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Biology

诱导位点特异性复制遇阻 doi: 10.3791/54434 Published: August 21, 2016

Abstract

障碍物存在于DNA,包括紧密结合的蛋白质和各种病变,会严重抑制细胞的复制机制的进程。一个复制体的失速会导致其分解从染色体,部分或全部,从而导致复制叉的崩溃。从这个崩溃的恢复是细胞准确完整的染色体复制,随后将一个必需品。所发生还原的DNA的叉,并允许复制。因此,当合拢时,细胞已经发展多种机制以高的保真度来完成。先前,在细菌中这些复制修复途径已经使用紫外线的伤害,其具有不被局限于一个已知站点的缺点进行了研究。这份手稿描述了利用荧光阻遏操作员系统(FROS)创建一个特定站点蛋白块,能够引起失速和复制的崩溃FO系统RKS在大肠杆菌 。协议的细节如何复制的状态可在单个活细胞使用荧光显微镜和DNA复制中间体被可视化可以通过2维琼脂糖凝胶电泳进行分析。复制体部件( 例如 DnaBts)的温度敏感突变体可以被合并到系统以诱导复制叉的一个同步崩溃。此外,所涉及的这些过程的重组蛋白质和解旋酶的作用可以使用本系统内的遗传击倒进行研究。

Introduction

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在DNA复制,在复制体面临上影响其进程中的DNA的障碍。包括病变和差距DNA损伤以及异常的结构可以防止复制体从出发1。最近,人们已经发现,结合到DNA的蛋白是障碍的最常见的来源,以复制叉级数2。以下用核蛋白块的复制体的遭遇的事件的知识先前已受限于无法在已知位置来诱导在活细胞中的染色体这样的块, 在体外分析已经增强了我们的动力学行为的理解当它满足核蛋白堵塞3,以及复制体本身4,5的机械细节的活性复制体。复制的修复当前的理解通常与紫外线的损伤剂进行研究,并在体内 6-8使用质粒DNA 的体内核蛋白块通常从这些研究中理解后,是否有由于在复制块中的不同原因的修复途径中的分子事件的变化仍还蛋白待确定。

在这里,我们描述了一个系统,它允许在使用荧光阻遏算系统(FROS)的染色体的特定位置,以建立一个核蛋白块。我们利用大肠杆菌菌株已具有整合到染色体9 240 TETO位点的阵列的大肠杆菌 。阵列内的每个TETO站点有侧翼它通过防止在阵列内的RecA介导的重组,以增加阵列的稳定性有10 bp的随机序列。这个数组,它的变化,原本是用来理解E.大肠杆菌染色体动态10,11但随后适应preveNT 在体内的复制12。阵列已经发现稳定地保持并且当由四面体10,12结合到方框接近复制叉的100%。利用体外的类似LACO阵列已经发现少至22部位为足以阻挡90%的复制,尽管这更短的阵列是体内 13不太有效。为了适应阵列创建核蛋白堵塞,阻遏蛋白必须高度优化的条件下在那里再结合数组来创建一个路障下生产过剩。堵塞的形成,以及随后的释放,可以通过使用荧光显微镜如果使用四环素阻遏的荧光标记的变体进行监测。在每一个细胞复制的状态被看作灶的数字,其中一个焦点是指只有一个数组的副本是细胞内的存在,多灶指示复制活跃的指示。这再次活跃当核蛋白堵塞是通过添加减小四面体的操作员站点的结合亲和力充分的复制体通过阵列进行的无端诱导的逆转褶皱被启用。阻遏蛋白仍然能够结合具有足够高亲和力的DNA阵列的现在的多个拷贝可以被可视化。

在核蛋白堵塞的事件的更复杂的细节可以使用中性中性二维琼脂糖凝胶电泳和Southern杂交14-16被发现。这些技术使得DNA结构在人群的分析。那些在事件过程中形成的,并有可能在复制中间体保持未修理,可以显现。通过改变限制性内切酶和利用探头,中间体可不仅在阵列区域而且上游阵列的当复制叉退化17,18被可视化。该回归需要放置在复制体解离随后;前缘和滞后初生根丝从模板链和退火分离成彼此产生四通的DNA结构(霍利迪交界处)的模板链的同时重新退火。

