सिद्धांत पर आधारित है कि एकल असहाय डीएनए (ssDNA) या डबल असहाय डीएनए (dsDNA) संयुग्मित के विभिन्न लंबाई AuNP विकास आकार और AuNP के आकार को प्रभावित करती है (चित्रा 1 देखें)। 15 डीएनए का पता लगाने का यह तरीकाअभिकर्मकों का एक छोटा सा की खपत, एक छोटे से परख अवधि (कुछ ही मिनट), और थर्मल नियंत्रण के बिना एक साधारण प्रक्रिया है कि नैदानिक ​​निदान और घरेलू चिकित्सा जांच के लिए भावी लागू है सुविधाएँ।

डीएनए अनुक्रम का पता लगाने के लिए कई microfluidic सिस्टम विकसित किया गया है, 16 उन microfluidic प्रणाली, पारंपरिक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल से विकसित किया है, बड़े पैमाने पर उपकरणों की कम टुकड़े की आवश्यकता है और सरलीकृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के रूप में तो डीएनए की संवेदनशीलता, सीमा का पता लगाने और विशिष्टता सुधार करने के लिए biosensor। Microfluidic प्रणालियों में डीएनए का पता लगाने के तरीकों अभी भी एक एकल readout विषम एसएनपी की पहचान करने के लिए आवश्यकता होती है, हालांकि, संकेत प्रवर्धन और एक प्रतिदीप्ति पाठक के लिए इस तरह के एक पीसीआर (पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन) के रूप में बाद में एक प्रक्रिया के उपकरणों मशीन। 17,18 एक सरल का विकास बाद के प्रसंस्करण के बिना मंच सीधे बहु न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता के परिणामों को बाहर पढ़ने के लिएअति आवश्यक है। की तुलना में अच्छी तरह से इस्तेमाल करने के लिए, पारंपरिक, microfluidic प्रणालियों को बंद कर दिया, खुले सतह microfluidic उपकरणों आशाप्रद इस तरह के एक स्पष्ट ऑप्टिकल पथ, नमूना का उपयोग करने के लिए एक आसान तरीका है, एक प्रत्यक्ष पर्यावरण पहुंच और कोई आसानी से गठित cavitation या इंटरफेसियल बाधा के रूप में कई लाभ प्रदान करते हैं चैनल। 19 हमारे पिछले काम खुले सतह छोटी बूंद हेरफेर (चित्रा 2 देखें)। 20 के लिए एक सरल साँस मंच की शुरुआत की इस मंच, बूंदों को एक साथ ले जाया जा सकता है और एक चूषण बल का उपयोग कर एक ड्राइविंग ऊर्जा से हस्तक्षेप के बिना चालाकी पर है, जो एक है जैविक और रासायनिक अनुप्रयोगों में काफी संभावना। इस वायवीय मंच इस प्रकार AuNP जांच के लिए डीएनए संकरण की मध्यस्थता विकास की अवधारणा का उपयोग वर्णमिति दृष्टिकोण के साथ संयोजन में एमएनपी का पता लगाने के लिए डीएनए नमूनों के हेरफेर पर अमल करने के लिए उपयोग किया गया था।

इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का वर्णनएक साधारण दृश्य एक खुले सतह पर वायवीय छोटी बूंद हेरफेर मंच पर बहु ​​nucleotide बहुरूपताओं का पता लगाने। इस काम की पुष्टि करता है कि बहु न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता नग्न आंखों से detectable है; प्रस्तावित वायवीय मंच जैविक और रासायनिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. एमएनपी का पता लगाने के लिए विधि

नोट: इस खंड में सोने के नैनोकणों के संकरण की मध्यस्थता विकास के आधार पर एमएनपी पता लगाने के लिए प्रक्रिया का वर्णन है।

