Summary
Bu eser bir pnömatik damlacık manipülasyon platformunda çoklu nükleotid polimorfizmi tespit etmek için basit ve görsel bir yöntem sunar. Damlacık manipülasyon ve çoklu nükleotid polimorfizmlerinin tespiti de dahil olmak üzere önerilen yöntem, tüm deney ile, ileri araçların yardımı olmadan, 23 ° C civarındaki gerçekleştirilebilir.
Abstract
çoklu nükleotid polimorfizmi (MNT) tespit etmek için basit ve görsel bir yöntem açık yüzeyi üzerinde bir pnömatik damlacık manipülasyon platformu üzerinde gerçekleştirilmiştir. kolorimetrik DNA tespiti için bu yaklaşım, altın nano parçacık probları (AuNP Probes) hibridizasyon aracılı büyüme dayanıyordu. AuNP büyüme boyutu ve düzenlemesi probları ile hibridize DNA numunelerinin sayısı hakimdir. Nanopartiküllerin spesifik büyüklük-ve biçime bağlıdır optik özelliklerine bağlı olarak, sondalar için örnek bir DNA fragmanı uyuşmazlıkları ayırt edilmesi mümkün olan. testleri, sırasıyla reaktifler ve DNA örnekleri ihtiva eden damlacıklar ile gerçekleştirilmiştir, ve esnek PDMS göre süperhidrofobik membran kontrol pnömatik emme ile taşınan ve pnömatik bir platform üzerinde karıştırıldı. Damlacıklar hiçbir yan eff ile son derece biyouyumlu olduğu önerilen pnömatik platformda açık yüzey üzerinde aynı anda ve tam teslim edilebilirdamlacıklar içindeki DNA örneklerinin vb. İki önerilen yöntemler birleştiren çoklu nükleotid polimorfizmi pnömatik damlacık manipülasyon platformunda bakışta tespit edilebilir; hiçbir ek cihaz gereklidir. sonuca platformda damlacıklar yükleme Prosedür mevcut yöntemlere göre çok daha az az 5 dakika alır. Ayrıca, bu kombine MNP bir tarama yaklaşımı, bir makro sistemin daha belirgin az Her işlem, sadece 10 ul numune hacmi gerekir.
Introduction
Bir DNA sekansının bir tek baz çifti fark tek nükleotid polimorfizm (SNP), en yaygın genetik varyasyonları biridir. Mevcut çalışmalar SNP hastalık riski, ilaç etkinliği ve gen fonksiyonlarını etkileyerek bireylerin yan etkileri ile ilişkili olduğunu bildirmektedir. 1,2 Son çalışmalar da iki veya çok nokta mutasyonları (multi-nükleotid polimorfizmi) belirli hastalıklar ve bireysel neden olduğunu ortaya hastalığın etkileri farklılıklar. 3,4 nükleotid polimorfizm tespit hastalığı prescreening nedenle zorunludur. Diziye özgü oligonükleotid hızlı tespiti için basit ve etkili yöntemler son derece son yirmi yılda geliştirilmiştir. Vb prob immobilizasyon, floresan etiketleme, jel elektroforezi de dahil olmak üzere prosedürler genellikle DNA mutasyonları tespit dahil 1,5 Güncel yaklaşımlar, 6,7 ancak bu yöntemler genellikle masraflı, uzun analitik süreç gerektirirsive ekipman, iyi eğitimli teknisyenler ve numune ve reaktiflerin önemli tüketim.
hacmi ve benzersiz fiziksel ve kimyasal özelliklerine yüzey alanının büyük bir oranı ile bir nanopartikül belirli biyolojik bir çok hassas ve ucuz bir algılama platformu olarak ideal bir malzemedir. Altın nanopartiküller (AuNP) yaygın oligonükleotid prob ile değiştirilecek dolayı büyük bir yetenek DNA tespiti için kullanılır. 8-10 SNP tespit teknikleri de AuNP kullanılarak geliştirilmiştir. 11-13 Bu çalışmada biz tespit etmek için yeni bir kolorimetrik yaklaşımını benimsemiştir çoklu nükleotid polimorfizmi (MNT) AuNP problarının DNA hibridizasyon dolayımlı büyüme ile. 14, bu basit ve hızlı tarama yöntemi teorisine dayanmaktadır konjuge tek bağlı DNA (ssDNA) ya da çift-şeritli DNA (dsDNA) değişik uzunluklarda AuNP büyüme büyüklüğü ve şekli etkileyen AuNP (Şekil 1 e bakınız). 15, DNA Bu tespit yöntemireaktiflerin küçük tüketimi, küçük bir deney süresi (birkaç dakika) ve klinik tanı ve yerli tıbbi tarama için ileriye dönük uygulanabilir termal kontrolü olmadan basit bir prosedür vardır.