使用该系统,已经表明,当它遇到该块18中的复制叉并不稳定。此外,可以利用复制体部件的温度敏感的衍生物,以防止一旦倒塌复制叉的再填装。一旦块被建立,该菌株可以转移到非许可温度下,以确保该复制体的同步失活和受控预防重装的。这种温度引起的失活可确保所有人口都折叠在给定时间内的拨叉,并允许当复制体倒塌,该DNA是如何处理的,和需要什么来重新发生什么评估启动DNA复制的过程。

这里描述的系统的一个优点是,核蛋白嵌段是完全可逆的;因此,该细胞的从核蛋白块中恢复的能力能够被遵循。加入无水四环素向细胞将缓解阻遏的紧密结合,使一个复制叉继续通过与细胞重新获得活力。堵塞的溢流可以通过中性中性二维琼脂糖凝胶电泳5分钟后进行可视化,并通过在10分钟内显微镜。此外,可行性分析可以揭示该菌株从复制堵塞恢复并继续增殖的能力。

通过改变在此处所述的实验过程中使用的菌株的遗传背景,对于这种类型的堵塞的修复途径可以阐明。

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Protocol

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1.阻止复制与FROS

  1. 诱导复制遇阻
    1. 稀释大肠的新鲜过夜培养(为0.17μmKH 2 PO 4,0.72 MK 2 HPO 4 0.1%胰蛋白胨,0.05%酵母提取物,0.1%氯化钠,)用抗生素如需要大肠杆菌菌株携带TETO阵列和PKM1 18至OD 600nm处 = 0.01在稀复合培养基供选择。
      注意:不要以供选择添加四环素,因为它不与本系统相兼容。使培养相当于每样至10毫升所需的体积。例如,对于图1中的实验设计的培养物体积为60毫升
    2. 在30℃生长,振摇直到OD 600纳米 = 0.05-0.1。除去10ml的样品作为未诱导对照和0.1%阿拉伯糖添加到剩余的培养以诱导从PKM1生产四面体-YFP的。继续增长这两个非诱导和诱导文化。 1小时后,检查用荧光显微镜的诱导培养的每个单元内的单个联络点的存在(见第2节)。
    3. 如果诱导细胞证实阻断(细胞的70%以上具有单焦点),记录OD 600nm的和通过2-D凝胶(见第3)取为分析7.5 ml样品。乘坐从非诱导控制文化的等效采样。
  2. 释放复制遇阻
    1. 要释放复制块,无偿诱导无水四环素(AT)的100纳克毫升-1添加到阻止细胞10毫升的样品。继续在30℃下生长10分钟,并取为细胞密度(1毫升)中,显微镜分析(10微升)和中性中性2维琼脂糖凝胶(7.5毫升)中的样品。
  3. 诱导复制体崩塌
    1. 如果细胞含有温度敏感性等位基因如dnaB TS或DNAC TS需要deactiva化,将含有受阻的细胞在烧瓶移动到42℃。取分析用试样在所需的时间点( 例如 ,孵育1小时后)。将细胞在42℃下已培养1小时后,将细胞转移到30℃下进行10分钟(参见图1)。
      注意:可以将细胞转移到30℃再启动分析。

图1
1: 在FROS复制Block和释放实验步骤概述 E.携带TETO阵列大肠杆菌菌株在30℃下生长。当细胞达到上述0.05的OD 600nm的 ,四面体-YFP生产被诱导与阿拉伯糖(ARA; 0.1%)。继续增长未诱导的细胞亚群作为在30℃的控制。 2小时(见2.1) - 诱导细胞的样本后,通过1荧光显微镜进行分析。如果复制确认来将挡,取样品用于通过试管(见3.1)表示的2-D凝胶分析和生存力试验(可选)。复制堵塞可以用无水四环素(AT; 0.1微克/毫升)被移除,细胞分析10分钟后。如果细胞携带温度敏感等位基因( dnaB TS),这可以通过阻止细胞转移到42℃,适当的分析灭活。 请点击此处查看该图的放大版本。

