Summary
Dette arbeidet viser en enkel og visuell metode for å detektere multi-nukleotid polymorfismer på en pneumatisk dråpe manipulering plattform. Med den foreslåtte fremgangsmåte, hele eksperimentet, inklusive dråpe manipulering og påvisning av multi-nukleotid polymorfismer, kan utføres i nærheten av 23 ° C uten hjelp av avanserte instrumenter.
Abstract
En enkel og visuell metode for å detektere multi-nukleotid polymorfisme (MNP) ble utført på en pneumatisk dråpe manipulering plattform på en åpen overflate. Denne tilnærmingen til kolo DNA testing var basert på hybridisering-mediert vekst av gull nanopartikkel sonder (AuNP prober). Veksten størrelse og konfigurasjon av AuNP domineres av antall DNA-prøver hybridiserte med probene. Basert på de spesifikke størrelses- og formavhengige optiske egenskapene til nanopartikler, er det antall av mistilpasninger i en prøve-DNA-fragment til probene i stand til å bli diskriminert. Testene ble utført via dråper som inneholder reagenser og DNA-prøver henholdsvis, og ble transportert og blandet på den pneumatiske plattform med de kontrolleres pneumatisk suge av den fleksible PDMS-baserte superhydrophobic membran. Dråper kan leveres samtidig og presist på en åpen flate på den foreslåtte pneumatisk plattform som er svært biokompatible med nei-siden effect av DNA-prøver inne dråpene. Ved å kombinere de to foreslåtte metoder, kan den multi-nukleotid polymorfisme detekteres ved syn på pneumatisk dråpe manipulering plattform; ingen tilleggsapparatet er nødvendig. Fremgangsmåten fra å installere dråpene på plattformen til det endelige resultatet tar mindre enn 5 minutter, mye mindre enn med eksisterende metoder. Dessuten krever denne kombinerte MNP deteksjon tilnærming et prøvevolum på bare 10 ul i hver operasjon, som er bemerkelsesverdig lavere enn for en makro system.
Introduction
Enkeltnukleotidpolymorfi (SNP), som er et enkelt basepar forskjell i en DNA-sekvens, er en av de vanligste genetiske variasjoner. Aktuelle studier rapporterer at SNP'er er assosiert med sykdomsrisiko, legemidlets effekt og bivirkninger av individer ved å påvirke genfunksjon. 1,2 Nyere studier viser også at to- eller flerpunktmutasjoner (multi-nukleotid polymorfisme) forårsaker spesielle sykdommer og individuell forskjeller i effektene av sykdommen. 3,4 Påvisningen av nukleotid polymorfisme er derfor viktig i forhåndsscreening sykdom. Enkle og effektive metoder for rask påvisning av sekvensspesifikke oligonukleotider ble utviklet i de siste to tiårene. 1,5 Nåværende tilnærminger for å identifisere DNA mutasjoner vanligvis involverer prosedyrer inkludert sonde immobilisering, fluorescens merking, gel elektroforese, etc., 6,7 men disse metodene generelt krever en lang analytisk prosess, expensive utstyr, godt trente teknikere, og betydelig forbruk av prøver og reagenser.
En nanopartikkel med et stort forhold mellom overflate og volum og unike fysiske og kjemiske egenskaper er et ideelt materiale som en svært følsom og billig påvisning plattform for spesifikke biomarkører. Gull nanopartikler (AuNP) er mye brukt for DNA testing på grunn av sin store evne til å endres med oligonukleotidprober. 8-10 SNP deteksjonsteknikker ble også utviklet ved hjelp AuNP. 11-13 I dette arbeidet vi innført en ny kolo tilnærming til å detektere multi-nukleotid polymorfisme (MNP) gjennom DNA-hybridisering-mediert vekst av AuNP prober. 14 Denne enkle og raske sentret metoden er basert på teorien om at varierte lengder av enkelt-trådet DNA (ssDNA) eller dobbelt-trådet DNA (dsDNA) konjugert til AuNP påvirke vekst størrelsen og formen på AuNP (se figur 1). 15 Denne metoden for DNA gjenkjenninghar et lite forbruk av reagenser, en liten analyse varighet (noen få minutter), og en enkel prosedyre uten termisk kontroll som er prospektivt aktuelt for klinisk diagnose og innenlandsk medisinsk screening.