  1. जांच डीएनए (5'-thiol-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 ') एक एकाग्रता 100 सुक्ष्ममापी पर समाधान तैयार है।
  2. जांच डीएनए संशोधित AuNP (AuNP जांच) के कणों को तैयार है। 21
    नोट: यहां इस्तेमाल मात्रा जांच डीएनए संशोधित AuNP (AuNP जांच) कणों की आवश्यकता पर निर्भर करता है। यह इसलिए निर्भर पर प्रयोगों की संख्या का आयोजन किया जा रहा है। आम तौर पर हम पुर्जों के रूप में अतिरिक्त AuNP जांच कणों तैयार करते हैं। इन चरणों में इस्तेमाल मात्रा समायोज्य और लचीला है।
    1. एकाग्रता 1 आयुध डिपो / मिलीलीटर में सोने के नैनोकणों का एक समाधान (13 एनएम, 17 एनएम) से (100 सुक्ष्ममापी, 1.1 चरण में तैयार) जांच के लिए डीएनए जोड़ें।
    2. सोडियम सल्फेट dodecyl के अंतिम सांद्रता लाओ (एनएसी 12 h 25 अतः 4, एसडीएस) और फॉस्फेट बफर (पीबीएस) 0.01% और 0.01 एम, respectivel करने के लिएवाई।
    3. 20 मिनट के बाद, सोडियम क्लोराइड (2 एम) और पीबीएस (0.01 एम), जबकि 0.01% पर एसडीएस बनाए रखने का एक समाधान के साथ 0.05 एम सोडियम क्लोराइड (NaCl) की एकाग्रता लाने के लिए और 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. 1 एम 20 से अधिक मिनट के अंतराल के अंतिम एकाग्रता के लिए 0.1 एम की वेतन वृद्धि में सोडियम क्लोराइड एकाग्रता में वृद्धि।
    5. 23 डिग्री सेल्सियस पर एक भंवर मिक्सर पर झटकों के साथ रातोंरात सेते हैं। झटकों की गति के रूप में लंबे समय के डीएनए नमूने और AuNP जांच संकरित बन के रूप में प्रयोग प्रभावित नहीं करता।
    6. 30 सेकंड के लिए 7000 XG पर सोने के नैनोकणों अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  3. 25 एनएम (AuNP जांच समाधान) की एकाग्रता में विआयनीकृत पानी (डि पानी) में AuNP जांच कणों जोड़ें।
  4. लक्ष्य डीएनए नमूने तैयार (: '; तीन आधार-जोड़ी बेमेल: 5'-CTTGCCTAC TTT ACCAGCTC -3', 5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC -3 पूरी तरह से पूरक छह आधार जोड़ी बेमेल: 5'-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC -3 ') सांद्रता में0.06 से 0.11, 0.17, 0.20, 0.30, 0.50 सुक्ष्ममापी, क्रमशः।
  5. AuNP जांच समाधान (6 μl, 25 एनएम) सोडियम क्लोराइड (14 माइक्रोन) के साथ डीएनए नमूने (350 μl) में जोड़ें।
  6. डीएनए संकरण के लिए 5 मिनट के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर एक भंवर मिक्सर के साथ डीएनए नमूने और AuNP जांच के मिश्रण हिला।
  7. AuNP विकास के लिए, समाधान (डीएनए नमूने और AuNP जांच का मिश्रण) को राष्ट्रीय राजमार्ग 2 भला (6 μl 400 मिमी) और HAuCl 4 (6 μl, 25.4 मिमी) जोड़ें। AuNP के विकास को पूरा करने के लिए लगभग 30 सेकंड लेता है। रंगाई की लगातार परिवर्तन को अधिक से अधिक 1 मानव संसाधन बनाए रखता है।
    चेतावनी: 4 HAuCl साथ त्वचा से संपर्क गंभीर विषाक्त प्रभाव का उत्पादन हो सकता है। उपयोग करने से पहले सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) से परामर्श करें। कृपया दस्ताने पहनते हैं और जब HAuCl 4 का उपयोग कर एक धूआं अलमारी का उपयोग करें।