2.荧光显微镜

  1. 吹打500μl的熔融琼脂糖(在水中1%)到显微镜载玻片的制备琼脂糖垫;立即琼脂糖凝固之前覆盖盖玻片。直到需要在4℃下储存在湿纸巾的幻灯片(多个)。
  2. 当琼脂糖凝固,从琼脂糖垫和吸管除去盖玻片10微升的细菌培养到垫上的中心,以防止可视期间细胞的运动。一旦样品干燥(约23分钟),更换盖玻片。将浸油下降到盖玻片并放置在光学的幻灯片。
  3. 可视化使用相差显微镜放大100倍的细胞。
    1. 在成像软件中的采集对话框,设置曝光时间为100毫秒。通过选择采集捕捉图像。不要移动舞台。在Acquire对话框中,选择YFP作为关联到相机照明的外部快门。设置exporsure时间1000毫秒。关闭舞台灯光。通过选择采集捕捉荧光图像。
      注意:时间可以根据所用光源,显微镜和照相机而变化。
    2. 叠加相位和荧光图像,选择颜色从显示菜单中结合。在颜色组合对话框中,选择YFP图像作为绿色成分,并为BL相图像客户端组件。点击颜色相结合。确定是否人口已复制成功地阻止通过建立大部分细胞是否具有每单元一个焦点。
      注:在视觉上识别EYFP生产的差别比较,从不加阿拉伯糖对照样本是非常有用的。

3.提取DNA /琼脂糖插头

  1. 叠氮化钠(0.1%终浓度)从步骤1.1.3和1.2.1添加到7.5毫升培养样品。在冰上孵育至少5分钟。
    注:叠氮化钠是剧毒。咨询前,开始工作的安全数据表,直到所有安全防范措施已经阅读并理解不处理它。
  2. 离心细胞5000 xg离心10分钟以沉淀细胞。弃上清,重悬沉淀在200μlPETT四(PIV)缓冲液(10毫摩尔Tris:盐酸(pH值8.0),1M NaCl)中。微量(13,000×g离心2分钟)以沉淀细胞。迪SCARD上清液。在这个阶段,该方法粒料进一步或存储在-20℃。
  3. 重悬在50μl的PIV和地方的最低细胞密度将细胞在50℃。对于所有的其它样品,调整PIV的卷,以便最终细胞密度为每管相同的(再悬浮在50μl 样品1(OD 600nm处 = 0.128);样品2(OD 600nm处 = 0.138)再悬浮于54微升)。
    1. 添加新鲜制备的0.8%琼脂糖溶液在PIV等体积(终浓度为0.4%; 样品1 50微升,样品2 54微升)。确保样品,琼脂糖和PIV是50℃以上,以防止凝固。
  4. 治疗与40微升合适的玻璃的防水或硅酮溶液的显微镜载玻片。擦滑用纸巾,直到它是干的。
    注意:此可以预先完成并经处理的载玻片存放长期在室温下。
  5. 广场的T 20微升滴他在滑动细胞/琼脂糖悬浮液,以产生是半球形插头。
    注意:第一个样品(悬浮在50微升PIV)将产生一个幻灯片5个插头。
  6. 当插头都凝固,轻轻滑动他们入微量离心管中,并加入1 ml的细胞裂解缓冲液(10mM的Tris-HCl [pH为8],1 M氯化钠,100mM的乙二胺四乙酸(EDTA),0​​.2%脱氧胆酸钠,0.5% N-月桂酰肌氨酸钠盐(肌氨酸),100微克毫升- 1溶菌酶,50微克毫升- 1核糖核酸酶A)。孵育在37℃下2小时。
  7. 除去细胞裂解缓冲液,并添加1毫升的EDTA /十二烷基肌氨酸钠/蛋白酶K(ESP)溶液(0.5M EDTA,1%N-十二烷基肌氨酸钠盐(肌氨酸),1毫克毫升- 1蛋白酶K)。在50℃下孵育过夜,或直到插头是透明的。如果需要第二过夜温育后,经过约18小时替换用新鲜的缓冲了ESP溶液。
  8. 去除ESP缓冲液和用12ml的Tris-EDTA(TE)缓冲液(10mM的Tris-HCl,1mM EDTA中,pH值8.0)洗涤插头5次,允许30分钟的平衡与每个洗涤。在1毫升TE缓冲液保存在4℃。