DNA'nın duyarlılık, algılama sınırı ve özgüllüğünü artırmak amacıyla deneysel protokolleri büyük ölçekli ekipman az parçalarını gerekli geleneksel deneysel protokollerin evrimleştiği, 16 o mikroakışkan sistemleri ve basitleştirilmiş DNA dizisini tespit etmek için birkaç mikroakışkan sistemleri geliştirilmiştir biyosensör. Mikroakışkan sistemleri DNA saptama yöntemleri de heterojen bir SNP tespit etmek tek okuma için, ancak, sinyal amplifikasyonu ve bir floresan okuyucu için, bir PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) gibi bir sonraki işlem aletleri makine gerektirir. 17,18 basit geliştirilmesi sonraki işlem olmadan platformu doğrudan çoklu nükleotid polimorfizmi sonuçlarını okumakyüksek ölçüde istenmektedir. Karşılaştırıldığında iyi kullanılan geleneksel, mikroakışkan kapalı sistemler, mikroakışkan cihazlar umut verici gibi net bir optik yol, örneğe erişmek için kolay bir yol, doğrudan çevre erişilebilirlik ve hiçbir kolaylıkla oluşturulan kavitasyon ya da ara yüzey tıkanıklığı gibi birçok avantaj sunar açık yüzey kanalı. 19 Daha önceki çalışma olan, bu platformun, damlacıklar aynı anda taşınan ve bir emme kuvveti kullanarak bir itici enerji müdahalesi olmaksızın manipüle edilebilir On açık yüzey damlacık manipülasyon (Şekil 2). 20 için basit bir pnömatik platformu tanıtıldı biyolojik ve kimyasal uygulamalarda büyük bir potansiyel. Bu pnömatik platformu, böylece AuNP problarının DNA hibridleşmesinden faydalanan aracılı büyüme kavramı kullanılarak kolorimetrik bir yaklaşım ile kombinasyon halinde MNT tespiti için DNA örneklerinin işleme yürütmek için kullanıldı.
Bu çalışmada sunulan protokol açıklarAçık bir yüzey üzerinde pnömatik damlacık manipülasyon platformunda çoklu nükleotid polimorfizmlerinin basit bir görsel algılama. Bu çalışma çok nükleotid polimorfizmi çıplak gözle saptanabilir olduğunu doğrular; Önerilen pnömatik platformu biyolojik ve kimyasal uygulamalar için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MNP Algılama 1. Yöntem
Not: Bu bölüm altın nanoparçacıkların hibridizasyon aracılı büyüme dayalı MNP algılamak için yordam açıklanır.
- Prob DNA konsantrasyonu 100 uM olarak (5'-tiol-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 ') çözeltisi hazırlayın.
- Prob DNA modifiye AuNP (AuNP prob) parçacıkların hazırlanması. 21
Not: Burada kullanılan hacim prob DNA modifiye AuNP (AuNP prob) parçacıkların gereksinimi bağlıdır. Deneylerin sayısı, yapılacak üzerinde dolayısıyla bağlıdır. Biz genellikle yedek olarak aşırı AuNP prob parçacıkları hazırlamak. Bu adımların kullanılan hacim ayarlanabilir ve esnektir.- Konsantrasyon 1 OD / ml altın nano partiküller içeren bir çözeltiye (13 nm, 17 nM) (100 uM, Aşama 1.1'de elde edilmiş) prob DNA ekleyin.
- Sodyum dodesil sülfat nihai konsantrasyonlar getirin (NAC 12 H 25 SO 4 SDS) ve fosfat tamponu (PBS),% 0.01 ve 0.01 M, respectivel içinY.
- 20 dakika sonra, NaCl (2M) ve PBS (0.01 M),% 0.01 SDS muhafaza edilirken bir çözeltisi ile, 0.05 M sodyum klorür (NaCI) konsantrasyonunu getirmek ve 20 dakika boyunca inkübe edin.
