We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.
Los obstáculos presentes en el ADN, incluyendo proteínas unidas herméticamente y varias lesiones, pueden inhibir seriamente la progresión de la maquinaria de replicación de la célula. El estancamiento de un replisome puede conducir a su disociación de los cromosomas, ya sea en parte o en su totalidad, lo que lleva al colapso del tenedor de replicación. La recuperación de este colapso es una necesidad para que la célula con precisión completa la duplicación cromosómica y, posteriormente, dividir. diversos mecanismos, por lo tanto, cuando se produce el colapso, la célula ha evolucionado que se realizan para restaurar el tenedor de replicación del ADN y permitir que se completen con alta fidelidad. Anteriormente, estas vías de reparación de replicación en bacterias se han estudiado utilizando los rayos UV, que tiene la desventaja de no ser localizado en un sitio conocido. Este manuscrito describe un sistema que utiliza un sistema de fluorescencia represor de operador (FROS) para crear un bloque de proteína específica de sitio que puede inducir el estancamiento y el colapso de la replicación foRKS en Escherichia coli. Protocolos detalle cómo el estado de la replicación se puede visualizar en las células vivas individuales mediante microscopía de fluorescencia y la replicación del ADN intermedios pueden ser analizados por electroforesis en gel de agarosa al 2-dimensional. Mutantes sensibles a la temperatura de los componentes replisome (por ejemplo DnaBts) se pueden incorporar en el sistema para inducir un colapso síncrono de las horquillas de replicación. Por otra parte, las funciones de las proteínas de recombinación y helicasas que están implicados en estos procesos pueden ser estudiados utilizando knockouts genéticos dentro de este sistema.
Durante la replicación del ADN, la replisome se enfrenta a obstáculos en el ADN que deterioran su progresión. Daño del ADN incluyendo lesiones y vacíos, así como estructuras aberrantes pueden prevenir la replisome de proceder 1. Recientemente, se ha encontrado que las proteínas unidas al ADN son la fuente más común de impedimento a la replicación progresión tenedor 2. El conocimiento de los eventos siguientes el encuentro de la replisome con un bloque de nucleoproteína previamente ha sido limitado por la incapacidad para inducir un bloque de este tipo en el cromosoma de una célula viva en una ubicación conocida. El análisis in vitro ha mejorado nuestra comprensión del comportamiento cinético de un replisome activa cuando se encuentra con una obstrucción nucleoproteína 3, así como los detalles mecanicistas de la propia 4,5 replisome. El conocimiento actual de la reparación de la replicación se realiza generalmente con UV como agente dañino y estudió el uso de ADN plásmido in vivo 6-8 </sarriba>. Mientras que las proteínas que pueden estar implicados en la reparación del ADN después de que se encuentra un bloque de nucleoproteína in vivo son generalmente comprendidas a partir de estos estudios, si hay variaciones en los eventos moleculares dentro de las vías de reparación debido a la causa distinta en el bloque de la replicación sigue siendo todavía estar determinado.
A continuación, describimos un sistema que permite a un bloque de nucleoproteína que se establecerá en una ubicación específica del cromosoma usando un sistema de operador represor fluorescente (FROS). Utilizamos una cepa de E. coli que ha tenido una serie de 240 sitios teto incorporados en el cromosoma 9. Cada sitio tetO dentro de la matriz tiene una secuencia aleatoria de 10 pb que lo flanquean para aumentar la estabilidad de la matriz mediante la prevención de la recombinación mediada por RecA dentro de la matriz. Esta matriz, y variaciones de la misma, se utilizaron originalmente para entender E. coli dinámica de los cromosomas 10,11, pero luego fueron adaptados a prevent replicación in vivo 12. La matriz se ha encontrado que se mantiene de manera estable y para bloquear cerca de 100% de las horquillas de replicación cuando se une por TetR 10,12. El uso de la matriz Laco similares in vitro ha encontrado tan pocos como 22 sitios eran suficientes para bloquear el 90% de la replicación, aunque esta matriz más corto fue menos eficaz in vivo 13. Para adaptar la matriz para crear un bloqueo nucleoproteína, la proteína represora debe ser altamente producida en exceso en condiciones optimizadas donde se une a la matriz para crear un control de carretera. La formación de la obstrucción, y su posterior liberación, pueden ser controlados mediante el uso de microscopía de fluorescencia si se utiliza una variante marcado con fluorescencia del represor Tet. El estado de la replicación en cada celda se indica mediante el número de focos visto, donde un único punto focal significa sólo una copia de la matriz está presente dentro de la célula y múltiples focos son indicativos de replicación activa. Esta re activaplicatura está habilitada cuando el bloqueo nucleoproteína se invierte por la adición del inductor gratuito que disminuye la afinidad de unión de TetR para el sitio operador suficientemente para que el replisome para proceder a través de la matriz. La proteína represora es todavía capaz de unirse al ADN con afinidad suficientemente alta para que los ahora múltiples copias de la matriz pueden ser visualizados.