2. एक साँस बूंद हेरफेर प्लेटफार्म का निर्माण

नोट: एक पी: PDMS आधारित छोटी बूंद हेरफेर मंच के दो घटक शामिलडीएमएस झिल्ली (100 माइक्रोन) एक सुपर हाइड्रोफोबिक सतह और एक एयर चैनल परत (5 मिमी) के साथ। एक एमईएमएस प्रक्रिया के बिना, आम मशीनिंग प्रक्रियाओं के निर्माण के लिए इस डिवाइस है, जो एक मिट्टी, PDMS कास्टिंग और microfluidic घटकों के तेजी से प्रोटोटाइप के लिए प्रतिकृति बनाने के लिए कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण (सीएनसी) micromachining भी शामिल है, और लेजर micromachining निर्माण करने के लिए उपयोग किया गया एक सुपर हाइड्रोफोबिक सतह (चित्रा 3 देखें)।

  1. सीएनसी मशीन एक ड्रिल बिट (0.5 मिमी) से लैस प्रयोग PMMA आधारित मास्टर नए नए साँचे (चित्रा 3 देखें) microstructures के साथ उत्पादन करने के लिए। ड्रिल बिट 7 मिमी / सेकंड की एक फ़ीड गति और रोटेशन 26,000 आरपीएम की दर से प्रयोग करें। एक हवा बनाने वाला और डि पानी का प्रयोग करें PMMA स्क्रैप को दूर करने और मास्टर नए नए साँचे की सतह को साफ करने के लिए।
  2. PDMS आधार और अनुपात 10 में इलाज एजेंट का एक मिश्रण तैयार: 1। एक desiccator अंदर मिश्रण 30 मिनट के लिए, या जब तक सभी हवाई बुलबुले को हटा रहे हैं देगास।
  3. वें में PDMS डालोई मास्टर मोल्ड और हवा कक्षों का उलटा microstructures (PDMS झिल्ली) और एयर चैनल (PDMS परत) प्राप्त करने के लिए ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए PDMS सेंकना।
  4. मास्टर मोल्ड (हाथ से) से PDMS परत निकालें। एयर सक्शन inlets के लिए PDMS परत पर छेद पंच।
  5. ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार प्रणाली के कक्ष में PDMS झिल्ली, PDMS परत और कांच सब्सट्रेट रखो। ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार के बाद, 10 मिनट के लिए एक hotplate (90 डिग्री सेल्सियस) पर एक साथ PDMS झिल्ली, PDMS परत और कांच सब्सट्रेट बांड।
  6. लेजर काटने की मशीन (PDMS झिल्ली ऊपर की ओर) में मिश्रित चिप डाल। .dwg फ़ाइल आयात superhydrophobic क्षेत्र (15 मिमी × 12 मिमी) को परिभाषित करने के लिए। चित्रा 3 देखें। सीधे PDMS झिल्ली (बिजली 12 डब्ल्यू, स्कैनिंग वेग 106.68 मिमी / सेकंड) पर superhydrophobic क्षेत्र बनाने के लिए एक सीओ 2 -laser मशीन के साथ PDMS झिल्ली खोदना।
  7. डि पानी के साथ superhydrophobic सतह को साफ धोने के लिएदूर सतह पर कार्बनीकृत अवशेषों।
  8. एक solenoid वाल्व के माध्यम से एयर सक्शन इनलेट और वैक्यूम पंप से कनेक्ट (चित्रा 4 देखें)। एक डिजिटल मैं / हे यूएसबी मॉड्यूल के साथ कंप्यूटर और नियंत्रण करने के लिए solenoid वाल्व कनेक्ट करें।

3. वायवीय प्लेटफार्म पर एमएनपी की जांच के लिए ऑपरेशन

नोट: इस खंड में साँस छोटी बूंद हेरफेर मंच पर colorimetrically और तेजी से एमएनपी की पहचान करने के संचालन का वर्णन (चित्रा 5 देखें)। सभी चरणों का 23 डिग्री सेल्सियस (परिवेश के तापमान) में जगह और सापेक्ष आर्द्रता 85% ले।