4.中性中性的二维凝胶电泳

  1. 转移步骤3.8琼脂糖插头到一个新的离心管中,加入150微升限制性内切酶缓冲液(1×浓度)。加25-100单位限制酶( 例如 ,60个单位的EcoRV的;( 见图3A))。消化在37℃进行6-8小时。
  2. 在4℃,倒在1倍的Tris /硼酸盐/ EDTA(TBE)0.4%琼脂糖凝胶(300ml)中成约25×25厘米的凝胶托盘。插入梳子,使孔大致相同的宽度的插头的直径。当凝胶被设置时,取出梳子和移动凝胶至室温。
  3. 滑动消化琼脂糖塞中的一个入井中,定位插头的平整滑动靠在井其中t的侧他的DNA会进入凝胶。插入以相同的方式单个插头插入每一第二阱。
  4. 琼脂糖移液器熔化的0.4%到井封塞的位置。
  5. 负载1 kb的DNA梯在一个空孔,再次离开阶梯和样品之间的间隙,并在室温下过夜运行凝胶在1×TBE(16小时,55五)。
  6. 染色在含溴化乙锭(0.3微克毫升-1)20分钟的水浴的凝胶。
    注意:溴化乙锭被认为是一种有效的诱变剂和毒素。咨询前,开始工作的安全数据表,直到所有安全防范措施已经阅读并理解不处理它。
  7. 可视化用长波紫外透射的DNA和切出各车道片段与直链,甚至切,对车道两侧最小化过量琼脂糖列入。
    注意:例如,如果所关注的片段是5.5kb,切7.5厘米片段包括从5kb的DNA片段,以approximat伊利12 KB( 见图3A)。
  8. 放置在凝胶托盘切下的凝胶泳道在90℃对DNA的迁移方向。
    注:3凝胶碎片两排可以容纳在一个25×252 厘米凝胶托盘。凝胶泳道的第一行是在所述托盘中,第二行的12.5厘米顶部。
  9. 准备300毫升琼脂糖第二维凝胶(1X TBE缓冲液0.9%,0.3微克毫升-1溴化乙锭)。当琼脂糖冷却到50℃,吸取熔融琼脂糖围绕凝胶切片来巩固其位置。倒入剩余琼脂糖入盘的深度是与凝胶片至少水平。
  10. 一旦凝胶固化,在含有0.3微克毫升-1溴化乙锭在220伏1×TBE electrophorese在4℃,直至该DNA已迁移大约10厘米。
    注:4小时就足够了一个5.5kb的片段,但更小的片段将需要更少的时间。
  11. 其中,消费税的基因组DNA存在ù块唱金属尺的边缘,包括它上面的凝胶,以包括不可见( 见图3C)的DNA。

