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Biology

Induzierung einer Site Specific Replikation Verstopfungen in doi: 10.3791/54434 Published: August 21, 2016

Abstract

Hindernisse, die auf DNA, einschließlich fest gebundene Proteine ​​und verschiedene Läsionen, kann das Fortschreiten der Zelle Replikationsmaschinerie stark hemmen. Das Abwürgen eines replisome kann aus dem Chromosom zu seiner Dissoziation führen, entweder teilweise oder vollständig, um den Zusammenbruch der Replikationsgabel führt. Die Erholung von diesem Zusammenbruch ist eine Notwendigkeit für die Zelle genau vollständige Chromosomen Vervielfältigung und anschließend unterteilen. Daher wird, wenn der Zusammenbruch auftritt, hat die Zelle verschiedene Mechanismen entwickelt, die stattfinden, um die DNA Gabel und erlauben die Replikation wiederherzustellen mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden. Zuvor wurden diese Replikationsreparaturwege in Bakterien unter Verwendung von UV-Schäden untersucht, was den Nachteil hat, nicht auf einen bekannten Ort lokalisiert ist. Dieses Manuskript beschreibt ein System mit einem Fluoreszenz-Repressor Operator System (FROS) unter Verwendung eines ortsspezifischen Protein Block zu erstellen, die ein Abwürgen und Zusammenbruch der Replikation induzieren kann foRKS in Escherichia coli. Protokolle Detail, wie der Status der Replikation kann in einzelnen lebenden Zellen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und DNA-Replikationszwischenprodukte dargestellt werden kann durch 2-dimensionale Agarose-Gelelektrophorese analysiert werden. Temperaturempfindlichen Mutanten von replisome Komponenten (zB DnaBts) können in das System eingebaut werden , um einen synchronen Kollabieren der Replikationsgabeln zu induzieren. Ferner sind die Rollen der Rekombinationsproteine ​​und Helikasen, die an diesen Prozessen beteiligt sind, können unter Verwendung von genetischen Vorprägungen in diesem System untersucht werden.

Introduction

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Während der DNA-Replikation, steht die replisome Hindernisse auf der DNA, die ihr Fortschreiten beeinträchtigen. DNA - Schäden , einschließlich Läsionen und Lücken sowie anomale Strukturen können die replisome , fortzusetzen 1 zu verhindern. Vor kurzem wurde gefunden , dass an die DNA gebundenen Proteine ​​die häufigste Quelle für Hindernis sind 2 fork Progression Replikation. Das Wissen über die Ereignisse im Anschluss an die Begegnung der replisome mit einem Nukleoprotein Block an einem bekannten Ort durch die Unfähigkeit beschränkt zu induzieren einen solchen Block in das Chromosom einer lebenden Zelle vorher. In - vitro - Analyse unser Verständnis der kinetischen Verhalten wurde verbessert einer aktiven replisome , wenn es eine Verstopfung Nukleoprotein 3, sowie die mechanistischen Details der replisome selbst 4,5 erfüllt. Das aktuelle Verständnis der Reparatur der Replikation wird in der Regel mit UV als schädigende Mittel vorgenommen und untersucht in vivo unter Verwendung von Plasmid - DNA 6-8 in vivo - Nukleoprotein Block begegnet werden in der Regel aus diesen Studien verstanden, ob es Unterschiede in den molekularen Vorgänge innerhalb der Reparaturwege aufgrund der deutlichen Ursache in der Replikationsblock sind noch noch ist bestimmt werden.

Hier beschreiben wir ein System, das ein Nukleoprotein Block ermöglicht in einer bestimmten Stelle des Chromosoms hergestellt werden unter Verwendung eines Fluoreszenz-Repressor Operator System (FROS). Wir verwenden einen Stamm von E. coli , das ein Array von 240 tetO - Stellen in das Chromosom eingebaut 9 hatte. Jede tetO - Stelle innerhalb des Arrays hat eine 10 bp Zufallssequenz flankieren sie die Stabilität der Anordnung zu erhöhen durch RecA-vermittelte Rekombination innerhalb des Arrays zu verhindern. Dieses Array, und Variationen davon, wurden ursprünglich verwendet , um E. verstehen coli Chromosom Dynamik 10,11 aber wurden dann preve angepaßtnt in vivo - Replikation 12. Das Array wurde gefunden, stabil aufrechterhalten werden und nahezu 100% der Replikationsgabeln zu blockieren , wenn sie von TetR 10,12 gebunden. Die Verwendung des ähnlichen lacO Array in vitro hat , so wenig wie 22 gefunden Seiten ausreichend waren 90% der Replikation zu blockieren, obwohl dies kürzere Anordnung weniger effektiv war in vivo 13. Um das Array anzupassen eine Nukleoprotein Blockade zu schaffen, muss das Repressor-Protein hoch werden unter optimierten Bedingungen überproduzierte wo es dann an das Array bindet eine Straßensperre zu schaffen. Die Bildung der Blockade, und seine anschließende Freisetzung können durch die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie überwacht werden, wenn ein fluoreszierend markiert Variante des Tet-Repressor verwendet wird. Der Status der Replikation in jeder Zelle wird durch die Anzahl der Foci gesehen angedeutet, wo ein einzelner Brennpunkt bedeutet nur eine Kopie des Arrays innerhalb der Zelle vorhanden ist und mehrere Brennpunkte sind kennzeichnend für aktive Replikation. Diese aktive Wiederdung wird aktiviert, wenn das Nukleoprotein Blockierung durch die Zugabe des gratuitous Induktor umgekehrt wird, die die Bindungsaffinität von TetR für die Operatorstelle abnimmt ausreichend für die replisome durch das Array fortzufahren. Das Repressor-Protein ist noch in der Lage mit einer ausreichend hohen Affinität an die DNA zu binden, die nun mehrere Kopien der Array sichtbar gemacht werden kann.

