We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.
sıkıca bağlı proteinler çeşitli lezyonlar dahil olmak üzere, DNA üzerindeki engeller, ciddi hücre çoğaltma makine ilerlemesini inhibe edebilir. Bir replizom duraklaması çoğaltma çatal yıkılışına yol açan, kromozomdan, ya kısmen ya da bütünüyle onun ayrışma yol açabilir. Bu çöküşün kurtarma hücresine doğru tam kromozomal çoğaltılması ve daha sonra bölmek için bir zorunluluktur. çoğaltma DNA çatal geri yükleme ve izin gerçekleşecek çöküş meydana geldiğinde, bu nedenle, hücre gelişti çeşitli mekanizmalar yüksek sadakat ile tamamlanacak. Daha önce, bakterilerden bu çoğaltma onarım yolları bilinen siteye lokalize olmama dezavantajına sahiptir, UV hasarı, kullanılarak incelenmiştir. Bu yazıda durdurduklarını ve replikasyon çöküşü fo uyarabilir bir siteye özgü protein bloğu oluşturmak için bir Floresan Baskılayıcı Operatör Sistemi (FROS) kullanan bir sistemi açıklamaktadırEscherichia coli RKS. replikasyon durumu, flüoresans mikroskopisi ve DNA replikasyon ara maddeleri kullanarak tek bir canlı hücrelerde görselleştirilebilir PROTOKOLLERİN detay 2 boyutlu agaroz jel elektroforezi ile analiz edilebilir. Replizom bileşenleri (örneğin DnaBts) sıcaklığa duyarlı mutantlar çoğaltma çatal senkron çöküşü uyarılması için sisteme dahil edilebilir. Bundan başka, bu işlemlerde söz konusu rekombinasyon protein ve helikazlar rolleri bu sistem içinde, genetik Knockouts kullanılarak incelenebilir.
DNA replikasyonu sırasında, replizom ilerlemesini bozan DNA engellerle karşılaşır. DNA lezyonları ve boşluklar da dahil olmak üzere hasar yanı sıra anormal yapılar 1 geçmeden gelen replizom önleyebilir. Son zamanlarda, DNA bağlanmış proteinler Çatal ilerlemesini 2 çoğaltma engel en yaygın kaynağı olduğu bulunmuştur. Bir nükleoprotein bloğu ile replizom karşılaşmasını izleyen olayların bilgisi önceden bilinen bir yerde canlı bir hücrenin kromozomu böyle bir blok ikna etmek yetersizlik ile sınırlı kalmıştır. In vitro analizi kinetik davranışları anlayışımızı arttırmıştır bir nükleoprotein tıkanması 3, hem de replizom kendisinin 4,5 mekanistik ayrıntıları karşılayan etkin replizom arasında. Çoğaltma tamir mevcut anlayış genelde in vivo 6-8 plazmid DNA kullanılarak zararlı madde olarak UV ile yürütülen ve incelenmiştir </s> Yukarı. Bu genel olarak bu çalışmalardan anlaşıldığı edilebilir bir in vivo nükleoprotein blok karşılaştıktan sonra çoğaltma blok belirgin bir neden dolayı onarım yolları olan moleküler olaylar değişiklikler yine de orada olup, DNA onarımında yer alan proteinleri olabilir iken belirlenecektir.
Burada, bir nükleoprotein blok Floresan Baskılayıcı Operatör Sistemi (FROS) kullanarak kromozomun belirli bir konuma kurulacak sağlayan bir sistem açıklanmaktadır. Biz E. bir yük kullanmaktadır 9. kromozomun içine dahil 240 TETO siteleri bir dizi olmuştur coli. Dizisi içindeki her bir teto Alanı dizi içindeki RecA-aracılı rekombinasyon önleyerek dizinin kararlılığını arttırmak için çevreleyen bir 10 bp rastgele dizisine sahiptir. Bu dizi, ve bunun varyasyonları, orijinal olarak E. anlamak için kullanıldı E. coli kromozom dinamikleri 10,11 ama sonra Preve adapte edildint in vivo çoğaltma 12. Dizi stabil bir şekilde muhafaza edilmesi ve TetR 10,12 bağlı, çoğaltma çatal% 100'e yakın bloke bulunmuştur. 22 Yer replikasyon% 90 engellemek için yeterli olduğu gibi, bu daha kısa dizi in vivo 13 daha az etkili olmasına rağmen, in vitro içindeki lacO dizinin kullanımı, birkaç şekilde bulmuştur. Bir nükleoprotein tıkanma oluşturmak için diziyi uyarlamak için, bastırıcı protein yüksek o zaman bir barikat oluşturmak için dizinin bağlanır optimize koşullar altında aşırı üretilmektedir gerekir. Tet bastırıcısına bir floresan etiketli varyantı kullanıldığında bloke oluşumu, ve bunu takip eden serbest bırakma, floresan mikroskobu kullanılarak izlenebilir. Her hücrede replikasyon durumu tek bir odak noktası dizinin yalnızca bir kopyası hücre içinde mevcut olan ve birden fazla odak aktif replikasyon göstergesi olduğu anlamına gelir görülen odaklarının sayısı ile gösterilir. Bu aktif yenidennükleoprotein blokaj replizom dizi üzerinden devam etmek için yeterli bir operatörün bir site için TetR bağlanma afinitesini azaltan karşılıksız indükleyici ilave edilerek tersine döndüğünde komplikasyondur etkinleştirilir. represör proteini de dizinin hemen birden çok kopyası görselleştirilebilir yeterince yüksek bir afinite ile DNA'ya bağlanabilen.