5. Southern杂交

  1. 溶液的制备
    1. 制备脱嘌呤缓冲液(0.125 M盐酸溶液)。
      注意:此缓冲器可被重新使用,并且在室温下长达1个月是稳定的。
    2. 制备变性缓冲液(1.5 M氯化钠,0.5M氢氧化钠)。
      注:变性缓冲可以一次被重新使用,并且是在室温下长达3个月稳定。
    3. 准备中和液(1.5M氯化钠,0.5M TRIS)。调节至pH7.5,用HCl。
      注意:中和缓冲区可以一次被重新使用,并且是在室温下长达3个月稳定。
    4. 制备10倍盐水柠檬酸钠(SSC)缓冲液(0.15M的柠檬酸三钠,1.5M氯化钠,pH值是7 - 8)在步骤5.2.4和5.2.6使用。从这个缓冲区,做一个2X SSC股票(在步骤5.2.9使用)。
      注:SSC 10倍和2倍SSC一重新稳定在RT 3个月。
    5. 制备改性Church和吉尔伯特杂交缓冲液19(0.5M磷酸盐缓冲液[pH为7.2],7%(重量/体积)十二烷基硫酸钠(SDS)的10mM EDTA)中。发表在65℃溶解使用前彻底。
  2. 转让
    1. 冲洗在脱嘌呤溶液切除凝胶块在RT上的摇杆或轨道振荡器10分钟。保持搅拌速度低,以避免损坏琼脂糖块。
    2. 简要地,用蒸馏水,然后冲洗凝胶块用变性缓冲液30分钟。简要地再次漂洗在蒸馏水中,然后孵育在中和缓冲液的凝胶块,在室温下温和搅拌30分钟。
    3. 切断的尼龙膜对凝胶(多个)的确切大小。剪了一个缺口的右上角,以协助在未来步骤的定向膜。
      注意:两个凝胶块(6个样品)可以在一个膜被可视化。
    4. 浇足10倍SSC成TR唉,以便它不会变干过夜。创建的缓冲区的水平大约5厘米以上的平台。用浸透10倍SSC和地方平台上的3MM色谱纸3张。切割色谱纸,使得它足够长两端被浸渍在缓冲​​液和足够宽,以适应在膜上的凝胶。
    5. 放置在饱和色谱纸的顶端的凝胶(多个)。帧用保鲜膜,以防止缓冲器绕过传送期间凝胶中的凝胶。小心地躺在凝胶(S)的顶部切膜。轻轻穿过膜滚动瓶或血清吸管除去膜和凝胶之间的气泡。
    6. 切3MM色谱纸的三片的大小相同的膜。饱和色谱纸张与10倍SSC和放置在膜的顶部。除去已经形成的任何气泡。
    7. 叠纸巾上吸墨水纸接着在固相载体的顶部高至少5厘米(Appro公司1公斤ximate重量为23×16cm的膜)。允许转让进行过夜。
    8. 露出膜(DNA面朝上)于UV 1200焦耳/ m 2的以交联的DNA到膜上。之前,这一步不要冲洗。
    9. 在2X SSC彻底冲洗膜以防止在该印迹图像高背景。立即使用印迹杂交(见5.3),或在室温下晾干,包装在塑料包装和储存在4℃。
  3. 杂交
    1. 预热杂交炉和瓶子到55℃。
    2. 加100微克毫升-1牛血清白蛋白(BSA)和10微克毫升-1非特异性DNA( 例如鲑鱼精子DNA)到预温热杂交缓冲液。
    3. 以允许甚至覆盖杂交缓冲液的当膜卷起时,印迹放置到尼龙的一个类似尺寸方朝上膜的DNA结合的侧啮合。卷沿其长边的印迹。滑动印迹/网杂交瓶子里。添加预热的杂交缓冲液适量展开印迹( 30毫升23×16 cm 2的膜)。
    4. 孵育在预加热的烘箱,旋转瓶,1小时。
    5. 通过混合50纳克纯化的PCR产物同源的感兴趣的区域,的随机六聚体引物150纳克制备探针,缓冲液Klenow片段和H 2 O以使13微升的体积。煮沸3分钟,然后立即放置到冰上。加入1微升1毫米的dCTP / dGTP / dTTP的组合,在Alpha磷酸盐(α32 P-的dATP)1微升Klenow片段(5U)和50微居里脱氧腺苷5'-三磷酸放射性标记的。
    6. 孵育在室温下进行1小时。加入1 mM的dNTP混合物1微升和1微升Klenow片段。孵育20分钟在室温。
    7. 煮沸探针5分钟,立即加入到杂交管中。在55°C杂交过夜,用旋转。
    8. 倒出PROBE由细胞膜。
      注意:探针能够被一次重复使用。
    9. 在预温,低严格洗涤缓冲液短暂地冲洗所述膜(2×SSC,0.1%(重量/体积)SDS)。添加新鲜低严格洗涤缓冲液并在55℃用旋转孵育5分钟。重复。
    10. 在中等严格洗涤缓冲液洗两次(1×SSC,0.1%(重量/体积)SDS)在55℃10分钟用转动。
    11. 在高严格洗涤缓冲液洗两次(0.1×SSC,0.1%(重量/体积)SDS)中在55℃5分钟用转动。
    12. 用纸巾除去膜和轻拍以除去过量的液体。裹保鲜膜,确保没有对保鲜膜,发生在暴露的磁带,可预先存储消隐荧光屏无残留的水分。关闭磁带和使用荧光体成像器可视化之前暴露至少2小时。