- 1 M üzerinde 20 dakika aralıklarla bir son konsantrasyona kadar 0.1 M artışlarla NaCI konsantrasyonunu artırır.
- 23 ° C 'de, bir girdaplı karıştırıcı üzerinde çalkalayarak gece inkübe edin. sallayarak hızı sürece DNA örnekleri ve AuNP sondalar hibritlenmiş olmak gibi deney etkilemez.
- 30 saniye boyunca 7.000 xg'de altın nanopartiküller Santrifüj ve süpernatant kaldırmak.
- 25 nM (AuNP prob çözeltisi) bir konsantrasyonda deiyonize suda (DI su) içine AuNP prob parçacıkları ekleyin.
- Hedef DNA örnekleri hazırlama (: ', üç temel-çift uyumsuz: 5'-CTTGCCTAC TTT ACCAGCTC-3'; 5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 tam olarak komplementer altı baz çiftli uyumsuz: 5'-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 ') konsantrasyonlarda0.06, 0.11, 0.17, sırasıyla, 0.20, 0.30, 0.50 uM.
- NaCl (14 uM) ile birlikte DNA örnekleri (350 ul) içine AuNP prob çözeltisi (6 ml, 25 nM) eklenir.
- DNA hibridizasyonu için 5 dakika boyunca 23 ° C'de bir girdaplı karıştırıcı ile DNA örnekleri ve AuNP problarının Karışım çalkalanır.
- AuNP büyümesi için, çözelti (DNA örnekleri ve AuNP prob karışımı) NH 2OH (6 ul, 400 mM) ve HAuCl 4 (6 ul, 25.4 mM) ilave edin. AuNP büyüme tamamlanması için yaklaşık 30 saniye sürer. renk sürekli değişim en fazla 1 saat korur.
DİKKAT: HAuCl 4 ile Ciltle temas şiddetli toksik etkiler üretebilir. Kullanmadan önce malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) danışın. Eldiven giymek ve HAuCl 4 kullanırken duman dolap kullanın.
Bir Pnömatik Damlacık Manipülasyon Platformu 2. Fabrikasyon
Not: P: PDMS tabanlı damlacık manipülasyon platformu iki bileşenden oluşursüper hidrofobik yüzey ve bir hava kanal tabakası (5 mm) DMS membran (100 um). olan bir MEMS işlemi olmadan, yaygın işleme işlemleri imalatı için mikroakışkan bileşenlerin hızlı prototipleme için bir kalıbın PDMS döküm ve çoğaltma yapmak için bir bilgisayar sayısal kontrollü (CNC) mikroişleme içeren cihaz ve lazer mikro imal kullanılmıştır süper hidrofobik yüzey (bakınız Şekil 3).
- Mikroyapısında ile PMMA esaslı ana kalıpları (bakınız Şekil 3) üretmek için bir matkap ucu (0.5 mm) ile donatılmış CNC makinesini kullanın. matkap ucu 7 mm / sn bir besleme hızı ve dönme 26,000 rpm hızını kullanın. PMMA hurda kaldırmak ve ana kalıp yüzeyini temizlemek için bir hava üfleyici ve DI su kullanın.
- PDMS taban ve oranı 10 içinde sertleştirici madde karışımı hazırlanması: 1 arasındadır. tüm hava kabarcıkları kaldırılır 30 dakika boyunca ya kadar desikatörde içinde karışım Degas.
- th içine PDMS dökünE Ana kalıp ve hava odaları ters mikro-(PDMS membran) ve hava kanalı (PDMS tabakası) elde etmek üzere bir fırında 60 ° C sıcaklıkta 3 saat PDMS fırında.
- (Elle) ana kalıp PDMS katmanı kaldırın. Hava emme ağızlığı için PDMS katman üzerinde delikler.
- Oksijen plazma arıtma sistemi odasına PDMS membran, PDMS katman ve cam alt tabaka koyun. oksijen plazma muamelesinden sonra, 10 dakika süre ile bir ocak (90 ° C) bir araya PDMS membran PDMS tabakası ve cam substrat bağlanması.