Weitere komplizierten Details der Ereignisse können an der Nukleoprotein Blockade 14-16 mit neutral-neutral zweidimensionalen Agarose - Gelelektrophorese und Southern - Hybridisierung werden entdeckt. Diese Techniken erlauben die Analyse von DNA-Strukturen in der Bevölkerung. Die Replikationszwischenprodukte, die während des Ereignisses gebildet sind und bleiben potentiell unrepaired können visualisiert werden. Durch Variation der Restriktionsenzym und die Sonde verwendet wird , können die Zwischenprodukte dargestellt werden , nicht nur in dem Feldbereich , sondern auch stromaufwärts des Arrays , wenn der Replikationsgabel 17,18 zurückbildet. DasRegression nimmt an den replisome Dissoziation nachfolgenden platzieren; die führenden und hinken im Entstehen begriffenen Stränge getrennt von den Template-Stränge und Ausheilen miteinander, wie die Template-Stränge gleichzeitig erneut Glühen in einer DNA-Struktur Vier-Wege resultierende (a Holliday).

Unter Verwendung dieses Systems hat sich gezeigt , dass der Replikationsgabel nicht stabil ist , wenn es diesen Block 18 stößt. Darüber hinaus können Derivate von replisome Komponenten empfindlichen Temperatur Neuladen der Replikationsgabel zu verhindern, verwendet werden, wenn es zusammengebrochen ist. Sobald ein Block hergestellt wird, kann die Belastung auf eine nicht-permissive Temperatur verschoben werden, um ein synchrones Abschalten der replisome und eine kontrollierte Prävention Nachladen zu gewährleisten. Diese temperaturbedingten Deaktivierung gewährleistet alle der Gabeln in der Bevölkerung zu einer gegebenen Zeit zusammengebrochen sind und ermöglicht die Bewertung dessen, was geschieht, wenn der replisome kollabiert, wie die DNA verarbeitet wird, und dem, was erforderlich ist, um wiederden Prozess der DNA-Replikation starten.

Ein Vorteil der hier beschriebenen System ist, dass das Nukleoprotein Block vollständig reversibel ist; Daher wurde die Fähigkeit der Zellen aus dem Nukleoprotein Block wiederherzustellen der Lage ist, zu folgen. Die Zugabe von Anhydrotetrazyklin zu den Zellen wird die enge Bindung des Repressor entlasten, so dass eine Replikationsgabel zu gehen durch und die Lebensfähigkeit der Zellen wieder zu erlangen. Das Relief der Blockade kann durch neutrale neutralen zweidimensionalen Agarose-Gelelektrophorese nach 5 min, und durch Mikroskopie innerhalb von 10 min sichtbar gemacht werden. Darüber hinaus kann die Lebensfähigkeit Analyse die Fähigkeit des Stammes offenbaren aus der Replikations Blockade zu erholen und weiter zu vermehren.

Durch Veränderung des genetischen Hintergründe der in dem experimentellen Verfahren verwendeten Stämme hier beschrieben, können die Reparaturwege für diese Art von Blockierung erläutert.

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Protocol

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1. Sperrung Replikation mit FROS

  1. Induzierung der Replikation Verstopfungs
    1. Verdünnen Sie eine frische über Nacht Kultur eines E. coli Stamm , der ein tetO - Array und PKM1 18 bis OD 600 nm = 0,01 in einer verdünnten komplexen Medium (0,1% Trypton, 0,05% Hefeextrakt, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) mit Antibiotika Durchführung nach Bedarf zur Auswahl.
      Hinweis: Fügen Sie nicht Tetracyclin zur Auswahl, da es nicht mit diesem System kompatibel ist. Machen das Volumen der Kultur entsprechend 10 ml pro Probe erforderlich. Zum Beispiel ist das Kulturvolumen für die Versuchsplanung in 1 60 ml.
    2. Wachsen bei 30 ° C unter Schütteln , bis die OD 600 nm = 0,05-0,1. Entfernen Sie eine 10-ml-Probe als nicht-induzierten Kontrolle zu dienen und mit 0,1% Arabinose zu der verbleibenden Kultur die Produktion von TetR-YFP von PKM1 zu induzieren. Weiter wachsen sowohl die nicht-induzierten und veranlaßteKulturen. Nach 1 Stunde überprüfen auf das Vorhandensein eines einzigen Brennpunkt innerhalb jeder Zelle der induzierten Kultur unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie (siehe Abschnitt 2).
    3. Wenn die induzierten Zellen bestätigt blockiert sind (mehr als 70% der Zellen einen einzigen Fokus), notieren Sie die OD 600nm und nehmen Sie eine 7,5 ml Probe für die Analyse von 2-D - Gelen (siehe Abschnitt 3). Nehmen Sie eine äquivalente Probe von der nicht-induzierten Kontrollkultur.
  2. Durch Loslassen der Replikation Verstopfungs
    1. Zum Lösen der Replikation Block, 100 ng ml -1 des unentgeltlichen Induktor Anhydrotetrazyklin (AT) zu einer 10 - ml - Probe der blockierten Zellen. Weiterhin bei 30 ° C für 10 min zu wachsen und Proben für die Zelldichte (1 ml), Mikroskopie-Analyse (10 ul) und neutral neutral 2-dimensional Agarose-Gelen (7,5 ml).
  3. Induzierende Zusammenbruch der replisome
    1. Wenn die Zellen ein temperaturempfindliches Allel wie dnaB ts oder dnaC ts enthalten, erfordert deactivation, bewegen Sie den Kolben, die blockierten Zellen auf 42 ° C enthält. Proben für Analyse zu Zeitpunkten erforderlich (beispielsweise 1 Stunde nach Inkubation). Nachdem die Zellen bei 42 ° C für 1 Stunde inkubiert wurden, verschieben sich die Zellen auf 30 ° C für 10 min (siehe Abbildung 1).
      Anmerkung: Die Zellen können auf 30 ° C für restart Analyse verschoben werden.

Abbildung 1
Abb . 1: Übersicht über die FROS Replikation blockieren und Freigabe Experimentelles E. coli - Stämme , die tetO - Array tragen , werden bei 30 ° C gezüchtet. Wenn die Zellen eine OD 600nm von über 0,05 zu erreichen, wird TetR-YFP Produktion mit Arabinose induziert (ara; 0,1%). Weiter eine Subpopulation von nicht-induzierten Zellen wachsen zu lassen als Kontrollen bei 30 ° C zu handeln. 2 Stunden (siehe 2.1) - Eine Probe der induzierten Zellen wird nach 1 über Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Wenn die Replikation istbestätigt blockiert werden, werden die Proben für die Reagenzgläser angezeigt 2-D-Gel-Analyse entnommen (siehe 3.1) und für Vitalitätstests (optional). Die Replikations Blockade kann mit Anhydrotetracyclin entfernt werden (AT; 0,1 & mgr; g / ml) und die Zellen 10 min später analysiert. Wenn Zellen ein temperaturempfindliches Allel (zB dnaB ts) tragen, kann dies durch Verschieben der blockierten Zellen auf 42 ° C für eine angemessene Analyse inaktiviert werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Fluoreszenzmikroskopie

  1. Bereiten Sie eine Agarose-Pad durch Pipettieren von 500 ul geschmolzene Agarose (1% in Wasser) auf einen Objektträger; Overlay das Deckglas unmittelbar vor den Agarose verfestigt. Lagern Sie den Schieber (s) in feuchten Tüchern bei 4 ° C bis benötigt.
  2. Wenn die Agarose erstarrt ist, entfernen Sie das Deckglas aus dem Agarose-Pad und Pipette 10 ul BakterienKultur auf die Mitte des Kissens die Bewegung der Zellen während der Sichtbarmachung zu verhindern. Sobald die Probe (ca. 5 min) getrocknet ist, ersetzen Sie das Deckglas. Geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Deckglas und legen Sie die Folie unter der Optik.
  3. Visualisieren Sie die Zellen unter Verwendung von Phase-Mikroskopie bei 100facher Vergrößerung.
    1. Auf der Acquire Dialogfeld innerhalb der Imaging-Software, stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 ms. Nehmen Sie das Bild von Acquire auswählen. Sie nicht auf die Bühne zu bewegen. Im Dialogfenster Acquire, wählen Sie YFP als Beleuchtung für den Außen Shutter-Kamera verbunden ist. Stellen Sie die exporsure Zeit bis 1000 ms. Schalten Sie das Bühnenlicht. Nehmen Sie das Fluoreszenzbild von Acquire auswählen.
      Hinweis: Zeit kann je nach Lichtquelle, Mikroskop und verwendeten Kamera.
    2. Um die Phase und fluoreszierenden Bildern überlagern, wählen Sie Farbe aus dem Display-Menü zu kombinieren. Im Farb Kombinieren Dialogfeld wählen Sie das YFP Bild als grüne Komponente und dem Phasenbild als blue Komponente. Klicken Sie auf Farbe kombinieren. Bestimmen Sie, ob die Bevölkerung hatte die Replikation erfolgreich blockiert durch die Festlegung, ob die Mehrheit der Zellen pro Zelle ein Fokus haben.
      Anmerkung: Vergleich zu einer Probe von der Steuerung ohne Zusatz von Arabinose nützlich ist, um visuell den Unterschied in eYFP Produktion zu identifizieren.

3. DNA-Extraktion / Agarose-Stecker

  1. Hinzufügen Natriumazid (Endkonzentration von 0,1%) zu den 7,5 ml Kulturproben aus den Schritten 1.1.3 und 1.2.1. Inkubieren auf Eis für mindestens 5 min.
    Hinweis: Natriumazid extrem giftig ist. Lesen Sie die Sicherheitsdatenblatt vor Beginn der Arbeit und gehe es erst, wenn alle Sicherheitshinweise lesen und verstehen.
  2. Zentrifugieren Sie die Zellen 5000 × g für 10 min Zellen zu pelletieren. Überstand verwerfen und das Pellet in 200 ul Pett IV (PIV) -Puffer (10 mM Tris: HCl (pH 8,0), 1 M NaCl). Mikrozentrifuge (13 000 × g für 2 min) Zellen zu pelletieren. DiSCARD den Überstand. In diesem Stadium des Verfahrens die Pellets weiter oder bei -20 ° C.
  3. Resuspendieren der Zellen mit der niedrigsten Zelldichte in 50 ul PIV und bei 50 ° C. Bei allen anderen Proben, die Volumina der PIV einzustellen, die endgültige Zelldichte die gleiche in jedem Röhrchen (zB Probe 1 (OD 600nm = 0.128) in 50 & mgr; l resuspendiert, Probe 2 (OD 600 nm = 0,138) resuspendiert in 54 & mgr; l).
    1. Fügen Sie ein gleiches Volumen von frisch hergestellten 0,8% igen Lösung in PIV (Endkonzentration 0,4%; , z. B. Probe 1 50 ul Probe 2 54 ul). Stellen Sie sicher, dass die Proben, Agarose und PIV über 50 ° C sind Erstarrung zu verhindern.
  4. Behandeln eines Mikroskop-Objektträger mit 40 ul einer geeigneten Glas Wasser abweisend oder Silikonlösung. Reiben Sie die Folie mit einem Gewebe, bis es trocken ist.
    Hinweis: Dies kann im Voraus und die behandelten Folien gespeichert langfristig bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
  5. Legen Sie 20 ul Tropfen ter Zelle / Agarosesuspension auf der Folie Stecker zu produzieren, die halbkugeligen sind.
    Hinweis: Die erste Probe (resuspendiert in 50 & mgr; l PIV) 5 Stecker auf einer Folie erzeugt.
  6. Wenn die Pfropfen verfestigt haben, schieben sie sanft in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Zugabe von 1 ml Zell-Lyse-Puffer (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1 M NaCl, 100 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,2% Natriumdesoxycholat, 0,5% N-Lauroylsarcosin - Natriumsalz (Sarkosyl), 100 ug ml - 1 Lysozym, 50 ug ml - 1 RNase A). Inkubieren bei 37 ° C für 2 Stunden.
  7. Entfernen Sie die Zell - Lyse - Puffer und 1 ml EDTA / Sarkosyl / Proteinase K (ESP) -Lösung (0,5 M EDTA, 1% N-Lauroylsarcosin - Natriumsalz (Sarkosyl), 1 mg ml - 1 Proteinase K). bei 50 ° C inkubieren sind über Nacht oder bis die Stecker transparent. Wenn eine zweite Inkubation über Nacht erforderlich ist, ersetzen Sie die ESP-Lösung mit frischem Puffer nach etwa 18 Stunden.
  8. Entferne dasESP-Puffer und die Stecker 5 mal mit 12 ml Tris-EDTA (TE) -Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) waschen 30 min Äquilibrierung mit jeder Wäsche ermöglicht. Lagerung bei 4 ° C in 1 ml TE-Puffer.

4. Neutral-neutral 2-dimensionale Gelelektrophorese

  1. Übertragen Sie eine Agarose-Stecker aus Schritt 3.8 in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen und fügen 150 ul Restriktionsenzym-Puffer (1x Konzentration). 25-100 Einheiten Restriktionsenzym (beispielsweise 60 Einheiten EcoRV; (siehe 3A)). Digest bei 37 ° C für 6-8 Stunden.
  2. Bei 4 ° C, gießen Sie ein 0,4% Agarose-Gel (300 ml) in 1x Tris / Borat / EDTA (TBE) in einen Gelträger von ca. 25 x 25 cm. etwa die gleiche Breite wie der Durchmesser des Steckers Setzen Sie einen Kamm Brunnen zu machen. Wenn das Gel gesetzt ist, nehmen Sie den Kamm und das Gel auf Raumtemperatur bewegen.
  3. Schieben Sie eine der verdauten Agarose-Stecker in einen Brunnen, die Positionierung des Flachschiebers des Steckers gegen die Seite des Bohrlochs, wobei ter DNA wird in das Gel eintreten. Legen Sie einen einzelnen Stecker auf die gleiche Weise in jeder Sekunde gut.
  4. Pipettieren geschmolzene 0,4% Agarose in die Vertiefungen der Stecker in Position zu versiegeln.
  5. Last 1 kb DNA-Leiter in einem leeren gut, so dass wieder eine Lücke zwischen dem Leiter und Proben, und über Nacht laufen, das Gel (16 h, 55 V) in 1x TBE bei Raumtemperatur.
  6. Beflecken das Gel in einem Wasserbad enthaltend Ethidiumbromid (0,3 & mgr; g ml -1) für 20 min.
    Hinweis: Ethidiumbromid ein potenter mutagen und ein Toxin betrachtet wird. Lesen Sie die Sicherheitsdatenblatt vor Beginn der Arbeit und gehe es erst, wenn alle Sicherheitshinweise lesen und verstehen.
  7. Visualisieren Sie die DNA mit einem UV-Transilluminator langwellige und schneiden Sie jede Spur Fragment mit einer geraden, auch geschnitten, die Aufnahme von überschüssigem Agarose auf beiden Seiten der Bahn zu minimieren.
    Hinweis: Wenn beispielsweise das Fragment von Interesse 5,5 kb ist, geschnitten, um ein 7,5 cm-Fragment der DNA-Fragmente von 5 kb, umfassen approximately 12 kb (siehe 3A).
  8. Legen Sie die ausgeschnittenen Gel Spur in einem Gelträger 90 ° zur Richtung der DNA-Migration.
    Hinweis: Zwei Reihen von 3 Gelfragmenten in einem 25 x 25 cm 2 Geltablett passen. Die erste Reihe von Gelspuren ist an der Spitze der Schale, die zweite Reihe bei 12,5 cm.
  9. Bereiten Sie 300 ml Agarose für die zweite Dimension Gel (0,9% in 1x TBE mit 0,3 ug ml -1 Ethidiumbromid). Wenn der Agarose auf 50 ° C abgekühlt wird, das geschmolzene Agarose pipettieren um die Gelscheiben ihre Position zu verfestigen. Gießen Sie die restliche Agarose in die Schale bis zu einer Tiefe, die zumindest in Höhe der Gelschnitten ist.
  10. Sobald das Gel erstarrt ist, Elektrophorese bei 4 ° C in TBE 1x , enthaltend 0,3 & mgr; g ml -1 Ethidiumbromid bei 220 V , bis die DNA etwa 10 cm gewandert ist.
    Hinweis: 4 Stunden für ein 5,5-kb-Fragment ausreichend ist, aber ein kleineres Fragment wird weniger Zeit benötigen.
  11. Excise die Blöcke, wo die genomische DNA vorhanden ist usingen den Rand eines Metalllineal, einschließlich dem Gel darüber die DNA enthalten , die nicht sichtbar sind (siehe Abbildung 3c).

5. Southern-Hybridisierung

  1. Herstellung der Lösung
    1. Bereiten Sie Depurinierung Puffer (0,125 M HCl-Lösung).
      Anmerkung: Dieser Puffer wieder verwendet werden kann und ist stabil bei Raumtemperatur für bis zu 1 Monat.
    2. Bereiten Sie Denaturierungspuffer (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH).
      Anmerkung: Denaturierungspuffer wiederverwendet werden kann, sobald und stabil für bis zu 3 Monate bei Raumtemperatur.
    3. Bereiten Neutralisationspuffer (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris). Passen Sie auf pH 7,5 mit HCl.
      Anmerkung: Neutralisationspuffer einmal wiederverwendet werden kann und stabil für bis zu 3 Monate bei Raumtemperatur.
    4. Bereiten 10x Saline Sodium Citrate (SSC) Puffer (0,15 M Tri-Natriumcitrat, 1,5 M NaCl, pH-Wert 7 - 8) für die Verwendung in den Schritten 5.2.4 und 5.2.6. Von diesem Puffer, einen 2 × SSC Lager machen (für den Einsatz in Schritt 5.2.9).
      Hinweis: 10x SSC und 2x SSC einwieder stabil bei RT für 3 Monate.
    5. Bereiten Modifizierte Church und Gilbert Hybridisierungspuffer 19 (0,5 M Phosphatpuffer [pH 7,2], 7% (w / v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 10 mM EDTA). Lassen bei 65 ° C gründlich vor auflösen zu verwenden.
  2. Übertragung
    1. Spülen Sie die ausgeschnittenen Gelblöcken in Depurination Lösung für 10 min bei RT auf einer Wippe oder Orbitalschüttler. Halten Sie die Bewegungsgeschwindigkeit niedrig zu vermeiden, die Agarose-Blöcke zu beschädigen.
    2. Spülen Sie die Gelblöcken kurz mit destilliertem Wasser und dann mit einer Denaturierung Puffer für 30 min. Spülen Sie nochmals kurz in destilliertem Wasser und dann brüten die Gelblöcken in Neutralisierungspuffer für 30 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur.
    3. Schneiden Sie eine Nylonmembran auf die genaue Größe des Gels (s). Schneiden Sie ein Nick in der oberen rechten Ecke bei der Ausrichtung der Membran in Zukunft Schritte zu unterstützen.
      Anmerkung: Zwei Gelblöcke (6 Proben) auf eine Membran sichtbar gemacht werden.
    4. Gießen Sie genug 10x SSC in eine tray, so daß sie nicht über Nacht trocknen. Eine Plattform ca. 5 cm über dem Niveau des Puffers. Sättigen 3 Blatt 3 MM-Chromatographie-Papier mit 10x SSC und Platz auf der Plattform. Schneiden Sie die Chromatographie Papier so, dass es lang genug ist, an beiden Enden und breit genug, um in Puffer eingetaucht werden, um die Membran Gel zu passen.
    5. Legen Sie das Gel (n) auf der Oberseite des gesättigten Chromatographie-Papier. Rahmen Sie das Gel mit Plastikfolie den Puffer unter Umgehung des Gels während der Übertragung zu verhindern. Vorsichtig legen die Schnitt Membran auf der Oberseite des Gels (s). Entfernen Sie Luftblasen zwischen der Membran und Gel durch eine Flasche oder serologische Pipette vorsichtig über die Membran rollen.
    6. Schneiden drei Blatt 3MM Chromatographiepapier auf die gleiche Größe wie die Membran. Tränken Sie die Chromatographie Papierblätter mit 10x SSC und legen auf der Oberseite der Membran. Entfernen Sie alle Luftblasen, die sich gebildet haben.
    7. Stapel Papiertücher mindestens 5 cm hoch oben auf dem Löschpapier, gefolgt von einem festen Träger (approximate Gewicht von 1 kg für einen 23 x 16 cm-Membran). Lassen Sie den Transfer über Nacht ablaufen.
    8. Belichten der Membran (DNA Seite nach oben) zu 1,200 J / m 2 UV die DNA an der Membran zu vernetzen. Sie nicht zu diesem Schritt vor spülen.
    9. Spülen Sie die Membran gründlich in 2 × SSC zu hohen Hintergrund auf dem Blot Bilder verhindern. Verwenden Sie den Fleck sofort für die Hybridisierung (siehe 5.3) oder bei RT trocknen, wickeln Sie in der Plastikverpackung und lagern bei 4 ° C.
  3. Hybridisation
    1. Vorheiz Hybridisierungsofen und Flaschen auf 55 ° C.
    2. Füge 100 & mgr; g ml -1 Rinderserumalbumin (BSA) und 10 & mgr; g ml -1 unspezifische DNA (beispielsweise Lachssperma - DNA) mit dem vorgewärmten Hybridisierungspuffer.
    3. Um eine gleichmäßige Abdeckung des Hybridisierungspuffers ermöglichen, wenn die Membran aufgerollt wird, legen Sie den Fleck auf einen ähnlich großen Quadrat aus Nylon mit der DNA-gebundenen Seite der Membran Netz nach oben zeigt. Rollen Sie den Fleck entlang seiner langen Kante. Gleitender Blot / innen einer Hybridisierungsflasche ineinander greifen. Füge eine geeignete Menge vorgewärmten Hybridisierungspuffer des Blots (zB 30 ml für ein 23 x 16 cm 2 Membran) zu entrollen.
    4. Inkubieren in einem vorgeheizten Ofen, um die Flaschen zu drehen, für 1 Stunde.
    5. Bereiten Sie die Sonde durch 50 ng gereinigte PCR - Produkt homolog zu der Region von Interesse Mischen, 150 ng von zufälligen Hexamer - Primern, Puffer für Klenow - Fragment und H 2 O mit einem Volumen von 13 & mgr; l zu machen. Kochen für 3 Minuten dann sofort auf Eis legen. 1 ul 1 mM dCTP / dGTP / dTTP - Mix, 1 ul Klenow - Fragment (5U) und 50 uCi Desoxyadenosin - 5'-triphosphat radiomarkierten am alpha phosphat- (α 32 P-dATP).
    6. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. 1 ul 1 mM dNTP mischen und 1 ul Klenow-Fragment. Inkubiere 20 min bei RT.
    7. Boil-Sonde für 5 Minuten und fügen Sie sofort auf Hybridisierungsröhrchen. Hybridisierung über Nacht bei 55 ° C, mit einer Drehung.
    8. Umfüllen probe von Membran.
      Anmerkung: Die Sonde der Lage ist, einmal wiederverwendet zu werden.
    9. Spülen Sie die Membran kurz in vorgewärmten, niedriger Stringenz-Waschpuffer (2x SSC, 0,1% (w / v) SDS). In frischen niedriger Stringenz-Waschpuffer und Inkubation für 5 min bei 55 ° C mit Rotation. Wiederholen.
    10. Zweimal waschen in mittlerer Stringenz-Waschpuffer (1x SSC, 0,1% (w / v) SDS) für 10 min bei 55 ° C mit Rotation.
    11. Zweimal waschen in hoher Stringenz-Waschpuffer (0,1X SSC, 0,1% (w / v) SDS) für 5 min bei 55 ° C mit Rotation.
    12. Entfernen Sie die Membran und tupfen mit Gewebe überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Wickeln in Plastikfolie sicherzustellen gibt es keine verbleibende Feuchtigkeit auf der Plastikfolie und in Belichtungskassette mit einer vorgeblendeten Speicherleuchtstofffolie. Schließen Sie die Kassette und setzen mindestens 2 Stunden vor der Visualisierung für eine Phosphor-Imager verwendet wird.