  1. लक्ष्य डीएनए नमूना छोटी बूंद साँस छोटी बूंद हेरफेर मंच के superhydrophobic क्षेत्र पर जगह (10 μl, 0.5 माइक्रोन) के।
  2. AuNP जांच छोटी बूंद (10 μl, 25 एनएम) वायवीय छोटी बूंद हेरफेर मंच के superhydrophobic क्षेत्र पर रखें।
  3. हवा सक्शन नियंत्रण एक solenoid वाल्व और एक सी के साथ PDMS झिल्ली के नीचे को झुकाव पैदा करने के लिएmple कार्यक्रम (जैसे, Labview)। PDMS झिल्ली कि इस तरह की बूंदों एक दूसरे के साथ टकराने और संगठित होना पर बूंदों (क्रमशः लक्ष्य डीएनए और AuNP जांच युक्त) के प्रवास के मार्ग के किनारे प्रत्येक हवा चैम्बर में हवा सक्शन प्रदान करें। -80 किलो पास्कल (गेज दबाव) का वैक्यूम पंप के एक काम के दबाव का प्रयोग करें।
    1. वैकल्पिक रूप से, स्वयं के रूप में लंबे समय तक छोटी बूंद पूरी तरह मिलाया जाता है के रूप में हवा सक्शन नियंत्रित करते हैं। हाथ रखकर कनेक्ट या वैक्यूम पंप और परीक्षण के प्रारंभिक दौर में ट्यूबों के साथ हवा चैम्बर के inlets काट।
  4. हवा सक्शन पर नियंत्रण रखें एकत्रित छोटी बूंद आगे और पिछड़े रोल करने के लिए solenoid वाल्व के नियंत्रण प्रणाली का उपयोग करते हुए 3 मिनट के लिए मिश्रण दक्षता बढ़ाने के लिए। लक्ष्य डीएनए और AuNP जांच अच्छी तरह से मिला और 3 मिनट के भीतर संकरित हो जाते हैं। एक ड्राइविंग आवृत्ति और 5 हर्ट्ज और -80 किलो पास्कल (गेज दबाव) के एक काम के दबाव में क्रमश: का प्रयोग करें।
  5. एक छोटी बूंद युक्त राष्ट्रीय राजमार्ग 2 भला (2 μl 400 मिमी) और HAuCl रखें4 (2 μl, 25.4 मिमी) वायवीय छोटी बूंद हेरफेर मंच के superhydrophobic क्षेत्र पर।
  6. हवा सक्शन (-80 किलो पास्कल गेज दबाव) बूंदों एक दूसरे को और सम्मिलित के साथ टकराने जाने के लिए नियंत्रण। फिर हवा सक्शन (5 हर्ट्ज और -80 किलो पास्कल गेज दबाव) को नियंत्रित आगे और पीछे एकत्रित छोटी बूंद रोल 1 मिनट के लिए मिश्रण दक्षता बढ़ाने के लिए जाने के लिए।
  7. उपाय और नग्न आंखों के साथ एकत्रित छोटी बूंद के रंग रिकॉर्ड है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस काम में, तीन डीएनए के नमूने जांच के AuNP डीएनए संकरण की मध्यस्थता के माध्यम से विकास का पता लगाने के लिए एक सरल और उपन्यास विधि का उपयोग कर परीक्षण किया गया। जांच के डीएनए और तीन प्रकार के डीएनए के नमूने के दृश्यों, विशेष रूप से, सीडीएनए (डीएनए जांच पूरी तरह से पूरक करने के लिए), TMDNA (तीन आधार-जोड़ी बेमेल डीएनए), और SixMDNA (छह आधार जोड़ी बेमेल डीएनए) प्रोटोकॉल चरण 1 में सूचीबद्ध हैं। यहाँ परीक्षण डीएनए नमूनों की जांच करने के लिए बेमेल डीएनए नमूनों के बीच खंडों में दोनों हैं। चित्रा 6 विविध एकाग्रता में डीएनए के नमूने लिए विकास AuNP समाधान के रंग दिखाता है। पूरी तरह से मिलान डीएनए (सीडीएनए) के लिए, समाधान का रंग डीएनए एकाग्रता बढ़ाने के साथ पारदर्शी करने के लिए इंडिगो को गुलाबी से भिन्न है और उसके बाद। TMDNA के लिए, समाधान के रंग गहरे बैंगनी गुलाबी से चला जाता है और उसके बाद इंडिगो, और SixMDNA के लिए, रंग डीएनए एकाग्रता में वृद्धि के साथ गहरे गुलाबी रंग गुलाबी से चला जाता है। अलग डी एनए के नमूने जांच के लिए डीएनए कि और AuNP के विभिन्न आकार और विकास के समाधान के विविध रंग की वजह से करने के लिए विविध संकरण समानताएं के पास है। TMDNA नमूना जांच से तीन आधार-जोड़ी उत्परिवर्तन के साथ, सीडीएनए नमूना है, जो AuNP के एक छोटे आकार की वजह से विकास दर की तुलना में कम संकरण संबंध है। चित्रा 6 शो में परिणाम के रूप में, वहाँ सीडीएनए और TMDNA नमूनों के बीच रंग का भेद, विशेष रूप से एक बड़े डीएनए एकाग्रता पर हैं। जांच के साथ कई बेमेल के माध्यम से, SixMDNA नमूना भी 0.2 माइक्रोन से अधिक डीएनए एकाग्रता के साथ जांच, जो AuNP संयुग्मित कुछ dsDNA के परिणामस्वरूप एक कमजोर संकरण संबंध है। AuNP के विकास के आकार के इस SixMDNA नमूने में फलस्वरूप छोटा है, AuNP समाधान चौलाई, जो स्पष्ट रूप से एक नग्न आंखों से मापा नहीं है गुलाबी से बदलने के लिए हो सकता है। रंग छवियों, सीडीएनए के आधार पर, TMDNA और SixMDNA 0.50 माइक्रोन के लिए 0.11 से एक डीएनए एकाग्रता के लिए मोटे तौर पर अलग-अलग हैं।