Flere microfluidic systemer for å oppdage DNA-sekvensen som har blitt utviklet; 16 disse microfluidic systemer utviklet seg fra tradisjonelle eksperimentelle protokoller, kreves færre biter av stor-skala utstyr og forenklet de eksperimentelle protokoller, slik som å forbedre følsomheten, påvisningsgrensen og spesifisitet av DNA biosensor. DNA deteksjonsmetoder i microfluidic systemer fremdeles krever imidlertid instrumenter for en etterfølgende prosess som en PCR (polymerase chain reaction) maskin for signalforsterkning og en fluorescens leser for en enkelt avlesning for å identifisere den heterogene SNP. 17,18 Utvikling av en enkel plattform uten den etterfølgende behandling for å direkte lese ut resultatene av multi-nukleotid polymorfismeer meget ønskelig. Sammenlignet med godt brukt, konvensjonell, lukket microfluidic systemer, open-overflaten microfluidic enheter promisingly tilbyr flere fordeler, for eksempel en klar optisk bane, en enkel måte å få tilgang til prøven, en direkte miljø tilgjengelighet og ikke lett dannet kavitasjon eller grense hindring i kanalen. 19 Vår tidligere arbeid innført en enkel pneumatisk plattform for åpen-overflate dråpe manipulering (se figur 2). 20 på denne plattformen, dråpene~~POS=HEADCOMP kan samtidig transporteres og manipuleres uten innblanding fra en drivende energi ved hjelp av en sugekraft, som har en stort potensial i biologiske og kjemiske applikasjoner. Denne pneumatiske plattform ble således benyttet for å utføre manipuleringen av DNA-prøver for deteksjon MNP i kombinasjon med den kolorimetriske metode ved bruk av konseptet med DNA-hybridisering-mediert vekst av AuNP prober.
Protokollen som presenteres i denne rapporten beskriveren enkel visuell påvisning av multi-nukleotid polymorfismer i pneumatisk dråpe manipulering plattform på en åpen overflate. Dette arbeidet bekrefter at multi-nukleotid polymorfisme er påvisbart med det blotte øye; den foreslåtte pneumatiske plattformen er egnet for biologiske og kjemiske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Metode for å oppdage MNP
Merk: Denne delen beskriver fremgangsmåten for å oppdage MNP basert på hybridisering-mediert vekst av gull nanopartikler.
- Klargjør probe-DNA (5'-tiol-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 ') oppløsning ved en konsentrasjon 100 mM.
- Forbered sonden DNA-modifisert AuNP (AuNP probe) partikler. 21
Merk: Volumet som her avhenger av kravet om probe DNA-modifisert AuNP (AuNP probe) partikler. Det er derfor avhengig av antall eksperimenter som skal utføres. Vi vanligvis forberede skytende AuNP probe partikler som reservedeler. Volumet som brukes i denne fremgangsmåten er justerbar og fleksibel.- Legg probe-DNA (100 uM, fremstilt i trinn 1.1) til en oppløsning av gull nanopartikler (13 nm, 17 nM) i en konsentrasjon 1 OD / ml.
- Bring sluttkonsentrasjonene av natriumdodecylsulfat (NaC 12 H 25 SO 4, SDS) og fosfatbuffer (PBS) til 0,01% og 0,01 M, hhv støttevalseney.
- Etter 20 min, bringe konsentrasjonen av natriumklorid (NaCl) til 0,05 M med en oppløsning av NaCl (2 M) og PBS (0,01 M) under opprettholdelse av SDS ved 0,01% og inkuber i 20 min.
