Induzir um bloqueio de replicação de site específico no<i> E. coli</i> Usando um sistema fluorescente repressor de operador

Summary

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Abstract

Obstáculos presentes no DNA, incluindo proteínas firmemente ligados e várias lesões, pode inibir seriamente a progressão da maquinaria de replicação da célula. O retardamento de um replissoma pode levar a sua dissociação do cromossoma, em parte ou a sua totalidade, levando ao colapso do garfo de replicação. A recuperação a partir deste colapso é uma necessidade para que a célula completa com precisão a duplicação cromossómica e subsequentemente se dividem. diversos mecanismos Portanto, quando ocorre o colapso, a célula tem evoluído que tomam lugar para restabelecer a forquilha de ADN e permitir a replicação para ser preenchido com alta fidelidade. Anteriormente, estas vias de reparação de replicação em bactérias, foram estudados utilizando os danos UV, o que tem a desvantagem de não ser localizada a um local conhecido. Este manuscrito descreve um sistema que utiliza um sistema de fluorescência repressor Operator (FROS) para criar um bloco de proteína específica do local que podem induzir a estagnação e colapso da replicação forks em Escherichia coli. Protocolos detalhe como o estado de replicação podem ser visualizados em células vivas individuais usando microscopia de fluorescência e de replicação de ADN intermediários podem ser analisados ​​por electroforese em gel de agarose a 2-dimensional. Temperatura mutantes sensíveis de componentes réplisome (por exemplo DnaBts) pode ser incorporada no sistema para induzir um colapso síncrona dos garfos de replicação. Além disso, as funções das proteínas de recombinação e helicases que estão envolvidas nestes processos podem ser estudados utilizando knockouts genéticas dentro deste sistema.

Introduction

Durante a replicação do DNA, o replisome enfrenta obstáculos no DNA que prejudicar a sua progressão. Danos no ADN incluindo lesões e as lacunas assim como estruturas aberrantes pode impedir a replissoma de prosseguir ^1. Recentemente, verificou-se que as proteínas ligadas ao ADN são a fonte mais comum de impedimento à replicação progressão forquilha ^2. O conhecimento dos eventos após o encontro do replissoma com um bloco de nucleoproteína foi previamente limitada pela incapacidade de induzir uma tal bloco no cromossoma de uma célula viva no local conhecido. Análise in vitro aumentou a nossa compreensão do comportamento cinético de um replissoma activo quando se encontra com uma nucleoproteína bloqueio ^3, bem como os detalhes mecanísticos da própria replissoma ^4,5. Entendimento atual da reparação de replicação é geralmente realizada com UV como o agente prejudicial e estudada usando DNA plasmídeo in vivo ^6-8 </s-se>. Enquanto as proteínas que podem estar envolvidos na reparação do ADN após encontra um bloco de nucleoproteína in vivo são geralmente entendidos a partir destes estudos, se existem variações nos eventos moleculares no interior das vias de reparação devido à causa distinta no bloco de replicação é ainda contudo estar determinado.

Aqui, descrevemos um sistema que permite que um bloco de nucleoproteína a ser criada em um local específico do cromossoma utilizando um repressor Sistema Operador Fluorescente (FROS). Nós utilizamos uma cepa de E. coli, que teve uma matriz de 240 locais tetO incorporados no cromossoma ^9. Cada local tetO dentro da matriz tem uma sequência aleatória de 10 pb flanqueando-o a aumentar a estabilidade do conjunto, impedindo que a recombinação mediada por RecA-dentro da matriz. Esta matriz, e variações do mesmo, foram originalmente usado para entender E. coli dinâmica cromossómicas ^10,11 mas foram depois adaptadas para PreveNT replicação in vivo ^12. A matriz foi encontrado para ser mantida de forma estável e para bloquear perto de 100% de garfos de replicação quando ligado por TetR ^10,12. A utilização da matriz de lacO semelhante in vitro descobriu tão poucos como 22 locais foram suficientes para bloquear 90% da replicação, embora esta gama mais curto foi menos eficaz in vivo ^13. Para se adaptar a matriz para criar um bloqueio nucleoproteína, a proteína repressora deve ser altamente overproduced em condições otimizadas, onde então se liga à matriz para criar um obstáculo. A formação do bloqueio, e a sua subsequente libertação, pode ser controlada através da utilização de microscopia de fluorescência, se uma variante fluorescente etiquetado do repressor Tet é usado. O estado de replicação em cada célula está indicado pelo número de focos visto, em que um único ponto focal significa apenas uma cópia da matriz está presente no interior da célula e múltiplos focos são indicativos de replicação activa. Esta re ativaplicação é activado quando o bloqueio nucleoproteína é revertida pela adição do indutor gratuito que diminui a afinidade de ligação para o local de TetR operador suficientemente para replissoma para prosseguir através da matriz. A proteína repressora é ainda capaz de se ligar ao ADN com uma afinidade suficientemente alta que os agora múltiplas cópias da matriz pode ser visualizado.