_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> प्रोटोकॉल और तरीकों यहाँ प्रस्तुत के साथ, खुले सतह microfluidics के लिए एक सरल और उपन्यास छोटी बूंद-आधारित हेरफेर मंच प्रदर्शन किया गया एक शक्ति के रूप में वायवीय सक्शन का उपयोग उत्पन्न करने के लिए। PDMS झिल्ली, सतही परिवहन और बूंदों की गड़बड़ी की सतह विरूपण, बूंदों में (चित्रा 7A देखें) जैव नमूना, इस मामले में डीएनए के लिए बिना किसी रुकावट प्राप्त किया जा सकता है। एमएनपी के नए और दृश्य का पता लगाने और इस पर प्रदर्शन किया है वायवीय खुले सतह छोटी बूंद हेरफेर मंच। के रूप में चित्रा 7B में दिखाया गया है एक परिणाम के रूप में, एक डीएनए बेमेल का पता लगाने के नग्न आंखों से आसानी से दिखाई है। मूल राज्य में, AuNP जांच छोटी बूंद एक लाल रंग का प्रदर्शन किया। की अधिकतम ऑप्टिकल अवशोषण AuNP जांच होती है 520 एनएम, जो एक सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) को जिम्मेदार ठहराया है पर। विभिन्न डीएनए नमूने बूंदों, एक पूरी तरह से ग के साथ AuNP का लक्ष्य जांच डीएनए द्वैध के साथ संकरण के बाद के रूप में वृद्धि की AuNP एसपीआर सुविधा गायब हो गया omplementary डीएनए (सीडीएनए) नमूना छोटी बूंद पारदर्शी बन गया। इसके विपरीत, AuNP तीन आधार-जोड़ी बेमेल डीएनए (TMDNA) और छह आधार जोड़ी बेमेल डीएनए (SixMDNA) क्रमश: नीले और बैंगनी रंग के थे के साथ संकरित। इस दृष्टिकोण के साथ, प्रस्तावित मंच और डीएनए का पता लगाने की विधि संयुक्त और एक सरल तरीके से हासिल कर रहे हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. AuNP पर thiol संशोधित ssDNA के संकरण से एमएनपी। Thiol संशोधित एकल असहाय डीएनए (ssDNA) या डबल असहाय डीएनए (dsDNA) के वर्णमिति पता लगाने के सिद्धांत के विकास के आकार और AuNP के आकार को प्रभावित किया, और AuNP की विभिन्न ऑप्टिकल गुण के कारण होता है। यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

"Fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्र 2
चित्रा 2. वायवीय छोटी बूंद हेरफेर मंच के योजनाबद्ध आरेख। एक ताकत के रूप में एक साँस सक्शन साथ लचीला PDMS आधारित superhydrophobic झिल्ली का एक विक्षेपन पैदा करने के लिए, झिल्ली पर छोटी बूंद जिससे सक्रिय हो जाता है। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

चित्र तीन
चित्रा 3. एक साँस छोटी बूंद हेरफेर मंच का निर्माण। निर्माण शामिल कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण (सीएनसी) micromachining, PDMS कास्टिंग या प्रतिकृति तकनीक, और लेजर micromachining। एक larg देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की एर संस्करण।

चित्रा 4
चित्रा 4. वायवीय छोटी बूंद हेरफेर मंच की प्रायोगिक स्थापना। वैक्यूम पंप हवा कक्ष में एक कम दबाव प्रदान करने के लिए और छोटी बूंद हेरफेर के लिए PDMS झिल्ली के नीचे को झुकाव पैदा करने के लिए एक हवाई सक्शन उत्पन्न। वैक्यूम पंप और हवा चैनल solenoid वाल्व के माध्यम से जुड़े हुए हैं के इनलेट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. इस एमएनपी पहचान तकनीक के आपरेशन के योजनाबद्ध चित्रण। बूंदों लक्ष्य डीएनए युक्त और AuNP जांच मंच पर लोड कर रहे हैं, मिश्रित और hybridized। छोटी बूंद दोनों राष्ट्रीय राजमार्ग 2 भला और HAuCl 4 युक्त मंच पर भरी हुई है और AuNP विकास के लिए मिलाया जाता है। अंत में, AuNP का लक्ष्य जांच डीएनए द्वैध अवशोषण अधिकतम स्थानांतरित कर दिया और बदल रंग। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 एकाग्रता के साथ विभिन्न डीएनए नमूने के रंग का रूपांतर। पूरी तरह से पूरक डीएनए (सीडीएनए) के लिए, समाधान का रंग डीएनए एकाग्रता में वृद्धि के साथ इंडिगो से गुलाबी से बदलती हैं। TMDNA के लिए, समाधान के रंग गहरे बैंगनी गुलाबी से चला जाता है, और SixMDNA के लिए, रंग डीएनए एकाग्रता में वृद्धि के साथ गहरे गुलाबी रंग गुलाबी से चला जाता है। एक Lar देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की जीईआर संस्करण।

