We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.
Препятствия, присутствующие на ДНК, в том числе плотно связанных белков и различных повреждений, может серьезно тормозят прогрессирование аппарата репликации клетки. Глохнет из replisome может привести к его диссоциации из хромосомы, либо частично или полностью, что приводит к коллапсу репликативной вилки. Восстановление после этого краха является необходимостью для клетки точно полное дублирование хромосомные и впоследствии разделить. Поэтому, когда происходит коллапс, клетка эволюционировала различные механизмы, которые имеют место, чтобы восстановить вилы ДНК и позволяют репликации должна быть завершена с высокой точностью. Ранее эти ремонтные репликации путей у бактерий были изучены с использованием УФ-повреждения, который имеет тот недостаток, что не локализованы в известном месте. Эта рукопись описывает систему с использованием системы флуоресценция репрессора оператора (FROS), чтобы создать сайт-специфический блок белка, который может вызвать пробуксовки и коллапс репликации FoRKS в кишечной палочки. Протоколы подробно рассматривается, как состояние репликации могут быть визуализированы в одиночных живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии и репликации ДНК промежуточных соединений могут быть проанализированы с помощью 2-мерного электрофореза в агарозном геле. Чувствительные к температуре мутанты replisome компонентов (например , DnaBts) могут быть включены в систему , чтобы вызвать синхронное коллапс вилок репликации. Кроме того, роль рекомбинации белков и геликаз, которые участвуют в этих процессах могут быть изучены с использованием генетических нокаутов в рамках этой системы.
Во время репликации ДНК, то replisome сталкивается с препятствиями на ДНК, которые нарушают ее прогрессирование. Повреждение ДНК , включая поражений и пробелов, а также аномальным структуры могут помешать replisome от 1 продолжить. В последнее время было обнаружено , что белки , которые связываются с ДНК , являются наиболее распространенным источником препятствий для репликации вилки прогрессии 2. Знание событий после столкновение с replisome с нуклеопротеидной блока ранее было ограничено неспособностью вызвать такой блок в хромосоме живой клетки в известном месте. В пробирке анализ углубили наше понимание кинетического поведения активного replisome , когда он встречает нуклеопротеидную засорение 3, а также механистические детали самого 4,5 replisome. Современное понимание ремонта репликации , как правило , проводится с УФ в качестве повреждающего агента и исследовали с использованием плазмидной ДНК в естественных условиях 6-8 </sвверх>. В то время как белки , которые могут быть вовлечены в восстановление ДНК после того, как он встречает нуклеопротеидную блок в естественных условиях , как правило , понятны из этих исследований, есть ли различия в молекулярных событий в пределах ремонтных путей вследствие отчетливой причины в блоке репликации до сих пор еще быть определенным.
Здесь мы описываем систему, которая позволяет нуклеопротеид блок, который будет создан в определенном месте хромосомы с использованием системы Fluorescent репрессора оператора (FROS). Мы используем штамм E. палочка, которая была массив 240 сайтов Teto включенных в хромосоме 9. Каждый сайт Teto в массиве имеет 10 п.н. случайную последовательность фланкирующей это повышение устойчивости массива путем предотвращения RecA-опосредованной рекомбинации в пределах массива. Этот массив, и вариации этого, первоначально использовались , чтобы понять , E. динамика 10,11 палочки хромосом , но затем были адаптированы к Превент в естественных условиях репликации 12. Массив было установлено, стабильно поддерживаться и блокировать близка к 100% вилок репликации при связывании тетр 10,12. Использование подобного массива Laco в пробирке нашел всего лишь 22 сайта было достаточно , чтобы блокировать 90% репликации, хотя этот короткий массив был менее эффективен в естественных условиях 13. Для того, чтобы адаптировать массив для создания нуклеопротеидную засорение, белок репрессор должен быть сильно избыточном в оптимальных условиях, где она затем связывается с массива для создания контрольно-пропускной пункт. Формирование закупорки, и его последующее высвобождение, можно контролировать путем использования флуоресцентной микроскопии, если флуоресцентно меченый вариант репрессора Tet используется. Статус репликации в каждой ячейке указывается числом очагов видно, где один координационный центр означает только одна копия массива присутствует в клетке и множественные фокусы свидетельствуют о активной репликации. Это активное повторноепликация включается, когда нуклеопротеид закупорка восстанавливается добавлением безвозмездное индуктора, что уменьшает сродство связывания тетр для сайта оператора достаточно для replisome пройти через массив. Белок-репрессор по-прежнему способен связываться с ДНК с достаточно высоким сродством, которые могут быть визуализированы в настоящее множественные копии массива.