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Representative Results

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Die FROS ein induzierbarer, ortsspezifische Nukleoprotein Block, der Replikationszwischenprodukte ermöglicht 12,18 in lebenden Zellen visualisiert werden. Eine allgemeine experimentelle Design für Zellen Abtasten ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Zeitpunkt der Probenahme und Variationen in der genetischen Hintergrund dieses machen ein vielseitiges System für die Reparatur eines solchen Blocks zu studieren. Die schematische veranschaulicht , wie temperaturempfindlichen Mutanten, wie dnaB ts und dnaC ts , die in diesem System bisher 18, verwendet werden kann , verwendet wurden.

Die Induktion der FROS wurde in einem E. durchgeführt coli - Stamm , wie in Figur 1 gezeigt für nicht-temperaturempfindliche Stämme. Um zu bestätigen, dass ein Nukleoprotein Block wurde bereits festgelegt wurden die Zellen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie nach 1 Stunde von Wachstum in 0,1% Arabinose sichtbar gemacht. DiesZeitraum ist in der Regel ausreichend, um den Block in einem Wildtyp-Stamm zu produzieren, aber anspruchsvoller Stämme können Optimierung erfordern. Die Mehrzahl der Zellen enthalten 1 Fokus (2A + ara), innerhalb der Zelle nur eine Kopie des Arrays entspricht , wodurch die Replikation anzeigt , blockiert worden waren. Die Zahl der Zellen mit 1 Fokus, 2 Herde oder mehr als 2 Foci wurden in einer Bevölkerung von mehr als 100 Zellen gezählt. 92% der Zellen wurden Fokus haben 1 mit dem restlichen 8% mit 2 Herde gefunden. Es wurde angenommen, dass Zellen, die zwei Brennpunkte weit voneinander beabstandet waren, die zwei Kopien des Arrays würden blockiert die nächste Runde der Replikation haben. Zellen, die mit zwei Brennpunkten bedeuten nahe beieinander, dass das Array vor kurzem repliziert wurde und das Nukleoprotein Block noch nicht erreicht hat.

Der Nukleoprotein Block wurde durch Zugabe von Anhydrotetracyclin (AT) und nachfolgende Vervielfältigung des Arrays wie die visualisierten umgekehrtAnreicherung von Zellen mit mehreren Brennpunkten (2A + ara / AT). Mehrere Brennpunkte innerhalb einer Zelle durch Fluoreszenz sichtbar gemacht Mikrokopie des Arrays bedeuten wurde erfolgreich repliziert und genügend Zeit vergangen ist die Orte zu ermöglichen auseinander zu bewegen, jede Schwester-Chromosom Zusammenhalt zu überwinden, die vorhanden war. In diesem Fall 10 Minuten nach der Zugabe von AT, 94% der Zellen wiesen zwei oder mehr Brennpunkte und bis zu 8 Foci pro Zelle sichtbar gemacht wurden.