चित्रा 7
चित्रा साँस का मंच। ए पर छोटी बूंद के 7. छवियाँ) एयर सक्शन। बी द्वारा नियंत्रण) प्रस्तावित वायवीय छोटी बूंद हेरफेर मंच पर AuNP की इसी लक्ष्य जांच डीएनए डुप्लेक्स की छवियों के साथ वायवीय मंच पर छोटी बूंद परिवहन के सीरियल छवियों। ड्राइविंग आवृत्ति और काम के दबाव के परिचालन की स्थिति 5 हर्ट्ज और -80 किलो पास्कल (गेज दबाव), क्रमशः थे। मूल राज्य में, AuNP जांच छोटी बूंद एक लाल रंग को दर्शाती है। सीडीएनए की उपस्थिति में AuNP का लक्ष्य जांच डीएनए द्वैध पारदर्शी था। AuNP जांच TMDNA और SixMDNA साथ संकरित नीले और बैंगनी क्रमशः थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। </ A>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, एक सरल विधि वर्णमिति पता लगाने के लिए एमएनपी 0.11-0.50 सुक्ष्ममापी से microcentrifuge ट्यूब में लेकर सांद्रता में लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रस्तावित एमएनपी का पता लगाने विधि डीएनए जांच और अन्य जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए एक उच्च क्षमता है कि एक साँस छोटी बूंद हेरफेर मंच पर आयोजित किया जाता है। अभ्यास में, नमूना डीएनए एकाग्रता का पता लगाने योग्य सीमा ऑपरेटिंग प्लेटफार्मों का मिश्रण क्षमता पर निर्भर करता है। कि एकत्रित छोटी बूंद पूरी तरह मिलाया जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हवा सक्शन (दबाव और आवृत्ति) कि एकत्रित छोटी बूंद के आकार पर निर्भर करता है का नियंत्रण है। पूरी तरह से पूरक नमूना डीएनए और बेमेल नमूना डीएनए के बीच संकरण अपनत्व की विसंगति एक लंबे डीएनए अनुक्रम टुकड़ा के लिए नग्न आंखों के साथ भेद करना मुश्किल है। इस तकनीक का पता लगाने की सीमा इसलिए नमूना डीएनए का टुकड़ा लंबाई है। लंबे डी.एन. के साथ नमूने लिएएक दृश्यों, आकार या विकास AuNP की रचना विभिन्न बेमेल युक्त विविध डीएनए नमूनों में से उन लोगों के लिए समान हैं। जांच के लिए डीएनए नमूनों की बेमेल इस प्रोटोकॉल में मध्यम खंड में दिखाई देते हैं। समान लंबाई और नमूना डीएनए के homomeric बेमेल के साथ, बेमेल की स्थिति भी AuNP के संकरण समानता और विकास के आकार को प्रभावित कर सकता है। कई बीमारियों वर्तमान में विशेष रूप से दोषपूर्ण जीन का पता लगाया जा रहा है। विशेष बीमारियों के लिए जीनोम डेटाबेस अभी भी विस्तार और सुधार कर रहे हैं। एक बार विशिष्ट डीएनए टुकड़ा के डीएनए अनुक्रम भिन्नता एक विशेष बीमारी के लिए जिम्मेदार होने की पुष्टि की है, विशेष रूप से डिजाइन जांच (एक उचित लंबाई और डीएनए के बेमेल स्थिति के साथ) के लिए नमूना डीएनए के बेमेल की संख्या प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता आधार पर पहचाने जाने एकाग्रता सीमा के भीतर जांच पहले से ही इस काम में परीक्षण किया।

प्रस्तावित वायवीय छोटी बूंद हेरफेर मंच प्रदर्शनएक खुले वातावरण में एड। बूंदों के वाष्पीकरण डीएनए नमूनों की एकाग्रता बढ़ जाती है और वर्णमिति readout की सटीकता को प्रभावित करता है। एमएनपी विश्लेषण की सटीकता में सुधार करने के लिए, एक नियंत्रित पर्यावरण तापमान और आर्द्रता के लिए आवश्यक हैं। लेजर micromachining प्रस्तुत मंच में एक superhydrophobic सतह के निर्माण के लिए लागू किया गया था। PDMS झिल्ली के superhydrophobicity छोटी बूंद हेरफेर (> 20 बार) के कई पुनरावृत्तियों के तहत मौजूद नहीं होता। superhydrophobicity के नुकसान गतिशीलता और इस छोटी बूंद हेरफेर मंच की गतिशीलता कम हो जाती है। एक बार छोटी बूंद हेरफेर मंच सतह पर superhydrophobicity खो देता है, PDMS झिल्ली के superhydrophobicity remodifying (दोहराने कदम 2.6-2.8) की आवश्यकता है। एक अधिक टिकाऊ superhydrophobic सतह का सरल निर्माण भविष्य विचाराधीन है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक solenoid वाल्व और एक साधारण नियंत्रित कार्यक्रम (डाटा अधिग्रहण उपकरणों के साथ) का इस्तेमाल किया वें नियंत्रित करने के लिएई हवा सक्शन। हवा सक्शन के नियंत्रण अन्य तरीकों से या उपकरण सहित लेकिन एक solenoid वाल्व का उपयोग करने के लिए सीमित नहीं के साथ उपयोग किया जा सकता है।