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Representative Results

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所述FROS是诱导型,特定于站点的核蛋白块,使复制中间体在活细胞12,18被可视化。在图1中所示的一般实验设计的用于进行采样的细胞。在遗传背景的采样和变化的定时使该用于研究这样的块的修复一个通用的系统。概略说明了如何对温度敏感的突变体,如dnaB TS和DNAC TS先前已18使用时,可以在该系统中使用。

该FROS的诱导物在大肠杆菌中进行如在图1中所示的大肠杆菌菌株 用于非温度敏感菌株。要确认核蛋白块已经建立,使用后的0.1%,阿拉伯糖增长1小时荧光显微镜可视化的细胞。这个时限通常是足够的,以产生该块中的野生型菌株,但更苛刻的菌株可能需要优化。大多数细胞含有1焦点( 图2A,+ ARA),对应于只有一个阵列的复制的细 ​​胞内,从而表明复制已被封锁。用1焦点,2灶或2个以上病灶细胞的数目在100多个细胞群进行计数。细胞的92%中发现有1焦点与2灶其余的8%。据推测,这有两个焦点间隔较开,表示该数组的两个副本的细胞,将有下一轮阻塞复制。具有两个焦点的细胞并拢表示该阵列最近被复制和核蛋白块尚未实现。

核蛋白块通过加入无水四环素(AT)与阵列的后续复制的可视化为反转具有多个病灶( 图2A,+ ARA / AT)的细胞的累积。利用荧光观察显微术表示数组的小区内多灶已被成功复制,并有足够的时间已经过去了,让座位移开,克服任何妹妹染色体的凝聚力,这是存在。在这种情况下,加入的AT的10分钟后,将细胞的94%有2个或更多焦点而每个单元最多8灶可视化。

以确保核蛋白块确实抑制复制,细胞活力分析( 图2B)。已经有由FROS抑制复制细胞显示在集落形成单位相比,没有在阿拉伯糖存在下生长的细胞的约1000倍的降低。这随后在此生长抑制的无水四环素显示反转的存在下生长的细胞。如果细胞不能修复后释放的DNA的核蛋白堵塞,在生存力的降低会导致。

为了显现复制中间体,细胞可以琼脂糖塞内被裂解,蛋白质和RNA除去。该DNA然后可以针对感兴趣的区域中的适当的限制酶消化。在 3A中描绘的DNA用EcoRV这立即切断该DNA阵列之前,在阵列内和阵列后,得到5.5 kb和6.7 kb的片段在感兴趣的区域( 图3B)中的消化。片段是理想〜3-7千对这里所描述的协议。在该范围之外的片段,可能需要使用的琼脂糖浓度和电泳条件的改变,以实现良好的分离。该DNA在第一维进行电泳和可视化( 图3A)。如果DNA完全消化,所有车道将有均匀运行,将有高量的低分子量(小于约3Kb,这取决于限制酶)。存在于井的DNA表明不完整细胞裂解和大量的高分子量的DNA(超过10 kb的)意味着不完整的DNA消化。

