We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.
कसकर बाध्य प्रोटीन और विभिन्न घावों सहित डीएनए, पर उपस्थित बाधाओं, गंभीर रूप से सेल की प्रतिकृति मशीनरी की प्रगति को बाधित कर सकते हैं। एक replisome के रोकने गुणसूत्र से, या तो भाग या अपनी संपूर्णता में अपने हदबंदी करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, प्रतिकृति कांटा के पतन के लिए अग्रणी। इस पतन से वसूली सेल करने के लिए सही ढंग से पूरा गुणसूत्र दोहराव और बाद में विभाजित के लिए एक जरूरत है। इसलिए, जब पतन होता है, सेल विकसित किया गया है विविध तंत्र है कि डीएनए कांटा बहाल करने और प्रतिकृति अनुमति देने के लिए जगह लेने के लिए उच्च निष्ठा के साथ पूरा किया जाना है। इससे पहले, बैक्टीरिया में इन प्रतिकृति की मरम्मत रास्ते यूवी क्षति है, जो एक ज्ञात साइट के लिए स्थानीय नहीं होने का नुकसान है का उपयोग कर अध्ययन किया गया है। इस पांडुलिपि की एक प्रणाली एक प्रतिदीप्ति repressor ऑपरेटर प्रणाली (FROS) का उपयोग एक साइट विशेष प्रोटीन ब्लॉक कि रोकने के लिए और प्रतिकृति के पतन के लिए प्रेरित कर सकते हैं बनाने के लिए का वर्णनकोलाई में RKS। प्रोटोकॉल विस्तार कैसे प्रतिकृति की स्थिति प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और डीएनए प्रतिकृति मध्यवर्ती का उपयोग कर एक जीवित कोशिकाओं में देखे जा सकते हैं 2-आयामी agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। Replisome घटकों (जैसे DnaBts) का तापमान संवेदनशील म्यूटेंट प्रतिकृति कांटे की एक तुल्यकालिक पतन के लिए प्रेरित करने के लिए प्रणाली में शामिल किया जा सकता है। इसके अलावा, पुनर्संयोजन प्रोटीन और helicases कि इन प्रक्रियाओं में शामिल रहे हैं की भूमिका इस प्रणाली के भीतर आनुवंशिक नॉकआउट का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है।
डीएनए प्रतिकृति के दौरान, replisome डीएनए कि इसकी प्रगति ख़राब पर बाधाओं का सामना करना पड़ता। डीएनए के रूप में अच्छी तरह से घावों और अंतराल सहित नुकसान न्यायपालिका संरचनाओं 1 आगे बढ़ने से रोका जा सकता है replisome। हाल ही में, यह पाया गया है कि डीएनए के लिए बाध्य प्रोटीन बाधा का सबसे आम स्रोत कांटा प्रगति 2 पुनरावृत्ति कर रहे हैं। एक nucleoprotein ब्लॉक के साथ replisome की मुठभेड़ के बाद की घटनाओं का ज्ञान पहले से एक ज्ञात स्थान पर एक जीवित कोशिका के गुणसूत्र में इस तरह के एक ब्लॉक के लिए प्रेरित करने में असमर्थता द्वारा सीमित किया गया है। इन विट्रो विश्लेषण गतिज व्यवहार के बारे में हमारी समझ में इजाफा किया है एक सक्रिय replisome जब यह एक nucleoprotein रुकावट 3, साथ ही replisome खुद 4,5 के यंत्रवत विवरण मिलता है। प्रतिकृति की मरम्मत के वर्तमान को समझने में आम तौर पर हानिकारक एजेंट के रूप में यूवी के साथ किया जाता है और अध्ययन किया है विवो 6-8 में प्लास्मिड डीएनए का उपयोग </s> अप। जबकि प्रोटीन है कि, डीएनए की मरम्मत में शामिल किया जा सकता है कि यह एक विवो nucleoprotein ब्लॉक आम तौर पर इन अध्ययनों से समझ रहे हैं मुठभेड़ों के बाद मरम्मत रास्ते प्रतिकृति ब्लॉक में अलग-अलग कारण के कारण भीतर आणविक घटनाओं में बदलाव अभी तक कर रहे हैं कि क्या अब भी है निर्धारित किए जाने हेतु।
यहाँ, हम एक प्रणाली एक nucleoprotein ब्लॉक गुणसूत्र एक फ्लोरोसेंट repressor ऑपरेटर प्रणाली (FROS) का उपयोग करने का एक विशिष्ट स्थान में स्थापित करने की अनुमति देता है कि वर्णन है। हम ई के एक तनाव का उपयोग कोलाई कि 240 teto गुणसूत्र 9 में शामिल साइटों की एक सरणी पड़ा है। सरणी के भीतर प्रत्येक teto साइट ने 10 बीपी यादृच्छिक flanking यह सरणी के भीतर Reca की मध्यस्थता पुनर्संयोजन को रोकने के द्वारा सरणी की स्थिरता को बढ़ाने के अनुक्रम है। इस सरणी, और यह की विविधताओं, मूल रूप से ई समझने के लिए इस्तेमाल किया गया कोलाई गुणसूत्र गतिशीलता 10,11 लेकिन फिर preve करने के लिए अनुकूलित किया गयाNT में विवो प्रतिकृति 12। सरणी पाया