- Øke NaCl-konsentrasjonen i trinn på 0,1 M til en sluttkonsentrasjon på 1 M over 20 min intervaller.
- Inkuber over natten med risting på en vortex-blander ved 23 ° C. Den ristehastigheten påvirker ikke forsøket så lenge DNA-prøver og AuNP sonder blitt hybridisert.
- Sentrifuger gull nanopartikler ved 7000 xg i 30 sek og fjern supernatanten.
- Legg AuNP probe partikler i deionisert vann (DI-vann) ved en konsentrasjon på 25 nM (AuNP sonde løsning).
- Forbered target DNA-prøver (fullt utfyllende: 5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 '; tre basepar feilaktige: 5'-CTTGCCTAC TTT ACCAGCTC-3'; seks basepar feilaktige: 5'-CTTGCCT tttttt CCAGCTC-3 ') ved konsentrasjonerav 0,06, 0,11, 0,17, 0,20, 0,30, 0,50 uM, respektivt.
- Legg AuNP probe-oppløsning (6 ul, 25 nM) inn i DNA-prøver (350 pl) med NaCl (14 uM).
- Rist blandingen av DNA-prøvene og AuNP prober med en vortex-blander ved 23 ° C i 5 minutter for DNA-hybridisering.
- For AuNP vekst, legger NH 2 OH (6 ul, 400 mM) og HAuCl 4 (6 ul, 25,4 mM) til løsningen (blandingen av DNA-prøver og AuNP prober). Veksten av AuNP tar omtrent 30 sekunder for ferdigstillelse. Den stadige endring av farge holder mer enn en time.
FORSIKTIG: Hudkontakt med HAuCl 4 kan gi alvorlige toksiske effekter. Sjå sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Vennligst bruk hansker og bruker et avtrekksskap når du bruker HAuCl 4.
2. Fabrikasjon av en pneumatisk Droplet Manipulasjon Platform
Merk: PDMS-baserte dråpe manipulasjon plattform består av to komponenter: en PDMS membran (100 um) med en super-hydrofob overflate og en luftkanal lag (5 mm). Uten en MEMS prosess, ble den vanlige maskineringsfremgangsmåter anvendes for å fremstille denne anordning, og som inneholder data-numerisk kontroll (CNC) mikromaskinering for å lage en form, PDMS støping og replikasjon for hurtig prototyping av microfluidic komponentene, og lasermaskinering for fremstilling av en super-hydrofob overflate (se figur 3).
- Bruk CNC-maskin utstyrt med en borekrone (0,5 mm) for å frembringe PMMA-baserte stamstøpeformer (se figur 3) med mikrostrukturer. Bruke en matehastighet av borkronen 7 mm / sek og en rotasjonshastighet 26 000 rpm. Bruk en luftblåser og DI vann for å fjerne PMMA skrap og å rengjøre overflaten av master muggsopp.
- Fremstille en blanding av PDMS base og herder i forholdet 10: 1. Avgasse blandingen inne i en eksikator i 30 minutter, eller inntil alle luftbobler er fjernet.
- Hell PDMS til the mestre mugg og bake PDMS i 3 timer ved 60 ° C i ovnen for å oppnå de inverse mikrostrukturer av luftkamrene (PDMS membran) og luftkanalene (PDMS lag).
- Fjern det PDMS lag fra masterformen (for hånd). Punch hull på PDMS lag for luftutblåsningsventiler.
- Sett PDMS membranen, PDMS lag og glassubstratet inn i kammeret av den oksygenplasmabehandlingssystem. Etter oksygen-plasmabehandling, binde PDMS membranen, PDMS lag og glassubstratet sammen på en varmeplate (90 ° C) i 10 minutter.
- Sett kompositt chip inn i laser-cutting maskin (PDMS membran siden opp). Importere DWG-filen for å definere superhydrophobic området (15 mm x 12 mm). Se figur 3. Direkte gravere PDMS membranen med CO 2-lasermaskin for å lage superhydrophobic området på PDMS membran (effekt 12 W, skanning hastighet 106,68 mm / sek).