- lazer kesim makinesi (PDMS membran tarafı yukarı) içine kompozit çip koyun. süperhidrofobik alan (15 mm x 12 mm) tanımlamak için .dwg dosyasını içe aktarın. Bakınız Şekil 3. Doğrudan PDMS membran (güç 12 W, tarama hızı 106,68 mm / sn) üzerinde süperhidrofobik alan oluşturmak için bir CO 2 -lazer makinesi ile PDMS membran engrave.
- yıkamak için DI su ile süperhidrofobik yüzeyini temizleyinyüzeyde uzak kömürleşmiş artıkları.
- Bir selenoid vana aracılığıyla hava emme girişi ve vakum pompası bağlayın (Şekil 4). Bir dijital I / O USB modülü ile bilgisayar ve kontrol selenoid vana takın.
Pnömatik Platformunda MNP Saptanması İçin 3. Operasyon
Not: Bu bölüm pnömatik damlacık manipülasyon platformunda kolorimetrik ve hızla MNP tanımlamak için çalışmasını açıklar (bakınız Şekil 5). Tüm adımlar 23 ° C (ortam sıcaklığı) yeri ve bağıl nem% 85 alır.
- Pnömatik damlacık manipülasyon platformu süperhidrofobik alana (10 ul, 0.5 uM) hedef DNA örneği damlacık yerleştirin.
- Pnömatik damlacık manipülasyon platformu süperhidrofobik alanda AuNP prob damlacık (10 ul, 25 nM) yerleştirin.
- Bir selenoid vana ve bir si ile PDMS membran saptırma neden hava emiş kontrolmple programı (örneğin, Labview). damlacıkları birbiri ile çarpışır ve birleşme şekilde PDMS zar üzerinde (sırasıyla, hedef DNA ve AuNP problar ihtiva eden) damlacıklarının geçiş yolu boyunca her bir hava odası içinde hava emişi sağlar. -80 KPa (gösterge basıncı) vakum pompasının bir çalışma basıncı kullanın.
- Alternatif olarak, elle sürece damlacık tamamen karışık olarak hava emişi kontrol eder. elle bağlamak ya da test erken dönemlerinde tüplerle vakum pompası ve hava bölmesinin girişlerine ayırın.
- selenoid vana kontrol sistemi kullanılarak 3 dakika boyunca karıştırma verimliliği artırmak için ileri ve geri coalesced damlacık rulo hava emişi kontrol eder. hedef DNA ve AuNP probları iyice karıştırılır ve 3 dakika içinde melezleşmiştir olur. sırasıyla, itici frekans ve 5 Hz ve -80 kPa (gösterge basıncı) bir çalışma basıncını kullanın.
- NH2 OH (2 ul, 400 mM) ve HAuCl ihtiva eden bir damlacık yerleştirinPnömatik damlacık manipülasyon platformun süperhidrofobik alanı 4 (2 ul, 25.4 mM).
- damlacıkları birbirleriyle ve COALESCE çarpışır izin hava emişi (-80 kPa gösterge basıncı) kontrol eder. Sonra ileri ve geri coalesced damlacık rulo 1 dakika boyunca karıştırma verimliliği artırmak için izin hava emişi (5 Hz ve -80 kPa gösterge basıncı) kontrol eder.