在每个泳道感兴趣的DNA切下。在图3A中 ,脱氧核糖核酸以上5kb的被列入。凝胶的随后的第二维进行电泳,产生了对角线线性DNA( 图3C)的。此凝胶中的阵列的DNA,然后通过Southern杂交( 图3D)可视化。在畅通( - ARA样品),两个点可以看出,对应于所述阵列的5.5 kb和6.7 ​​kb的片段,如预期。其中已复制阻断(+ ARA)的样品显示出在5.5kb的点相比的降低和增加的椭圆形的信号,指示Y形的DNA样品中的积累。该信号是定位于一个位置,标志着复制叉逮捕在整个人口有类似的地方。在加入anhydrotetracyline的,Y形的DNA信号不再能看到。最近重新启动是由整个Y型圆弧的信号的存在表明,描绘叉通过该区域迁移。

它给每个琼脂糖塞内归一的DNA,以确保样品的信号是偶数是重要的。的信号可以通过适当的图像处理软件来定量。看到另一种常见的中间是表示霍利迪路口(HJ)的形成。一个HJ被可视作为在Y弧顶圆锥信号和从线性DNA时,Y弧( 图3D)的端部的尖峰。

图2
图2: 荧光显微镜和VIAB ility。(A)E.大肠杆菌菌株携带TETO阵列在30℃在0.1%阿拉伯糖(+ ARA)1小时的存在下生长,然后无水四环素(AT)溶液中加入10分钟以一个亚群以释放复制块。代表性的显微照片显示了YFP生产(顶板)。比例尺= 2微米。携带1,2或2个以上病灶细胞的比例进行了列举和表示为一个百分比(下面板)。 (B)中的细胞在没有阿拉伯糖的生长( - ARA),与阿拉伯糖(+ ARA)和与两个阿拉伯糖和无水四环素(AT; 10分钟)分别连续稀释10倍,要么斑点或涂布到仅含有琼脂氨苄青霉素( - / + ARA样品)或无水四环素(+ AT样品氨苄青霉素)中,在30℃下生长,以确定细胞生存力。上图:代表显示板在指定稀释的增长。下图:显示平均CFU /毫升+/- SEM图。ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图3
3:从细胞在核蛋白块DNA复制中间体的可视化 (A)的基因组DNA(1, - ARA; 2 + ARA; 3,+ ARA / AT)中裂解的琼脂糖塞内且用EcoRV限制酶消化分出在0.4%琼脂糖凝胶(55伏,16小时)。 3 KB,5 kb和10 kb的乐队表示。由白框所示的5 kb的标记上方的DNA被切除。阵列区域的EcoRV消化的(B)的示意图。输入从原点阵列复制叉被堵塞的5.5kb的片段中,当细胞已在阿拉伯糖的存在下生长。限制性位点用于通过箭头和芳指示射线被示为与线的框。 (C)中切下的DNA旋转90度,并在0.8%琼脂糖凝胶(220伏,4小时)分离。白框表示分离后的DNA切除。 (D)的阵列区域随后通过使用放射性探针阵列区Southern印迹分析显现。与该位置上的复制块电池将具有相应位于Y型弧5.5 kb的片段的信号。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone Sigma-Aldrich 16922 Growth media component
Sodium Chloride VWR 27810.364 Growth media component
Yeast extract Sigma-Aldrich 92144 Growth media component
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 Growth media component; Potassium buffer component
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 Growth media component; Potassium buffer component
L-Arabinose Sigma-Aldrich A3256 For induction of TetR-YFP production
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919 Release of replication bloackage
Axioskop 2 Fluorescence microscope Zeiss 452310 Visualization of cells
eYFP filter set Chroma Technology 41028 Visualization of YFP
CCD camera Hamamatsu Orca-AG Visualization of cells
MetaMorph  Software (Molecular Devices) SDR Scientific 31282 Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript
Agarose Bioline BIO-41025 For agarose plugs and gel electrophoresis
Original Glass Water Repellent (Rain-X) Autobarn DIO1470 For agarose plug manufacture
TRIS VWR VWRC103157P TE, TBE buffer component
Ethylene diaminetetraacetic acid Ajax Finechem AJA180 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Bacteriostatic agent
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 TE buffer component
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 Cell lysis buffer component
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) Sigma-Aldrich L5125 Cell lysis and ESP buffer component
Rnase A Sigma-Aldrich R6513 Cell lysis buffer component
Lysozyme Amresco 6300 Cell lysis buffer component
Proteinase K Amresco AM0706 ESP buffer component
Sub-Cell Model 192 Cell BioRad 1704507 Electrophoresis system
UV transilluminator 2000 BioRad 1708110 Visualization of DNA
Ethidium Bromide BioRad 1610433 Visualization of DNA
Boric acid VWR PROL20185.360 TBE component
Hybond-XL nylon memrbane Amersham RPN203S Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used
3MM Whatman chromatography paper GE Healthcare Life Sciences 3030690 Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker UVP 95-0031-01/02 Crosslinking of DNA and hybridization
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm Sigma-Aldrich 31149 Hybridization buffer component
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Denaturation buffer component
Trisodium citrate dihydrate VWR PROL27833.363 Transfer buffer
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Amresco 227 Wash buffer component
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906 Hybridization buffer component
Random Hexamer Primers Bioline BIO-38028
Klenow fragment New England BioLabs M0212L
dNTP Set Bioline BIO-39025
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP PerkinElmer BLU502A
Storage Phosphor Screen GE Healthcare Life Sciences GEHE28-9564-76 BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Visualization of blot
Hybridization bottle UVP 07-0194-02 35 mm x 300 mm

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References

  1. Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71, (1), 13-35 (2007).
  2. Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (18), 7252-7257 (2013).
  3. McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381, (2), 249-255 (2008).
  4. Tanner, N. A., et al. Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 15, (2), 170-176 (2008).
  5. Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457, (7227), 336-339 (2009).
  6. Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli. Genes Dev. 21, (6), 668-681 (2007).
  7. Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli. Plasmid. 68, (2), 113-124 (2012).
  8. Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal. Mol Microbiol. 70, (2), 537-548 (2008).
  9. Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves. Genes Dev. 20, (13), 1727-1731 (2006).
  10. Lau, I. F., et al. Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes. Mol Microbiol. 49, (3), 731-743 (2003).
  11. Gordon, G. S., et al. Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms. Cell. 90, (6), 1113-1121 (1997).
  12. Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo. EMBO J. 25, (11), 2596-2604 (2006).
  13. Payne, B. T., et al. Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 34, (18), 5194-5202 (2006).
  14. Brewer, B. J., Fangman, W. L. The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae. Cell. 51, (3), 463-471 (1987).
  15. Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis. J Vis Exp. (46), (2010).
  16. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 98, (3), 503-517 (1975).
  17. Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli. Science. 299, (5609), 1064-1067 (2003).
  18. Mettrick, K. A., Grainge, I. Stability of blocked replication forks in vivo. Nucleic Acids Res. (2015).
  19. Church, G. M., Gilbert, W. Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, (7), 1991-1995 (1984).
  20. Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. Multiple pathways process stalled replication forks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (35), 12783-12788 (2004).
  21. Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair (Amst). 6, (7), 967-980 (2007).
  22. Carl, P. L. Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA. Mol Gen Genet. 109, (2), 107-122 (1970).
  23. Nawotka, K. A., Huberman, J. A. Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons. Mol Cell Biol. 8, (4), 1408-1413 (1988).
  24. Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control. J Mol Biol. 103, (1), 39-59 (1976).
诱导位点特异性复制遇阻<i&gt;电子。大肠杆菌</i&gt;用荧光阻遏操作员系统
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Mettrick, K. A., Lawrence, N., Mason, C., Weaver, G. M., Corocher, T. A., Grainge, I. Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System. J. Vis. Exp. (114), e54434, doi:10.3791/54434 (2016).More

Mettrick, K. A., Lawrence, N., Mason, C., Weaver, G. M., Corocher, T. A., Grainge, I. Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System. J. Vis. Exp. (114), e54434, doi:10.3791/54434 (2016).

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