- Rengjør superhydrophobic overflaten med DI vann for å vaskeunna de forkullede rester på overflaten.
- Koble luft-sugeinnløpet og vakuumpumpen gjennom en magnetventil (se figur 4). Koble magnetventilen til datamaskinen og styre med en digital I / O-modul USB.
3. Drift for deteksjon av MNP på Pneumatisk Platform
Merk: Denne delen beskriver operasjonen for å identifisere kolorimetrisk og raskt det MNP på pneumatiske dråpe manipulasjon plattform (se figur 5). Alle trinn skjer ved 23 ° C (omgivelsestemperatur) og relativ fuktighet 85%.
- Plasser mål-DNA-prøven dråpe (10 ul, 0,5 um) på superhydrophobic området av pneumatisk dråpe manipulering plattform.
- Plasser AuNP sonden dråpe (10 ul, 25 nM) på superhydrophobic området av pneumatisk dråpe manipulering plattform.
- Regulere luftsugekraft for å bevirke nedbøyning av PDMS membran med en magnetventil og en simple program (f.eks LabVIEW). Tilveiebringe luft sug i hvert luftkammer langs oppgraderingsveg av dråpene (inneholdende mål-DNA og AuNP prober henholdsvis) på PDMS membranen slik at dråpene kolliderer med hverandre og vokser sammen. Bruker et arbeidstrykk av vakuumpumpen fra -80 kPa (overtrykk).
- Alternativt kan regulere luftsuge manuelt så lenge dråpen er fullstendig blandet. For hånd, koble til eller fra vakuumpumpen og viker av luftkammer med rør i de tidlige stadiene av testing.
- Regulere luftsuge å rulle sammensmeltede dråpe forover og bakover for å forbedre blandeeffektiviteten i 3 minutter ved bruk av den kontrollerende system av magnetventilen. Mål-DNA og AuNP prober blir godt blandet og hybridisert i løpet av 3 min. Bruke en drivende frekvens og et arbeidstrykk på 5 Hz og -80 kPa (overtrykk), respektivt.
- Plasser en dråpe som inneholder NH2 OH (2 ul, 400 mM) og HAuCl4 (2 mL, 25,4 mM) i superhydrophobic området av pneumatisk dråpe manipulering plattform.
- Regulere luftsuge (-80 kPa overtrykk) for å la dråpene kolliderer med hverandre og samles. Deretter kontrollerer luften suge (5 Hz og -80 kPa overtrykk) å la smeltede dråpe roll fremover og bakover for å forbedre blande effektivitet i 1 min.
- Måle og registrere fargen på de kombinerte dråpe med det blotte øye.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette arbeidet ble tre DNA-prøver testet ved hjelp av en enkel og ny fremgangsmåte for deteksjon gjennom DNA-hybridisering-mediert vekst av AuNP probene. Sekvensene av probe DNA og DNA-prøver av tre typer, spesielt, cDNA (fullt komplementær å sondere DNA), TMDNA (tre basepar feilaktige DNA), og SixMDNA (seks basepar feilaktige DNA) er oppført i protokoll trinn 1. uoverensstemmelsene til sonden av DNA-prøvene som ble testet her befinner seg i de midtre deler av DNA-prøvene. Figur 6 viser fargene på vekst AuNP løsninger for DNA-prøvene ved variert konsentrasjon. For perfekt matchet DNA (cDNA), nyanser av løsninger varierer fra rosa til indigo og deretter til transparent med økende DNA konsentrasjon. For TMDNA, fargen på løsninger går fra rosa til mørk lilla og deretter til Indigo, og for SixMDNA, går fargen fra rosa til mørk rosa med økende DNA konsentrasjon. Den separate D NA prøver besitter varierende hybridiserings-affiniteter til sonde-DNA som forårsaket variert vekst størrelse på AuNP og variert farge av løsninger. Den TMDNA prøve, med tre basepar-mutasjon fra sonden, har mindre affinitet enn hybridisering cDNA-prøven, noe som forårsaket en mindre vekst størrelse på AuNP. Som resultatene i figur 6 viser, er det forskjell på farge mellom cDNA og TMDNA prøver, særlig ved et stort DNA-konsentrasjon. Gjennom mange mistilpasninger med sonden, har SixMDNA prøven en svak hybridisering affinitet til sonden, noe som resulterte i noen få dsDNA konjugert til AuNP, selv med DNA-konsentrasjon er større enn 0,2 um. Veksten Størrelsen på AuNP er følgelig liten i dette SixMDNA prøven, forårsaker AuNP løsningen for å skifte fra rosa til amaranth, som ikke er selvsagt måles med et blotte øye. Basert på fargebilder, cDNA, TMDNA og SixMDNA er omtrent differensiert for en DNA-konsentrasjon 0,11 til 0,50 uM.