इस पांडुलिपि में, हम डीएनए का पता लगाने के लिए एक सरल वर्णमिति विधि और एक साँस छोटी बूंद हेरफेर मंच के संयोजन में पेश किया। दोनों तकनीकों अद्वितीय और उच्च भावी कर रहे हैं; हम कोई विकल्प डीएनए का पता लगाने विधि पाया (कि दोनों तीव्र और दृश्य है) एक ही परिणाम प्राप्त करने के लिए। Optowetting, 22 dielectrophoresis, 23 electrowetting, 24 कंपन 25 और थर्मस केशिका प्रवर्तन 26 सूचित किया गया है सहित एक खुली सतह पर कई छोटी बूंद हेरफेर तकनीकों। इन सभी छोटी बूंद हेरफेर तकनीक की कमियों के हमारे पिछले काम में चर्चा की गई। 20 प्रस्तावित वायवीय मंच ऊपर उल्लिखित तरीकों की तुलना में अधिक biocompatible है।

इस तकनीक को बहु-nucleotide बहुरूपताओं पता लगाने के लिए ओna वायवीय छोटी बूंद हेरफेर मंच जैव रासायनिक क्षेत्र है, जिसका अर्थ है कि नमूने और अभिकर्मकों सीधे लोड किया जा सकता है और pipettes के साथ एकत्र में शोधकर्ताओं के लिए सीधा है। प्रस्तुत मंच के एकीकरण के एक स्वत: नियंत्रण प्रणाली और भविष्य में सुधार और व्यापक उपयोग के लिए एक यूजर इंटरफेस की एक डिजाइन के साथ किया जा रहा है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Dow Corning SYLGARD 184
benchtop engravers Roland DG EGX-400
laser cutting machine Universal Laser Systems, Inc. VLS 3.50
Oxygen plasma treatment system Femto Science Inc. Korea CUTE-MPR
solenoid valve home built
vacuum pump ULVAC KIKO, Inc. DA-30D
13-nm AuNP solution TAN Bead Inc., Taiwan NG-13
DNA (with 5'-end labeled thiol) MDBio, Inc., Taiwan
phosphate buffered saline (PBS) UniRegion Bio-Tech,. Taiwan PBS001-1L
sodium dodecyl sulfate (SDS) J. T. baker 4095-04
Hydroxylamine solution (NH2OH) Sigma-Aldrich 467804
Chloroauric acid (HAuCl4) Sigma-Aldrich G4022
sodium chloride (NaCl)
vortex mixer Digisystem Laboratory Instruments Inc. VM-2000
centrifuge Hermle Labortechnik GmbH. Z 216 MK

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chorley, B. N., et al. Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies. Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).
  2. Hinds, D. A., et al. Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations. Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).
  3. Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. , 408 (2010).
  4. Whelan, S., Goldman, N. Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes. Genetics. 167 (4), 2027-2043 (2004).
  5. Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).
  6. Kim, S., Misra, A. SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).
  7. Kwok, P. Y., Chen, X. Detection of single nucleotide polymorphisms. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60 (2003).
  8. Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).
  9. Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles. Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).
  10. Storhoff, J. J., et al. Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system. Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).
  11. Bao, Y. P., et al. SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes. Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).
  12. Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases. Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).
  13. Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).
  14. Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes. Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).
  15. Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers. Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).
  16. Chen, L., Manz, A., Day, P. J. Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices. Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).
  17. Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform. Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).
  18. Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads. Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).
  19. Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics. Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).
  20. Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism. Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).
  21. Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).
  22. Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface. Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).
  23. Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation. J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).
  24. Lee, J., Kim, C. J. C. Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting. J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).
  25. Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes. Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).
  26. Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. Microfluidic actuation by modulation of surface stresses. Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).

Tags

आनुवंशिकी अंक 115 बहु न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एमएनपी) सोने nanoparticle (AuNP) वर्णमिति का पता लगाने छोटी बूंद हेरफेर साँस का मंच खुले सतह microfluidic प्रणाली जैव अभियांत्रिकी
एक साँस बूंद हेरफेर मंच पर मल्टी nucleotide बहुरूपताओं के दृश्य वर्णमिति जांच
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yeh, S. I., Fang, W. F., Huang, C.… More

Yeh, S. I., Fang, W. F., Huang, C. J., Wang, T. M., Yang, J. T. The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform. J. Vis. Exp. (115), e54424, doi:10.3791/54424 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter