We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.
Hinder som förekommer på DNA, inklusive tätt bundna proteiner och olika skador, kan allvarligt hämma utvecklingen av cellens replikering maskiner. Stall av en replisome kan leda till dess dissociation från kromosomen, eller delvis sin helhet, vilket leder till en kollaps av replikationsgaffeln. Återhämtningen från denna kollaps är en nödvändighet för cellen att exakt fullständig kromosomdubbelarbete och därefter dela. Därför, när kollapsen inträffar har cellen utvecklats olika mekanismer som äger rum för att återställa DNA gaffel och tillåta replikering kompletteras med high fidelity. Tidigare har dessa replikeringsreparationsvägar i bakterier studerats med användning av UV-skada, vilket har nackdelen av att inte vara lokaliserad till en känd plats. Detta manuskript beskriver ett system som utnyttjar en Fluorescence repressor Operator System (FROS) för att skapa ett sätesspecifikt proteinblock som kan inducera stall och kollaps av replikering foRKS i Escherichia coli. Protokoll detalj hur status för replikering kan visualiseras i enstaka levande celler med användning av fluorescensmikroskopi och DNA-replikationsmellanprodukter kan analyseras med två-dimensionell elektrofores på agarosgel. Temperaturkänsliga mutanter av replisome komponenter (t.ex. DnaBts) kan införlivas i systemet för att inducera ett synkront kollaps av replikationsgafflar. Dessutom kan roller rekombinationsproteiner och helikaser som är inblandade i dessa processer studeras med hjälp av genetiska knockouts i detta system.
Under DNA-replikation, vänd mot replisome hinder på DNA som försämrar dess utveckling. DNA-skador, inklusive skador och brister samt avvikande strukturer kan hindra replisome från att fortsätta en. Nyligen har det visat sig att proteiner bundna till DNA är den vanligaste källan till hinder för replikationsgaffeln progression 2. Kunskapen om händelserna efter mötet i replisome med ett nukleoprotein block har tidigare begränsats av oförmågan att framkalla ett sådant block i kromosomen hos en levande cell på en känd plats. In vitro-analys har ökat vår förståelse av den kinetiska beteende av en aktiv replisome när den möter ett nukleoprotein blockering 3, liksom de mekanistiska detaljerna i replisome sig 4,5. Aktuell kunskap om reparation av replikering är i allmänhet genomförs med UV som skadliga medlet och studeras med hjälp av plasmid-DNA in vivo 6-8 </supp>. Medan de proteiner som kan vara inblandade i reparation av DNA efter den stöter på ett in vivo nukleoprotein blocket i allmänhet förstås från dessa studier, om det finns variationer i de molekylära händelser inom reparationsvägar på grund av den distinkta orsaken i replikeringsblocket fortfarande ännu att vara bestämd.
Här beskriver vi ett system som tillåter ett nukleoprotein block som skall etableras i ett visst läge av kromosomen med hjälp av en fluorescerande repressor Operator System (FROS). Vi använder en stam av E. coli som har haft en rad 240 Teto platser som ingår i kromosom 9. Varje tetO ställe inuti matrisen har en 10 bp slumpmässig sekvens som flankerar den för att öka stabiliteten hos arrayen genom att förhindra RecA-medierad rekombination inom arrayen. Denna grupp, och varianter av det, ursprungligen användas för att förstå E. coli-kromosomen dynamik 10,11 men sedan anpassas till Prevent in vivo replikation 12. Matrisen har visat sig vara stabilt upprätthållas och för att blockera nära 100% av replikationsgafflar när den är bunden av TetR 10,12. Användningen av liknande lacO array in vitro har funnit så få som 22 platser var tillräcklig för att blockera 90% av replikation, även om detta kortare array var mindre effektivt in vivo 13. Att anpassa uppsättningen för att skapa ett nukleoprotein blockering, måste repressor-proteinet i hög grad överproduceras under optimerade betingelser där den sedan binder till matrisen för att skapa en spärr. Bildandet av blockeringen, och dess efterföljande frisättning, kan övervakas genom användning av fluorescensmikroskopi om en fluorescensmärkta variant av Tet-repressor används. Statusen för replikation i varje cell indikeras av antalet foci sett, där en enda kontaktpunkt betyder bara en kopia av uppsättningen är närvarande i cellen och flera härdar indikerar aktiv replikation. Denna aktiva relämpning är aktiverad när nukleoproteinet blockering reverseras genom tillsats av omotiverade inducerare som minskar bindningsaffiniteten hos TetR för operatören platsen tillräckligt för replisome fortgå genom uppsättningen. Repressorproteinet är fortfarande i stånd att binda till DNA med tillräckligt hög affinitet att de nu flera kopior av matrisen kan visualiseras.