गया है स्थिरतापूर्वक बनाए रखा जाए और जब tetr 10,12 से बंधे प्रतिकृति कांटे की 100% के करीब ब्लॉक करने के लिए। इन विट्रो में समान LACO सरणी का उपयोग करते हैं, के रूप में 22 साइटों प्रतिकृति के 90% ब्लॉक करने के लिए पर्याप्त थे कुछ के रूप में पाया गया है, हालांकि यह कम सरणी विवो 13 में कम प्रभावी था। एक nucleoprotein रुकावट पैदा करने के लिए अनुकूल करने के लिए सरणी, repressor प्रोटीन अत्यधिक अनुकूलित शर्तों जहां यह तो सरणी को बांधता एक अंधी गली बनाने के तहत overproduced किया जाना चाहिए। यदि Tet repressor की एक fluorescently टैग संस्करण प्रयोग किया जाता है रुकावट के गठन, और उसके बाद रिहाई, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के प्रयोग के माध्यम से नजर रखी जा सकती है। प्रत्येक कोशिका में प्रतिकृति का दर्जा देखा foci की संख्या, जहां एक ही केन्द्र बिन्दु का मतलब सरणी की केवल एक प्रति कोशिका के भीतर मौजूद है और कई foci सक्रिय प्रतिकृति का संकेत कर रहे हैं ने संकेत दिया है। यह सक्रिय पुनजब nucleoprotein रुकावट अहेतुक inducer कि ऑपरेटर साइट के लिए tetr के बंधन आत्मीयता पर्याप्त कम हो जाती है replisome सरणी के माध्यम से आगे बढ़ने के लिए के अलावा द्वारा उलट है तह सक्षम है। repressor प्रोटीन अभी भी पर्याप्त उच्च आत्मीयता के साथ डीएनए कि सरणी के अब कई प्रतियां देखे जा सकते हैं करने के लिए बाध्य करने में सक्षम है।
Nucleoprotein रुकावट में घटनाओं की अधिक जटिल विवरण तटस्थ तटस्थ दो आयामी agarose जेल वैद्युतकणसंचलन और दक्षिणी संकरण 14-16 का उपयोग कर की खोज की जा सकती है। इन तकनीकों में जनसंख्या भर में डीएनए संरचना का विश्लेषण अनुमति देते हैं। प्रतिकृति मध्यवर्ती कि घटना के दौरान गठित कर रहे हैं, और संभवतः, बिना मरम्मत के रहने देखे जा सकते हैं। प्रतिबंध एंजाइम और जांच के लिए उपयोग अलग करके, मध्यवर्ती सरणी क्षेत्र में बल्कि सरणी नदी के ऊपर जब प्रतिकृति कांटा regresses 17,18 न केवल कल्पना की जा सकती है।प्रतिगमन replisome हदबंदी करने के बाद जगह लेता है; अग्रणी और ठंड नवजात किस्में टेम्पलेट किस्में समवर्ती फिर से पानी रखना एक चार रास्ता डीएनए संरचना (एक अवकाश जंक्शन) में जिसके परिणामस्वरूप के रूप में एक दूसरे के लिए टेम्पलेट किस्में और पानी रखना से अलग।
इस प्रणाली में यह दिखाया गया है कि प्रतिकृति कांटा स्थिर जब यह इस ब्लॉक में 18 मुठभेड़ों नहीं है का उपयोग करना। इसके अलावा, replisome घटकों के तापमान संवेदनशील डेरिवेटिव प्रतिकृति कांटा के पुन: लोड एक बार यह ढह गया है को रोकने के लिए उपयोग किया जा सकता है। एक बार एक ब्लॉक की स्थापना की है, तनाव एक गैर अनुमोदक तापमान को स्थानांतरित किया जा सकता replisome का एक तुल्यकालिक छोड़ना और पुन: लोड के एक नियंत्रित रोकथाम सुनिश्चित करने के लिए। इस तापमान प्रेरित छोड़ना आबादी एक निश्चित समय पर ध्वस्त हो गई है भीतर कांटे के सभी सुनिश्चित करता है और क्या होता है जब replisome, गिर कैसे डीएनए संसाधित किया जाता है, और क्या फिर से करने की आवश्यकता है के मूल्यांकन की अनुमति देताडीएनए प्रतिकृति की प्रक्रिया शुरू करते हैं।
यहाँ वर्णित प्रणाली का एक लाभ यह है कि nucleoprotein ब्लॉक पूरी तरह से प्रतिवर्ती है; इसलिए, nucleoprotein ब्लॉक से उबरने के लिए कोशिकाओं की क्षमता का पालन किया जा करने में सक्षम है। कोशिकाओं को anhydrotetracycline के अलावा तंग repressor के बंधन से राहत मिल जाएगी, एक प्रतिकृति कांटा के माध्यम से आगे बढ़ने की अनुमति देता है और व्यवहार्यता हासिल करने के लिए सेल। रुकावट की राहत के 5 मिनट के बाद तटस्थ तटस्थ दो आयामी agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा देखे जा सकते हैं, और 10 मिनट के भीतर माइक्रोस्कोपी द्वारा। इसके अलावा, व्यवहार्यता विश्लेषण प्रतिकृति रुकावट से उबरने और पैदा करना जारी रखने के लिए तनाव की क्षमता को प्रकट कर सकते हैं।
यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रिया में इस्तेमाल उपभेदों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि में फेरबदल करके, रुकावट के इस प्रकार के मरम्मत रास्ते elucidated जा सकता है।
During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].
Tryptone | Sigma-Aldrich | 16922 | Growth media component |
Sodium Chloride | VWR | 27810.364 | Growth media component |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 92144 | Growth media component |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth media component; Potassium buffer component |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth media component; Potassium buffer component |
L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | For induction of TetR-YFP production |
Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | Release of replication bloackage |
Axioskop 2 Fluorescence microscope | Zeiss | 452310 | Visualization of cells |
eYFP filter set | Chroma Technology | 41028 | Visualization of YFP |
CCD camera | Hamamatsu | Orca-AG | Visualization of cells |
MetaMorph Software (Molecular Devices) | SDR Scientific | 31282 | Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript |
Agarose | Bioline | BIO-41025 | For agarose plugs and gel electrophoresis |
Original Glass Water Repellent (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | For agarose plug manufacture |
TRIS | VWR | VWRC103157P | TE, TBE buffer component |
Ethylene diaminetetraacetic acid | Ajax Finechem | AJA180 | 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH. |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Bacteriostatic agent |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | TE buffer component |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Cell lysis buffer component |
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L5125 | Cell lysis and ESP buffer component |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | Cell lysis buffer component |
Lysozyme | Amresco | 6300 | Cell lysis buffer component |
Proteinase K | Amresco | AM0706 | ESP buffer component |
Sub-Cell Model 192 Cell | BioRad | 1704507 | Electrophoresis system |
UV transilluminator 2000 | BioRad | 1708110 | Visualization of DNA |
Ethidium Bromide | BioRad | 1610433 | Visualization of DNA |
Boric acid | VWR | PROL20185.360 | TBE component |
Hybond-XL nylon memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used |
3MM Whatman chromatography paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | Southern blotting |
HL-2000 Hybrilinker | UVP | 95-0031-01/02 | Crosslinking of DNA and hybridization |
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm | Sigma-Aldrich | 31149 | Hybridization buffer component |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Denaturation buffer component |
Trisodium citrate dihydrate | VWR | PROL27833.363 | Transfer buffer |
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Amresco | 227 | Wash buffer component |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Hybridization buffer component |
Random Hexamer Primers | Bioline | BIO-38028 | |
Klenow fragment | New England BioLabs | M0212L | |
dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
Storage Phosphor Screen | GE Healthcare Life Sciences | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen |
Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Visualization of blot |
Hybridization bottle | UVP | 07-0194-02 | 35 x 300mm |