Um sicherzustellen , dass das Nukleoprotein Block tatsächlich Replikation hemmte, wurde die Lebensfähigkeit der Zellen untersucht (Figur 2B). Zellen, die von den FROS inhibiert die Replikation hatten zeigen eine etwa 1000fache Abnahme der koloniebildenden Einheiten im Vergleich zu den Zellen bilden, die nicht in Gegenwart von Arabinose gezüchtet wurden. Zellen, die wurden anschließend in Gegenwart von Anhydrotetrazyklin zeigen Umkehrung dieses Wachstumshemmung gewachsen. Wenn die Zellen nicht in der Lage waren, die DNA nach der Freigabe zur Reparaturder Nukleoprotein Blockade würde eine Verringerung der Lebensfähigkeit.

Zur Visualisierung können die Replikationszwischenprodukte, Zellen in Agarose-Stopfen lysiert werden und das Protein und RNA entfernt. Die DNA kann dann mit einem geeigneten Restriktionsenzym für die interessierende Region verdaut werden. DNA dargestellt in 3A wurde mit EcoRV verdaut , die die DNA unmittelbar vor der Anordnung schneidet, innerhalb der Anordnung und nach dem Array 5,5 kb und 6,7 kb Fragmente in dem interessierenden Bereich (3B) zu ergeben. Die Fragmente sind ideal ~ 3-7 kb für das Protokoll hier beschrieben. Fragmente außerhalb dieses Bereichs können eine Veränderung der Agarose-Konzentrationen verwendet, und die Elektrophorese-Bedingungen erfordern eine gute Trennung zu erzielen. Die DNA wurde in der ersten Dimension und visualisiert (3A) elektrophoresiert. Wenn die DNA vollständig verdaut hat, haben alle Bahnen laufen gleichmäßig, und es wirdeine hohe Menge an niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 3 kb, auf dem Restriktionsenzym abhängig). DNA, die in der gut schlägt vor, unvollständige Zell-Lyse und eine Menge hochmolekulare DNA (über 10 kb) impliziert unvollständige DNA-Verdauung.

Die DNA von Interesse in jeder Spur herausgeschnitten wurde. In 3A wurde DNA über 5 kb enthalten. Die anschließende zweite Dimension des Gels wurde elektrophoresiert, was zu einer Diagonale von linearen DNA (3C). Die Array - DNA innerhalb dieses Gel wurde dann durch Southern - Hybridisierung (Figur 3D) sichtbar gemacht . In der unblockierten (- ara sample), zwei Flecken können entsprechend den 5,5 kb und 6,7 kb Fragmente der Anordnung zu sehen ist, werden, wie erwartet. Die Probe, die die Replikation (+ ara) blockiert waren, zeigten eine Abnahme der 5,5 kb Stelle im Vergleich und die Zugabe eines elliptischen Signal, eine Anhäufung von Y-förmigen DNA in der Probe anzeigt. Das Signal istlokalisiert auf eine Position, was bedeutet, die Replikationsgabeln in der Bevölkerung in einer ähnlichen Stelle verhaften. Bei Zugabe von anhydrotetracyline kann das Y-förmige DNA-Signal nicht mehr gesehen werden. Eine kürzlich Neustart wird durch das Vorhandensein eines Signals des gesamten Y-arc angegeben, darstellend die Gabeln durch die Region migrieren.

Es ist wichtig, die DNA innerhalb jedes Agarose Stecker zu normieren die Signale der Proben selbst zu gewährleisten. Die Signale können mit entsprechenden Imaging-Software quantifiziert werden. Ein weiteres gemeinsames Zwischen gesehen ist, dass anzeigt, Holliday (HJ) Bildung. A HJ als Kegel - Signal an der Oberseite des Y-Lichtbogens und einer Spitze von der linearen DNA am Ende des Y arc (Abbildung 3D) sichtbar gemacht .