Nukleoprotein tıkanma olayların daha karmaşık ayrıntıları nötr nötr iki boyutlu agaroz jel elektroforezi ve Güney melezleme 14-16 kullanılarak tespit edilebilir. Bu teknikler nüfusun genelinde DNA yapılarının analizini sağlar. potansiyel etkinlik sırasında biçimlenmiştir ve çoğaltma ara görüntülenebilir, unrepaired kalır. Restriksiyon enzimi ve sonda kullanılan değiştirilmesiyle, ara dizi bölgede değil çoğalma çatala 17,18 geriler, diziye de yukan sadece görselleştirilebilir.regresyon replizom ayrışma sonra gerçekleşir; lider ve geri kalmış doğmakta olan iplikçikler bir dört yollu DNA yapısına (bir Holliday kavşağı) sonuçlanan şablon ipliklerini aynı anda yeniden tavlama olarak birbirlerine şablon teller ve tavlama ayrı.
Bu blok 18 ile karşılaştığında, çoğalma çatala stabil değildir olduğu gösterilmiştir, bu sistemi kullanarak. Buna ek olarak, replizom bileşenleri ısıya duyarlı türevleri daraltılmış sonra çoğaltma çatalı yeniden önlemek için kullanılabilir. bir blok kurulduğunda, streyn replizom senkron devreden ve yeniden kontrollü bir engellenmesini sağlamak için bir non-permisif sıcaklığına kaydırılabilir. Bu sıcaklık kaynaklı devreden belirli bir zamanda çöktü nüfus içindeki çatallar tüm sağlar ve replizom DNA nasıl işlendiğini, çöker ve ne re gereklidir ne olur değerlendirilmesini sağlarDNA replikasyonu işlemini başlatmak.
Burada açıklanan sistemin bir avantajı, nükleoprotein blok tam olarak geri dönüşümlü olduğunu; Bu nedenle, nükleoprotein bloktan kurtarmak için hücrelerinin yeteneği takip edebilmektedir. hücrelere anhydrotetracycline eklenmesi çoğaltma çatal ile devam sağlayan, sıkı bastırıcı bağlanmasını rahatlatacak ve hücre canlılığı yeniden. tıkanma kabartma 5 dakika sonra nötr nötr iki boyutlu, agaroz jel elektroforezi ile görselleştirilmiştir ve 10 dakika içinde mikroskop ile olabilir. Ayrıca, canlılık analizi çoğaltma tıkanıklık kurtarmak ve çoğalırlar devam etmek zorlanma yeteneğini ortaya çıkarabilir.
Burada tarif edilen deney prosedürü kullanılan suşlar genetik arka planı değiştirerek, blokaj bu tip bakım yolları açıklanacaktır olabilir.
During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].
Tryptone | Sigma-Aldrich | 16922 | Growth media component |
Sodium Chloride | VWR | 27810.364 | Growth media component |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 92144 | Growth media component |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth media component; Potassium buffer component |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth media component; Potassium buffer component |
L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | For induction of TetR-YFP production |
Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | Release of replication bloackage |
Axioskop 2 Fluorescence microscope | Zeiss | 452310 | Visualization of cells |
eYFP filter set | Chroma Technology | 41028 | Visualization of YFP |
CCD camera | Hamamatsu | Orca-AG | Visualization of cells |
MetaMorph Software (Molecular Devices) | SDR Scientific | 31282 | Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript |
Agarose | Bioline | BIO-41025 | For agarose plugs and gel electrophoresis |
Original Glass Water Repellent (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | For agarose plug manufacture |
TRIS | VWR | VWRC103157P | TE, TBE buffer component |
Ethylene diaminetetraacetic acid | Ajax Finechem | AJA180 | 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH. |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Bacteriostatic agent |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | TE buffer component |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Cell lysis buffer component |
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L5125 | Cell lysis and ESP buffer component |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | Cell lysis buffer component |
Lysozyme | Amresco | 6300 | Cell lysis buffer component |
Proteinase K | Amresco | AM0706 | ESP buffer component |
Sub-Cell Model 192 Cell | BioRad | 1704507 | Electrophoresis system |
UV transilluminator 2000 | BioRad | 1708110 | Visualization of DNA |
Ethidium Bromide | BioRad | 1610433 | Visualization of DNA |
Boric acid | VWR | PROL20185.360 | TBE component |
Hybond-XL nylon memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used |
3MM Whatman chromatography paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | Southern blotting |
HL-2000 Hybrilinker | UVP | 95-0031-01/02 | Crosslinking of DNA and hybridization |
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm | Sigma-Aldrich | 31149 | Hybridization buffer component |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Denaturation buffer component |
Trisodium citrate dihydrate | VWR | PROL27833.363 | Transfer buffer |
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Amresco | 227 | Wash buffer component |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Hybridization buffer component |
Random Hexamer Primers | Bioline | BIO-38028 | |
Klenow fragment | New England BioLabs | M0212L | |
dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
Storage Phosphor Screen | GE Healthcare Life Sciences | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen |
Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Visualization of blot |
Hybridization bottle | UVP | 07-0194-02 | 35 x 300mm |