Más detalles intrincados de los eventos en el bloqueo de la nucleoproteína se pueden descubrir mediante electroforesis en gel neutro neutro de dos dimensiones de agarosa y la hibridación de Southern 14-16. Estas técnicas permiten el análisis de estructuras de ADN en toda la población. Los intermediarios de replicación que se forman durante el evento, y potencialmente permanecen sin reparar, puede ser visualizado. Mediante la variación de la enzima de restricción y la sonda se utilizan, los intermedios se pueden visualizar no sólo en la región de matriz, pero también aguas arriba de la matriz cuando el tenedor de replicación retrocede 17,18. losregresión se hayan producido después de la disociación replisome; los principales y menos hebras nacientes separan de las cadenas de molde y recocido entre sí como las cadenas de molde simultáneamente re-recocido resulta en una estructura de ADN de cuatro direcciones (una unión de Holliday).
El uso de este sistema se ha demostrado que el tenedor de replicación no es estable cuando se encuentra con este bloque 18. Además, los derivados sensibles a la temperatura de los componentes replisome se pueden utilizar para evitar la recarga de la tenedor de replicación una vez que se ha colapsado. Una vez que se estableció un bloque, la cepa se puede desplazar a una temperatura no permisiva para asegurar una desactivación síncrona del replisome y una prevención controlada de recarga. Esta desactivación inducida por la temperatura asegura todas las horquillas dentro de la población se han derrumbado en un momento dado y permite la evaluación de lo que sucede cuando el replisome colapsa, cómo se procesa el ADN, y lo que se requiere para volveriniciar el proceso de replicación del ADN.
Una ventaja del sistema descrito aquí es que el bloque de nucleoproteína es completamente reversible; Por lo tanto, la capacidad de las células para recuperarse de la nucleoproteína bloque es capaz de seguir. La adición de anhidrotetraciclina a las células aliviará la estrecha unión del represor, permitiendo que un tenedor de replicación para proceder a través de la célula y para recuperar la viabilidad. El alivio de la obstrucción se puede visualizar por electroforesis en gel de agarosa de dos dimensiones neutral-neutral después de 5 min, y por microscopía dentro de 10 min. Además, el análisis de viabilidad puede revelar la capacidad de la cepa para recuperarse de la obstrucción replicación y continuar proliferando.
Al alterar el fondo genético de las cepas utilizadas en el procedimiento experimental descrito aquí, las vías de reparación de este tipo de obstrucción puede ser dilucidado.
During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].
Tryptone | Sigma-Aldrich | 16922 | Growth media component |
Sodium Chloride | VWR | 27810.364 | Growth media component |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 92144 | Growth media component |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth media component; Potassium buffer component |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth media component; Potassium buffer component |
L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | For induction of TetR-YFP production |
Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | Release of replication bloackage |
Axioskop 2 Fluorescence microscope | Zeiss | 452310 | Visualization of cells |
eYFP filter set | Chroma Technology | 41028 | Visualization of YFP |
CCD camera | Hamamatsu | Orca-AG | Visualization of cells |
MetaMorph Software (Molecular Devices) | SDR Scientific | 31282 | Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript |
Agarose | Bioline | BIO-41025 | For agarose plugs and gel electrophoresis |
Original Glass Water Repellent (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | For agarose plug manufacture |
TRIS | VWR | VWRC103157P | TE, TBE buffer component |
Ethylene diaminetetraacetic acid | Ajax Finechem | AJA180 | 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH. |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Bacteriostatic agent |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | TE buffer component |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Cell lysis buffer component |
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L5125 | Cell lysis and ESP buffer component |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | Cell lysis buffer component |
Lysozyme | Amresco | 6300 | Cell lysis buffer component |
Proteinase K | Amresco | AM0706 | ESP buffer component |
Sub-Cell Model 192 Cell | BioRad | 1704507 | Electrophoresis system |
UV transilluminator 2000 | BioRad | 1708110 | Visualization of DNA |
Ethidium Bromide | BioRad | 1610433 | Visualization of DNA |
Boric acid | VWR | PROL20185.360 | TBE component |
Hybond-XL nylon memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used |
3MM Whatman chromatography paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | Southern blotting |
HL-2000 Hybrilinker | UVP | 95-0031-01/02 | Crosslinking of DNA and hybridization |
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm | Sigma-Aldrich | 31149 | Hybridization buffer component |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Denaturation buffer component |
Trisodium citrate dihydrate | VWR | PROL27833.363 | Transfer buffer |
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Amresco | 227 | Wash buffer component |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Hybridization buffer component |
Random Hexamer Primers | Bioline | BIO-38028 | |
Klenow fragment | New England BioLabs | M0212L | |
dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
Storage Phosphor Screen | GE Healthcare Life Sciences | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen |
Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Visualization of blot |
Hybridization bottle | UVP | 07-0194-02 | 35 x 300mm |