- Tedbir ve çıplak gözle coalesced damlacık rengini kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, üç DNA örnekleri AuNP problarının DNA hibridizasyon dolayımlı büyüme ile tespit basit ve yeni bir yöntem kullanılarak test edildi. Prob DNA ve üç çeşit DNA örneklerinin dizileri, spesifik olarak, cDNA protokolün adım 1 'de listelenmektedir, TMDNA (üç baz çiftli uyuşmaz DNA) ve SixMDNA (altı baz çiftli uyuşmaz DNA) (tam olarak komplementer DNA'sını ölçmek amacıyla yapılan). burada test edilen DNA örneklerinin prob uyumsuzluklar DNA örnekleri orta segmentte hem de. 6 değişik konsantrasyonda DNA örnekleri için büyüme AuNP çözümleri renklerini göstermektedir. mükemmel şekilde uyumlu DNA (cDNA) için, çözümlerin tonlar DNA konsantrasyonu artan şeffaf sonra indigo pembe değişir ve. TMDNA için çözümler rengi koyu mor pembe gider ve daha sonra indigo ve SixMDNA için, renk DNA konsantrasyonu artan koyu pembe pembe gider. ayrı D NA örnekleri AuNP değişik büyüme boyutu ve çözümleri çeşitli renk neden prob DNA çeşitli melezleme benzerlikleri sahiptirler. TMDNA örnek prob üç baz çifti mutasyonu olan, AuNP daha küçük bir büyüme boyutu neden cDNA numunesi, daha az melezleme yakınlığına sahiptir. Şekil 6, sonuçların da gösterdiği gibi, özellikle büyük bir DNA konsantrasyonda cDNA ve TMDNA örnekler arasında renk farklılıklar vardır. prob ile birçok uyumsuzlukları sayesinde SixMDNA Örnek da 0.2 uM daha büyük bir DNA konsantrasyonu, AuNP konjüge edilmiş bir kaç dsDNA sonuçlanan prob, zayıf bir hibritleşme bir afiniteye sahiptir. AuNP büyüme boyutu AuNP çözeltisi tabii ki çıplak gözle ölçülmez amaranth, pembeden değişmesine neden bu SixMDNA örneğinde bunun sonucu olarak küçüktür. renkli görüntüler, cDNA dayanarak, TMDNA ve SixMDNA 0.50 uM 0.11 bir DNA konsantrasyonu için kabaca farklılaşmış bulunmaktadır.
"Fo: keep-together.within sayfa =" _content. Burada sunulan protokolleri ve yöntemleri ile 1 ">, açık yüzey Mikroakiskan için basit ve yeni damlacık tabanlı manipülasyon platformu oluşturmak için bir güç olarak pnömatik emme kullanma gösterildi PDMS membran damlacıkların kolay taşınması ve manipülasyon yüzey deformasyonu (Şekil 7A bakınız) damlalar halinde, bu durumda, biyo-numune, DNA kesintisiz olarak elde edilebilir. MNP yeni ve görsel saptama, bu ilgili gösterilmiştir pnömatik açık yüzeyi damlacık manipülasyon platformu. Şekil 7B'de gösterildiği gibi, bir sonucu olarak, bir DNA yanlış eşleşme tespit çıplak gözle kolaylıkla gözlemlenebilir. orijinal durumda, AuNP prob damlacık kırmızı bir renk göstermiştir. maksimum optik absorpsiyon AuNP Probes yüzey plazmon rezonansı (SPR) ile ilişkilendirilir 520 nm 'de. çeşitli DNA örneği damlacıklar, tam Cı sahip AuNP hedef prob DNA dupleksi ile hibridizasyon sonra ortaya çıkar artmış AuNP SPR özelliği kayboldu omplementary DNA (cDNA) örnek damlacık şeffaf hale geldi. Buna karşılık, AuNP üç baz çifti uyumsuz DNA (TMDNA) ve uyuşmaz DNA (SixMDNA) sırasıyla mavi ve mor altı baz çifti ile melezleşmiştir. Bu yaklaşımla, DNA tespiti önerilen platformu ve yöntem, birleştirilmiş ve bir basit bir şekilde elde etti.
AuNP tiol ile modifiye edilmiş ssDNA hibridizasyondan MNP. Tiol ile modifiye edilmiş, tek bağlı DNA (ssDNA) ya da çift-şeritli DNA (dsDNA) kolorimetrik tespiti Şekil 1. prensibi, AuNP büyüme boyutu ve şekli etkilenir ve AuNP yol açmışlardır çeşitli optik özellikleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Pnömatik damlacık manipülasyon platformu Şekil 2. şematik diyagramı. Esnek PDMS tabanlı süperhidrofobik membranın bir saptırma neden bir güç olarak pnömatik emme ile zar üzerinde damlacık böylece aktif hale gelir. Büyük halini görmek için tıklayınız bu figür.
Şekil pnömatik damlacık manipülasyon platformu 3. Fabrikasyon. Fabrikasyon bilgisayar sayısal kontrol (CNC) mikroişleme, PDMS döküm veya çoğaltma teknikleri ve lazer mikroişleme dahil. Bir larg görmek için buraya tıklayınızBu rakamın er sürümü.