Figur 2
Abbildung 2: Fluoreszenzmikroskopie und Viab ility. (A) Ein E. coli Stamm , der die tetO - Array trägt , wurde bei 30 ° C in Gegenwart von 0,1% Arabinose (+ ara) für 1 h gezüchtet und dann Anhydrotetracyclin (AT) wurde für 10 min auf eine Subpopulation hinzugefügt , um den Replikationsblock freizugeben. Repräsentative mikroskopische Aufnahmen sind für YFP Produktion (oben) gezeigt. Maßstabsbalken = 2 & mgr; m. Der Anteil der Zellen, die 1, 2 oder mehr als 2 Foci wurden aufgezählt und sind als Prozentsatz (unten) dargestellt. (B) Zellen in Abwesenheit von Arabinose gezüchtet (- ara) mit Arabinose (+ ara) und beide mit Arabinose und Anhydrotetracyclin (AT; 10 min) wurden seriell verdünntem 10fache und entweder spotted oder verteilt auf Agar Ampicillin nur die ( - / + ara Proben) oder Ampicillin mit Anhydrotetracyclin (+ aT Probe) und bei 30 ° C gezüchtet die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Oben: repräsentative Platte zum angegebenen Verdünnungen Wachstum zeigt. Unten: Diagramm, das die durchschnittliche KBE / ml +/- SEM zeigt.ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
. Abbildung 3: Visualisierung der DNA - Replikation Intermediates bei einem Nucleoprotein - Block (A) genomischer DNA aus Zellen (1, - ara, 2, + ara, 3, + ara / AT) , die in Agarose - Stecker und verdaut mit EcoRV Restriktionsenzym lysiert wurde auf einem 0,4% Agarosegel aufgetrennt (55 V, 16 h). 3 kb, 5 kb und 10 kb Banden sind angegeben. Die DNA über dem 5 kb Marker wurde durch die weißen Felder wie angegeben ausgeschnitten. (B) Schematische Darstellung des EcoRV Digest der Array - Region. Replikationsgabeln das Array vom Ursprung innerhalb des 5,5 kb-Fragments blockiert werden eintritt, wenn die Zellen in Gegenwart von Arabinose angebaut. Die Restriktionsstellen durch Pfeile angegeben genutzt und der array ist als Kasten mit Linien dargestellt. (C) Die ausgeschnittene DNA wurde um 90 ° gedreht und in einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt (220 V, 4 h). Das weiße Feld zeigt die Exzision der DNA nach der Trennung. (D) Der Anordnungsbereich wurde anschließend durch Southern - Blot - Analyse unter Verwendung einer radioaktiven Sonde mit dem Anordnungsbereich visualisiert. Zellen , die mit einem Replikationsblock an dieser Position wird das Signal entsprechend dem 5,5 - kb - Fragment auf der Y-Bogen gelegen haben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone Sigma-Aldrich 16922 Growth media component
Sodium Chloride VWR 27810.364 Growth media component
Yeast extract Sigma-Aldrich 92144 Growth media component
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 Growth media component; Potassium buffer component
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 Growth media component; Potassium buffer component
L-Arabinose Sigma-Aldrich A3256 For induction of TetR-YFP production
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919 Release of replication bloackage
Axioskop 2 Fluorescence microscope Zeiss 452310 Visualization of cells
eYFP filter set Chroma Technology 41028 Visualization of YFP
CCD camera Hamamatsu Orca-AG Visualization of cells
MetaMorph  Software (Molecular Devices) SDR Scientific 31282 Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript
Agarose Bioline BIO-41025 For agarose plugs and gel electrophoresis
Original Glass Water Repellent (Rain-X) Autobarn DIO1470 For agarose plug manufacture
TRIS VWR VWRC103157P TE, TBE buffer component
Ethylene diaminetetraacetic acid Ajax Finechem AJA180 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Bacteriostatic agent
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 TE buffer component
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 Cell lysis buffer component
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) Sigma-Aldrich L5125 Cell lysis and ESP buffer component
Rnase A Sigma-Aldrich R6513 Cell lysis buffer component
Lysozyme Amresco 6300 Cell lysis buffer component
Proteinase K Amresco AM0706 ESP buffer component
Sub-Cell Model 192 Cell BioRad 1704507 Electrophoresis system
UV transilluminator 2000 BioRad 1708110 Visualization of DNA
Ethidium Bromide BioRad 1610433 Visualization of DNA
Boric acid VWR PROL20185.360 TBE component
Hybond-XL nylon memrbane Amersham RPN203S Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used
3MM Whatman chromatography paper GE Healthcare Life Sciences 3030690 Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker UVP 95-0031-01/02 Crosslinking of DNA and hybridization
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm Sigma-Aldrich 31149 Hybridization buffer component
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Denaturation buffer component
Trisodium citrate dihydrate VWR PROL27833.363 Transfer buffer
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Amresco 227 Wash buffer component
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906 Hybridization buffer component
Random Hexamer Primers Bioline BIO-38028
Klenow fragment New England BioLabs M0212L
dNTP Set Bioline BIO-39025
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP PerkinElmer BLU502A
Storage Phosphor Screen GE Healthcare Life Sciences GEHE28-9564-76 BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Visualization of blot
Hybridization bottle UVP 07-0194-02 35 mm x 300 mm

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References

  1. Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71, (1), 13-35 (2007).
  2. Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (18), 7252-7257 (2013).
  3. McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381, (2), 249-255 (2008).
  4. Tanner, N. A., et al. Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 15, (2), 170-176 (2008).
  5. Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457, (7227), 336-339 (2009).
  6. Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli. Genes Dev. 21, (6), 668-681 (2007).
  7. Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli. Plasmid. 68, (2), 113-124 (2012).
  8. Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal. Mol Microbiol. 70, (2), 537-548 (2008).
  9. Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves. Genes Dev. 20, (13), 1727-1731 (2006).
  10. Lau, I. F., et al. Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes. Mol Microbiol. 49, (3), 731-743 (2003).
  11. Gordon, G. S., et al. Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms. Cell. 90, (6), 1113-1121 (1997).
  12. Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo. EMBO J. 25, (11), 2596-2604 (2006).
  13. Payne, B. T., et al. Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 34, (18), 5194-5202 (2006).
  14. Brewer, B. J., Fangman, W. L. The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae. Cell. 51, (3), 463-471 (1987).
  15. Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis. J Vis Exp. (46), (2010).
  16. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 98, (3), 503-517 (1975).
  17. Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli. Science. 299, (5609), 1064-1067 (2003).
  18. Mettrick, K. A., Grainge, I. Stability of blocked replication forks in vivo. Nucleic Acids Res. (2015).
  19. Church, G. M., Gilbert, W. Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, (7), 1991-1995 (1984).
  20. Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. Multiple pathways process stalled replication forks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (35), 12783-12788 (2004).
  21. Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair (Amst). 6, (7), 967-980 (2007).
  22. Carl, P. L. Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA. Mol Gen Genet. 109, (2), 107-122 (1970).
  23. Nawotka, K. A., Huberman, J. A. Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons. Mol Cell Biol. 8, (4), 1408-1413 (1988).
  24. Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control. J Mol Biol. 103, (1), 39-59 (1976).
Induzierung einer Site Specific Replikation Verstopfungen in<i&gt; E. coli</i&gt; Ein fluoreszierendes Repressor Operator System verwenden
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Mettrick, K. A., Lawrence, N., Mason, C., Weaver, G. M., Corocher, T. A., Grainge, I. Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System. J. Vis. Exp. (114), e54434, doi:10.3791/54434 (2016).More

Mettrick, K. A., Lawrence, N., Mason, C., Weaver, G. M., Corocher, T. A., Grainge, I. Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System. J. Vis. Exp. (114), e54434, doi:10.3791/54434 (2016).

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