_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Med protokoller og metodene som presenteres her, ble en enkel og romanen dråpebasert manipulering plattform for åpen flate MicroFluidics demonstrert ved hjelp av pneumatisk suge som en kraft til å generere. overflate deformasjon av PDMS membranen, den lettvinte transport og manipulering av små dråper kan oppnås uten avbrytelse til den bio-prøven, DNA i dette tilfelle, i dråpene (se figur 7A). det nye og visuell påvisning av MNP demonstreres på denne pneumatisk åpen overflate dråpe manipulasjon plattform. som et resultat som vist i figur 7B, påvisning av en DNA-mistilpasning er lett observerbare med det blotte øye. i den opprinnelige tilstand, den AuNP sonden dråpe utviste en rød farge. den maksimale optiske absorpsjon av AuNP sondene forekommer ved 520 nm, noe som skyldes en overflate-plasmonresonans (SPR). Etter hybridisering med de forskjellige DNA-prøvedråper, DNA-dupleks den target-probe av AuNP med en fullt c omplementary DNA (cDNA) prøve dråpene ble gjennomsiktig som SPR funksjon av økt AuNP forsvant. I kontrast, AuNP hybridisert med tre basepar feilaktige DNA (TMDNA) og seks basepar feilaktige DNA (SixMDNA) var blå og lilla hhv. Med denne fremgangsmåten, blir den foreslåtte plattform og fremgangsmåte for DNA gjenkjenning kombinert og oppnås på en enkel måte.
Figur 1. Prinsipp av kolorimetrisk påvisning av MNP. Tiolen-modifiserte enkelt-trådet DNA (ssDNA) eller dobbelt-trådet DNA (dsDNA) fra hybridiseringen av den thiol-modifiserte ssDNA på AuNP påvirket vekst størrelsen og formen på AuNP, og forårsaket varierte optiske egenskapene til AuNP. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Skjematisk fremstilling av pneumatiske dråpe manipulasjon plattform. Med en pneumatisk suge som en kraft til å forårsake en bøyning av fleksible PDMS-baserte superhydrophobic membran, dråpe på membranen blir dermed aktivert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Fabrikasjon av en pneumatisk dråpe manipulasjon plattform. Fabrikasjon inkludert data numerisk kontroll (CNC) mikro, PDMS casting eller replikering teknikker, og laser mikro. Klikk her for å se en largeh versjon av denne figuren.