Mer intrikata detaljer om händelserna på nukleoprotein blockering kan upptäckas med hjälp av neutral-neutral tvådimensionell agarosgelelektrofores och Southern hybridisering 14-16. Dessa tekniker tillåter analys av DNA-strukturer över befolkningen. Replikerings intermediärer som bildas under evenemanget, och potentiellt förblir oreparerade kan visualiseras. Genom att variera restriktionsenzym och prob utnyttjas, kan mellanprodukterna visualiseras inte bara i arrayen regionen men även uppströms av arrayen när replikationsgaffeln regresses 17,18. Deregression sker efter det att replisome dissociation; de ledande och eftersläpande begynnande strängar separat från mallsträngarna och glödgning till varandra som mallsträngarna samtidigt åter glödga som resulterar i en fyrvägs DNA-strukturen (en Holliday korsning).
Med användning av detta system har det visats att den replikationsgaffeln inte är stabil när den stöter detta block 18. Dessutom kan temperaturkänsliga derivat av replisome komponenter utnyttjas för att förhindra omlastning av replikationsgaffeln när den har kollapsat. När ett block är etablerad, kan den stam förskjutas till en icke-permissiv temperatur för att säkerställa en synkron avaktivering av replisome och en reglerad förebyggande av omlastning. Denna temperatur-inducerad deaktivering garanterar alla gafflarna inom befolkningen har kollapsat vid en given tidpunkt och möjligt att bedöma vad som händer när replisome kollapsar, hur DNA bearbetas, och vad som krävs för att återstarta processen med DNA-replikation.
En fördel med systemet som beskrivs här är att nukleoprotein blocket är helt reversibel; Därför är förmågan hos cellerna att återhämta sig från nukleoproteinet blocket kunna följas. Tillsatsen av anhydrotetracyklin till cellerna kommer att lindra den snäva bindning av repressom, vilket gör att en replikationsgaffeln att gå igenom och cellen att återfå lönsamhet. Lindring av blockeringen kan visualiseras genom neutral-neutral två-dimensionell elektrofores på agarosgel efter 5 min och genom mikroskopi inom 10 min. Vidare kan livskraft analys avslöjar förmågan hos stammen att återhämta sig från replikerings blockering och fortsätter att proliferera.
Genom att ändra den genetiska bakgrunden till de stammar som användes i det experimentella förfarande som beskrivs här, kan de reparationsvägar för denna typ av blockering att belysas.
During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].
Tryptone | Sigma-Aldrich | 16922 | Growth media component |
Sodium Chloride | VWR | 27810.364 | Growth media component |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 92144 | Growth media component |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth media component; Potassium buffer component |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth media component; Potassium buffer component |
L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | For induction of TetR-YFP production |
Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | Release of replication bloackage |
Axioskop 2 Fluorescence microscope | Zeiss | 452310 | Visualization of cells |
eYFP filter set | Chroma Technology | 41028 | Visualization of YFP |
CCD camera | Hamamatsu | Orca-AG | Visualization of cells |
MetaMorph Software (Molecular Devices) | SDR Scientific | 31282 | Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript |
Agarose | Bioline | BIO-41025 | For agarose plugs and gel electrophoresis |
Original Glass Water Repellent (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | For agarose plug manufacture |
TRIS | VWR | VWRC103157P | TE, TBE buffer component |
Ethylene diaminetetraacetic acid | Ajax Finechem | AJA180 | 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH. |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Bacteriostatic agent |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | TE buffer component |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Cell lysis buffer component |
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L5125 | Cell lysis and ESP buffer component |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | Cell lysis buffer component |
Lysozyme | Amresco | 6300 | Cell lysis buffer component |
Proteinase K | Amresco | AM0706 | ESP buffer component |
Sub-Cell Model 192 Cell | BioRad | 1704507 | Electrophoresis system |
UV transilluminator 2000 | BioRad | 1708110 | Visualization of DNA |
Ethidium Bromide | BioRad | 1610433 | Visualization of DNA |
Boric acid | VWR | PROL20185.360 | TBE component |
Hybond-XL nylon memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used |
3MM Whatman chromatography paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | Southern blotting |
HL-2000 Hybrilinker | UVP | 95-0031-01/02 | Crosslinking of DNA and hybridization |
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm | Sigma-Aldrich | 31149 | Hybridization buffer component |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Denaturation buffer component |
Trisodium citrate dihydrate | VWR | PROL27833.363 | Transfer buffer |
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Amresco | 227 | Wash buffer component |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Hybridization buffer component |
Random Hexamer Primers | Bioline | BIO-38028 | |
Klenow fragment | New England BioLabs | M0212L | |
dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
Storage Phosphor Screen | GE Healthcare Life Sciences | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen |
Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Visualization of blot |
Hybridization bottle | UVP | 07-0194-02 | 35 x 300mm |