Pnömatik damlacık manipülasyon platformu Şekil 4. Deneysel kurulum. Vakum pompası, hava odasında bir azalma basınç sağlamak ve damlacık manipülasyon için PDMS membran saptırma neden bir hava emiş oluşturdu. Vakum pompası ve selenoid vana ile bağlı hava kanalının giriş. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bu MNP algılama tekniği çalışması Şekil 5. şematik gösterimi. Hedef DNA içeren damlacıklar ve AuNP sondaları platformda yüklenir, karışık ve hybridized. NH2 OH ve HAuCl 4 hem de içeren damlacık platformu yüklenmiş ve AuNP büyüme için karıştırılır. Son olarak, AuNP hedef-prob DNA dubleks maksimum soğurma değiştirdi ve renk. Değişmiş bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil konsantrasyonu ile çeşitli DNA numunelerinin renk 6. değişimi. Tam Tamamlayıcı DNA (cDNA), çözeltiler tonları DNA konsantrasyonu artan indigo pembe arasında değişmektedir. TMDNA için çözümler rengi koyu mor pembe gider ve SixMDNA için, renk DNA konsantrasyonu artan koyu pembe pembe gider. Bir LAR görmek için buraya tıklayınızBu rakamın ger sürümü.
Şekil pnömatik bir platform. A damlacık 7. Images) hava emme. B kontrol) önerdiği pnömatik damlacık manipülasyon platformunda AuNP karşılık gelen hedef prob DNA çift yönlü Görüntüler pnömatik platformda damlacık taşıma seri görüntüler. Sürüş frekansı ve çalışma basıncının çalışma koşulları, sırasıyla 5 Hz ve -80 kPa (ölçüm basıncı) idi. Orijinal durumda, AuNP prob damlacık kırmızı bir renk sergiler. CDNA'ya mevcudiyetinde AuNP hedef prob DNA çift yönlü şeffaftı. TMDNA ve SixMDNA ile melezleşmiştir AuNP sondalar, mavi ve mor sırasıyla idi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. </ A>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, basit bir kolorimetrik yöntem MNP 0,11-0,50 uM arasında mikrosantrifüj tüpleri içinde değişen konsantrasyonlarda uygulanabilir tespit etmek. Ayrıca, önerilen MNP saptama yöntemi, DNA taraması ve diğer biyo-medikal uygulamalar için yüksek potansiyele sahip bir pnömatik damlacık manipülasyon platformunda yapılır. Uygulamada, DNA örneği konsantrasyonu tespit edilebilir niteliktedir çalışma platformları karıştırma verimliliğine bağlıdır. coalesced damlacık tamamen karışık olduğundan emin olmak için, bu protokolde kritik adım coalesced damlacık boyutuna bağlıdır hava emme (basınç ve frekans) kontrol edilmesidir. tam olarak komplementer örnek DNA ve uyumsuz örnek DNA arasındaki hibridizasyon afinitesi fark uzun DNA sekansı parçası için çıplak gözle ayırt etmek zordur. Bu algılama tekniği sınırlama dolayısıyla örnek DNA fragmanı uzunluğudur. Uzun DN ile numuneler içinBir sekanslar, boyutları ya da büyüme AuNP konformasyon çeşitli uyumsuzlukları içeren çeşitli DNA örnekleri benzerdir. prob DNA örneklerinin uyumsuzlukları Bu protokol orta segmentte görünür. aynı uzunluklarda ve örnek DNA homomerik uyumsuzlukları, uyuşmazlıkları konumu da AuNP hibridizasyon afinite ve büyüme boyutunu etkileyebilir. Pek çok hastalığın halen özellikle kusurlu genlerin kadar takip ediliyor. Belirli hastalıklar için genom veritabanları hala genişleyen ve gelişiyordu. spesifik DNA fragmanının DNA sekansı varyasyonu belirli bir hastalıktan sorumlu olduğu teyit edildikten sonra, (uygun bir uzunluk ve DNA uyumsuzluğu pozisyonu) özel olarak tasarlanmış prob örnek DNA yanlış eşleşme sayısı elde etmek için de kullanılabilir olarak tespit edilebilir bir konsantrasyon aralığında prob zaten bu çalışmada test edildi.