Detalhes mais intrincados dos eventos no bloqueio nucleoproteína pode ser descoberto usando eletroforese em gel neutro neutro bidimensional agarose e hibridação Southern ^14-16. Estas técnicas permitem a análise das estruturas de ADN através da população. Os intermediários de replicação que são formados durante o evento, e potencialmente permanecer não reparado, pode ser visualizada. Através da variação da enzima de restrição e da sonda utilizada, os intermediários podem ser visualizados não só na região da matriz, mas também a montante da matriz, quando o garfo de replicação regride ^17,18. oregressão tenham ocorrido depois da dissociação replisome; os fios de condução e de retardamento nascentes separar a partir das cadeias molde e emparelham com uns aos outros como os cordões de modelo simultaneamente re-recozimento que resulta em uma estrutura de ADN de quatro vias (uma junção Holliday).

Utilizando este sistema, foi demonstrado que o garfo de replicação não é estável quando se encontra presente ¹⁸ bloco. Além disso, os derivados de componentes sensíveis à temperatura réplisome pode ser utilizada para impedir a recarga do garfo de replicação, uma vez que entrou em colapso. Uma vez que um bloco é estabelecida, a tensão pode ser deslocada para uma temperatura não permissiva para assegurar uma desactivação síncrona do replissoma e uma prevenção controlada de recarga. Esta desativação induzida pela temperatura garante todos os garfos dentro da população entraram em colapso em um determinado momento e permite a avaliação do que acontece quando o replisome entra em colapso, como o DNA é processado, eo que é necessário para reiniciar o processo de replicação do ADN.

Uma vantagem do sistema descrito aqui é que o bloco de nucleoproteína é totalmente reversível; portanto, a capacidade das células para se recuperar a partir do bloco nucleoproteína é capaz de ser seguido. A adição de anidrotetraciclina para as células irão aliviar a forte ligação do repressor, permitindo um garfo de replicação para prosseguir através da célula e para o restabelecimento da viabilidade. O relevo do bloqueio pode ser visualizada por electroforese em gel de agarose bidimensional neutro neutro depois de 5 min, e por microscopia dentro de 10 min. Além disso, a análise de viabilidade pode revelar a capacidade da estirpe para se recuperar a partir do bloqueio da replicação e continuam a proliferar.

Ao alterar o fundo genético das estirpes utilizadas no procedimento experimental descrito aqui, as vias de reparação para este tipo de bloqueio pode ser elucidado.

Protocol

1. Bloqueio de replicação com FROS Induzindo a replicação de bloqueio Dilui-se uma cultura durante a noite fresca de uma E. coli estirpe transportando uma matriz tetO e pKM1 18 a OD 600nm = 0,01 em um meio complexo diluído (0,1% de triptona, 0,05% de extracto de levedura, 0,1% de NaCl, 0,17 M de KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4), com antibióticos conforme requerido para selecção. Nota: Não adicion…

Representative Results

O FROS é um bloco de nucleoproteína induzível, específica do local que permite intermediários de replicação para ser visualizado em células vivas 12,18. Um projeto experimental geral para células de amostragem é ilustrada na Figura 1. O momento da amostragem e variações no fundo genético tornar este um sistema versátil para estudar o reparo de um tal bloco. O esquema ilustra como mutantes sensíveis à temperatura, tais como TS e TS dnaB…

Discussion

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded^20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo…

Materials

Tryptone	Sigma-Aldrich	16922	Growth media component
Sodium Chloride	VWR	27810.364	Growth media component
Yeast extract	Sigma-Aldrich	92144	Growth media component
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Growth media component; Potassium buffer component
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786	Growth media component; Potassium buffer component
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	For induction of TetR-YFP production
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919	Release of replication bloackage
Axioskop 2 Fluorescence microscope	Zeiss	452310	Visualization of cells
eYFP filter set	Chroma Technology	41028	Visualization of YFP
CCD camera	Hamamatsu	Orca-AG	Visualization of cells
MetaMorph  Software (Molecular Devices)	SDR Scientific	31282	Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript
Agarose	Bioline	BIO-41025	For agarose plugs and gel electrophoresis
Original Glass Water Repellent (Rain-X)	Autobarn	DIO1470	For agarose plug manufacture
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE, TBE buffer component
Ethylene diaminetetraacetic acid	Ajax Finechem	AJA180	0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Bacteriostatic agent
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148	TE buffer component
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Cell lysis buffer component
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)	Sigma-Aldrich	L5125	Cell lysis and ESP buffer component
Rnase A	Sigma-Aldrich	R6513	Cell lysis buffer component
Lysozyme	Amresco	6300	Cell lysis buffer component
Proteinase K	Amresco	AM0706	ESP buffer component
Sub-Cell Model 192 Cell	BioRad	1704507	Electrophoresis system
UV transilluminator 2000	BioRad	1708110	Visualization of DNA
Ethidium Bromide	BioRad	1610433	Visualization of DNA
Boric acid	VWR	PROL20185.360	TBE component
Hybond-XL nylon memrbane	Amersham	RPN203S	Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used
3MM Whatman chromatography paper	GE Healthcare Life Sciences	3030690	Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	Crosslinking of DNA and hybridization
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm	Sigma-Aldrich	31149	Hybridization buffer component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	Denaturation buffer component
Trisodium citrate dihydrate	VWR	PROL27833.363	Transfer buffer
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Amresco	227	Wash buffer component
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	Hybridization buffer component
Random Hexamer Primers	Bioline	BIO-38028
Klenow fragment	New England BioLabs	M0212L
dNTP Set	Bioline	BIO-39025
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP	PerkinElmer	BLU502A
Storage Phosphor Screen	GE Healthcare Life Sciences	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Visualization of blot
Hybridization bottle	UVP	07-0194-02	35 x 300mm