Более сложные детали событий на нуклеопротеидной закупорки могут быть обнаружены с помощью нейтрально-нейтрального двумерную электрофореза в агарозном геле и гибридизацию 14-16. Эти методы позволяют анализировать структуры ДНК по всей популяции. Промежуточные репликации, которые образуются в ходе мероприятия, и потенциально остаются неотремонтированный, могут быть визуализированы. Изменяя фермента рестрикции и зонд разведения, промежуточные продукты могут быть визуализированы не только в области массива , но и выше по потоку от массива , когда вилка репликации регрессирует 17,18.регрессия происходит вслед за replisome диссоциации; ведущие и отстающие зарождающиеся нити отдельно от нитей шаблонов и отжигу друг с другом в виде нитей шаблона по совместительству повторной отжигу, что приводит к структуре ДНК четырех направлениях (а Holliday соединения).
С помощью этой системы было показано , что вилка репликации не является стабильным , когда он сталкивается с этим блок 18. Кроме того, чувствительные к температуре производные компонентов replisome могут быть использованы для предотвращения перегрузки репликативной вилки, как только она разрушилась. После того, как блок устанавливается, штамм может быть перенесен на непермиссивной температуры, чтобы обеспечить синхронное дезактивацию replisome и контролируемую предотвращение перезарядки. Эта температура индуцированной деактивация обеспечивает все вилами в популяции рухнули в данный момент времени и позволяет оценить то, что происходит, когда replisome рушится, как обрабатывается ДНК, и что требуется повторноначать процесс репликации ДНК.
Преимущество системы, описанной здесь, является то, что блок нуклеопротеид полностью обратимо; Таким образом, способность клеток восстанавливать из блока нуклеопротеидной способен следовать. Добавление anhydrotetracycline к клеткам разгрузит прочное связывание репрессора, что позволяет развилка репликации и пройти через клетку, чтобы восстановить жизнеспособность. Рельеф закупорки может быть визуализированы с помощью нейтрально-нейтрального двумерного электрофореза в агарозном геле после 5 мин, и с помощью микроскопии в течение 10 мин. Кроме того, анализ жизнеспособности может выявить способность штамма восстановиться после закупорки репликации и продолжают размножаться.
Путем изменения генетического фона штаммов, используемых в экспериментальной методике, описанной здесь, ремонт пути для этого типа закупорки может быть выяснена.
During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].
Tryptone | Sigma-Aldrich | 16922 | Growth media component |
Sodium Chloride | VWR | 27810.364 | Growth media component |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 92144 | Growth media component |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth media component; Potassium buffer component |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth media component; Potassium buffer component |
L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | For induction of TetR-YFP production |
Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | Release of replication bloackage |
Axioskop 2 Fluorescence microscope | Zeiss | 452310 | Visualization of cells |
eYFP filter set | Chroma Technology | 41028 | Visualization of YFP |
CCD camera | Hamamatsu | Orca-AG | Visualization of cells |
MetaMorph Software (Molecular Devices) | SDR Scientific | 31282 | Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript |
Agarose | Bioline | BIO-41025 | For agarose plugs and gel electrophoresis |
Original Glass Water Repellent (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | For agarose plug manufacture |
TRIS | VWR | VWRC103157P | TE, TBE buffer component |
Ethylene diaminetetraacetic acid | Ajax Finechem | AJA180 | 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH. |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Bacteriostatic agent |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | TE buffer component |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Cell lysis buffer component |
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L5125 | Cell lysis and ESP buffer component |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | Cell lysis buffer component |
Lysozyme | Amresco | 6300 | Cell lysis buffer component |
Proteinase K | Amresco | AM0706 | ESP buffer component |
Sub-Cell Model 192 Cell | BioRad | 1704507 | Electrophoresis system |
UV transilluminator 2000 | BioRad | 1708110 | Visualization of DNA |
Ethidium Bromide | BioRad | 1610433 | Visualization of DNA |
Boric acid | VWR | PROL20185.360 | TBE component |
Hybond-XL nylon memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used |
3MM Whatman chromatography paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | Southern blotting |
HL-2000 Hybrilinker | UVP | 95-0031-01/02 | Crosslinking of DNA and hybridization |
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm | Sigma-Aldrich | 31149 | Hybridization buffer component |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Denaturation buffer component |
Trisodium citrate dihydrate | VWR | PROL27833.363 | Transfer buffer |
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Amresco | 227 | Wash buffer component |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Hybridization buffer component |
Random Hexamer Primers | Bioline | BIO-38028 | |
Klenow fragment | New England BioLabs | M0212L | |
dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
Storage Phosphor Screen | GE Healthcare Life Sciences | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen |
Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Visualization of blot |
Hybridization bottle | UVP | 07-0194-02 | 35 x 300mm |