Önerilen pnömatik damlacık manipülasyon platformu gerçekleştirmek olduğunuaçık bir ortamda ed. damlacıkların buharlaşması, DNA örneklerinin konsantrasyonunu artırır ve kolorimetrik bir okuma doğruluğunu etkiler. MNP analizinin doğruluğunu iyileştirmek için, kontrollü bir ortam sıcaklığı ve nem gereklidir. Lazer mikro sunulmaktadır platformda süperhidrofobik yüzey imal etmek için uygulanmıştır. PDMS membran superhydrophobicity damlacık manipülasyon (> 20 kez) birçok yineleme altında kalıcı değil. superhydrophobicity kaybı bu damlacık manipülasyon platformu hareketlilik ve manevra kabiliyeti azalır. damlacık manipülasyon platformu (tekrar 2.6-2.8 adımlar) PDMS membran superhydrophobicity remodifying, yüzeyde superhydrophobicity kaybeder kez gereklidir. daha dayanıklı süperhidrofobik yüzeyinin basit fabrikasyon gelecek göz altında. Bu protokol, biz th kontrol etmek için (veri toplama ekipmanları ile) bir selenoid vana ve basit bir kontrol programını kullandıke hava emme. Hava emiş kontrolü başka yollarla veya ekipman dahil olmak, ancak bir solenoid valfın kullanımı sınırlı olmamak kullanılabilir.
Bu yazıda, DNA tespiti basit bir kolorimetrik yöntem ve pnömatik damlacık manipülasyon platformunun kombinasyonu tanıtıldı. Her iki teknik benzersiz ve son derece muhtemel olan; Biz aynı sonuçları elde etmek (yani hızlı ve görsel hem) alternatif DNA algılama yöntemi buldum. Optowetting, 22 dielektroforez, 23 electrowetting, 24 titreşim 25 ve termos-kapiller çalıştırma 26 rapor edilmiştir dahil bir açık yüzey üzerinde birkaç damlacık manipülasyon teknikleri. Tüm bu damlacık manipülasyon teknikleri sakıncaları önceki çalışmalarında ele alındı. 20 önerilen pnömatik platformu yukarıda belirtilen yöntemlere göre daha biyouyumlu olduğunu.
Bu teknik, o çok nükleotid polimorfizmlerinin tespit etmek içinna pnömatik damlacık manipülasyon platformu örnekleri ve reaktifler doğrudan yüklenir ve pipetler ile toplanabilir anlamına gelir biyokimyasal alanında, araştırmacılar için basittir. sunulan platformun entegrasyonu otomatik kontrol sistemi ve gelecekte gelişmiş ve geniş kullanım için bir kullanıcı arayüzü tasarımı ile yürütülmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| benchtop engravers | Roland DG | EGX-400 | |
| laser cutting machine | Universal Laser Systems, Inc. | VLS 3.50 | |
| Oxygen plasma treatment system | Femto Science Inc. Korea | CUTE-MPR | |
| solenoid valve | home built | ||
| vacuum pump | ULVAC KIKO, Inc. | DA-30D | |
| 13-nm AuNP solution | TAN Bead Inc., Taiwan | NG-13 | |
| DNA (with 5'-end labeled thiol) | MDBio, Inc., Taiwan | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | UniRegion Bio-Tech,. Taiwan | PBS001-1L | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | J. T. baker | 4095-04 | |
| Hydroxylamine solution (NH2OH) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Chloroauric acid (HAuCl4) | Sigma-Aldrich | G4022 | |
| sodium chloride (NaCl) | |||
| vortex mixer | Digisystem Laboratory Instruments Inc. | VM-2000 | |
| centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH. | Z 216 MK |
References
- Chorley, B. N., et al. Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies. Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).
- Hinds, D. A., et al. Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations. Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).
- Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. , 408 (2010).
- Whelan, S., Goldman, N. Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes. Genetics. 167 (4), 2027-2043 (2004).
- Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).
- Kim, S., Misra, A. SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).
- Kwok, P. Y., Chen, X.
- Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).
- Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles. Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).
- Storhoff, J. J., et al. Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system. Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).
- Bao, Y. P., et al. SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes. Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).
- Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases. Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).
- Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).
- Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes. Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).
- Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers. Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).
- Chen, L., Manz, A., Day, P. J. Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices. Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).
- Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform. Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).
- Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads. Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).
- Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics. Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).
- Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism. Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).
- Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).
- Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface. Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).
- Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation. J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).
- Lee, J., Kim, C. J. C. Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting. J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).
- Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes. Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).
- Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. Microfluidic actuation by modulation of surface stresses. Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).