Figur 4. Eksperimentelt oppsett av pneumatisk dråpe manipulasjon plattformen. Vakuumpumpen genereres en luft sug for å tilveiebringe et redusert trykk i luftkammeret, og for å bevirke at avbøyningen av PDMS membran for dråpe-manipulasjon. Vakuumpumpen og innløpet av luftkanalen er forbundet gjennom magnetventilen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Skjematisk illustrasjon av virkemåten til denne MNP deteksjonsteknikken. Dråpene som inneholder mål-DNA og AuNP sondene er lastet på plattformen, blandet og hybridized. Dråpen som inneholder både NH 2 OH og HAuCl 4 er lastet på plattformen og blandet for AuNP vekst. Til slutt, målet-probe DNA dupleks av AuNP flyttet absorpsjon maksimale og endret farge. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Variasjon av fargen på ulike DNA-prøver med konsentrasjon. For det fullt komplementær DNA (cDNA), nyanser av løsninger varierer fra rosa til Indigo med økende DNA konsentrasjon. For TMDNA, fargen på løsninger går fra rosa til mørk lilla, og for SixMDNA, går fargen fra rosa til mørk rosa med økende DNA konsentrasjon. Klikk her for å se et LARger versjon av denne figuren.
Figur 7. Bilder av dråpe på den pneumatiske plattformen. A) Serie bilder av dråpe transport på den pneumatiske plattformen med kontroll av luft sug. B) Bilder av den tilsvarende target-probe DNA dupleks av AuNP på den foreslåtte pneumatisk dråpe manipulasjon plattform. Driftsbetingelsene for den drivende frekvens og arbeidstrykket var 5 Hz og -80 kPa (overtrykk), respektivt. I den opprinnelige tilstanden, viser den AuNP sonde dråpe en rød farge. Den target-probe-DNA dupleks av AuNP i nærvær av cDNA var gjennomsiktig. De AuNP prober hybridisert med TMDNA og SixMDNA var blå og lilla hhv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. </ A>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen, til en enkel kolo metode oppdage MNP kan implementeres i konsentrasjoner fra 0.11-0.50 mikrometer i Mikrosentrifugerør. Videre er den foreslåtte MNP påvisningsmetoden utført på en pneumatisk dråpe manipulering plattform som har et høyt potensiale for DNA-screening og andre bio-medisinske anvendelser. I praksis er den detekterbare utvalget av prøve-DNA-konsentrasjonen er avhengig av den omrøringseffekt av driftsplattformer. For å sikre at den sammensmeltede dråpen er fullstendig blandet, det kritiske trinn i denne protokollen er kontrollen av luftsuge (trykk og frekvens) som avhenger av størrelsen av det sammensmeltede dråpe. Avviket av hybridisering affiniteten mellom den fullstendig komplementære DNA-prøven og den feilaktige prøve-DNA er vanskelig å skille med det blotte øye for en lang DNA-sekvens-fragment. Begrensningen av denne deteksjonsteknikken er derfor fragmentet lengden av prøve-DNA. For prøver med lang DNA-sekvensene, de størrelser eller konformasjon av vekst AuNP er lik de av ulike DNA-prøver inneholdende forskjellige ikke stemmer overens. De manglende matching av DNA-prøver til sonden vises i midten segmentet i denne protokollen. Med identiske lengder og homomeric mistilpasninger av prøve-DNA, kan posisjonen av mistilpasninger også påvirke hybridisering affinitet og vekst størrelse på AuNP. Mange sykdommer blir nå spores tilbake til bestemte defekte gener. Genomet databaser for bestemte sykdommer er fortsatt å utvide og forbedre. Så snart DNA-sekvensvariasjon av det spesifikke DNA-fragment som er bekreftet å være ansvarlig for en spesifikk sykdom, kan den spesielt utformet sonde (med en passende lengde og mismatch stilling av DNA) bli brukt for å erverve antall mistilpasninger av prøve-DNA til sonde innenfor den detekterbare konsentrasjonsområde på grunnlag som allerede er testet i dette arbeidet.
Den foreslåtte pneumatiske dråpe manipulasjon plattformen er utføreed i et åpent miljø. Fordampningen av dråper øker konsentrasjonen av DNA-prøver og påvirker nøyaktigheten av den kolorimetriske avlesning. For å forbedre nøyaktigheten av MNP-analyse, blir en kontrollert miljø temperatur og fuktighet som kreves. Lasermikro ble påført for å fremstille en superhydrophobic overflate i frem plattformen. Den superhydrophobicity av PDMS membranen ikke vedvare under mange iterasjoner av dråpe manipulering (> 20 ganger). Tapet av superhydrophobicity reduserer mobilitet og manøvrerbarhet av dette dråpe manipulasjon plattformen. Når dråpen manipulering plattformen mister superhydrophobicity på overflaten, remodifying den superhydrophobicity av PDMS membranen (gjenta trinn 2.6 til 2.8) er nødvendig. Den enkle fremstilling av et mer slitesterkt superhydrophobic overflate er under vurdering i fremtiden. I denne protokollen, brukte vi en magnetventil og en enkel kontrollerende program (med datainnsamling utstyr) til å kontrollere the luft sug. Styringen av luftsuge kan utnyttes på andre måter eller med utstyr inkludert, men ikke begrenset til, bruk av en magnetventil.
I dette manuskriptet, introduserte vi en kombinasjon av en enkel kolo metode for DNA deteksjon og en pneumatisk dråpe manipulasjon plattform. Begge teknikkene er unike og svært prospektive; Vi fant ingen alternativ DNA-deteksjonsmetode (som er både hurtig og visuelle) for å oppnå de samme resultatene. Flere dråpemanipulasjonsteknikker på en åpen flate inkludert optowetting, 22 dielectrophoresis, 23 electrowetting, 24 vibrasjon 25 og termos-kapillær aktiverings 26 er rapportert. Ulempene ved alle disse dråpemanipulasjonsteknikker ble diskutert i vårt tidligere arbeid. 20 Den foreslåtte pneumatiske plattformen er mer bioforenelig enn de tidligere nevnte fremgangsmåter.
Denne teknikk til å detektere flere nukleotid polymorfismer ona pneumatisk dråpe manipulasjon plattformen er enkel for forskere på biokjemiske felt, noe som betyr at prøver og reagenser kan være direkte lastet og oppsamles med pipetter. Integrasjonen av de presenterte plattformen blir gjennomført med et automatisk kontrollsystem og en utforming av et brukergrensesnitt for bedre og bred bruk i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| benchtop engravers | Roland DG | EGX-400 | |
| laser cutting machine | Universal Laser Systems, Inc. | VLS 3.50 | |
| Oxygen plasma treatment system | Femto Science Inc. Korea | CUTE-MPR | |
| solenoid valve | home built | ||
| vacuum pump | ULVAC KIKO, Inc. | DA-30D | |
| 13-nm AuNP solution | TAN Bead Inc., Taiwan | NG-13 | |
| DNA (with 5'-end labeled thiol) | MDBio, Inc., Taiwan | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | UniRegion Bio-Tech,. Taiwan | PBS001-1L | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | J. T. baker | 4095-04 | |
| Hydroxylamine solution (NH2OH) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Chloroauric acid (HAuCl4) | Sigma-Aldrich | G4022 | |
| sodium chloride (NaCl) | |||
| vortex mixer | Digisystem Laboratory Instruments Inc. | VM-2000 | |
| centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH. | Z 216 MK |
References
- Chorley, B. N., et al. Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies. Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).
- Hinds, D. A., et al. Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations. Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).
- Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. , 408 (2010).
- Whelan, S., Goldman, N. Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes. Genetics. 167 (4), 2027-2043 (2004).
- Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).
- Kim, S., Misra, A. SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).
- Kwok, P. Y., Chen, X.
- Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).
- Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles. Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).
- Storhoff, J. J., et al. Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system. Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).
- Bao, Y. P., et al. SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes. Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).
- Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases. Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).
- Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).
- Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes. Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).
- Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers. Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).
- Chen, L., Manz, A., Day, P. J. Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices. Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).
- Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform. Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).
- Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads. Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).
- Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics. Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).
- Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism. Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).
- Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).
- Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface. Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).
- Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation. J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).
- Lee, J., Kim, C. J. C. Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting. J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).
- Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes. Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).
- Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. Microfluidic actuation by modulation of surface stresses. Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).
