Multimodal Kvantitativ Phase Imaging med Digital Holografisk Mikros Nøyaktig Vurderer tarmbetennelse og epithelial Wound Healing

Summary

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

Abstract

Forekomsten av inflammatorisk tarmsykdom, det vil si, Crohns sykdom og ulcerøs kolitt, har økt betydelig det siste tiåret. Etiologien av IBD er fortsatt ukjent og nåværende terapeutiske strategier er basert på den uspesifikke undertrykkelse av immunsystemet. Utviklingen av behandlinger som spesifikt retter tarmbetennelse og epitel sårtilheling kunne gi en betydelig bedre styring av IBD, men dette krever nøyaktig påvisning av betennelsesforandringer. Foreløpig er potensielle legemiddelkandidater vanligvis evaluert med dyremodeller in vivo eller med cellekulturbaserte teknikker i vitro. Histologisk undersøkelse krever vanligvis cellene eller vev av interesse å bli farget, noe som kan endre prøven egenskaper og dessuten kan tolkningen av resultatene varierer fra utprøver ekspertise. Digital holografisk mikroskopi (DHM), basert på påvisning av optiske veilengden forsinkelse, tillaterflekkfrie kvantitativ fase kontrast bildebehandling. Dette gjør at resultatene skal være direkte korrelert med absolutte biofysiske parametre. Vi viser hvordan måling av endringer i vev tetthet med DHM, basert på brytningsindeks måling, kan kvantifisere inflammatoriske forandringer, uten flekker, i forskjellige lag av colonic vevsprøver fra mus og mennesker med kolitt. I tillegg viser vi kontinuerlig multimodale label-fri overvåking av epitel sårtilheling in vitro, mulig å bruke DHM gjennom den enkle automatisert bestemmelse av de sårede området og samtidig bestemmelse av morfologiske parametere som tørr masse og tykkelse av trekkende celler. I konklusjonen, representerer DHM en verdifull, roman og kvantitative verktøy for vurdering av tarmbetennelse med absolutte verdier for parametrene mulige, forenklet kvantifisering av epitel sårtilheling in vitro, og derfor har stort potensial for translasjonsforskning diagnostisk use.

Introduction

Inflammatorisk tarmsykdom (IBD), det vil si, ulcerøs kolitt (UC) og Crohns sykdom (CD) er idiopatiske inflammatoriske sykdommer i mage-tarmkanalen ^1. Forskning på den underliggende patofysiologien av IBD og vurdering av nye medikamenter eller nye diagnostiske metoder er særlig av betydning. I både grunnforskning og den kliniske behandlingen av IBD pasienter, har tarmslimhinnen blitt et fokus for oppmerksomhet ^2,3. Mukosa representerer en anatomisk grense, ved hvilken interaksjonen mellom kommensale bakterier, epitelceller og forskjellige cellulære komponenter av tarmimmunsystemet organisere gut homeostase ^4,5. Men i IBD pasienter, fører ukontrollert og vedvarende tarmbetennelse på slimhinneskader, påviselig som sår eller stenose, som til slutt kan ende i sammenbrudd av epitelial barrierefunksjon, noe som i seg selv forverrer lokal betennelse ^6.

<pclass = "jove_content"> Epitelial sårheling er derfor avgjørende for epitelial regenerering følgende betennelse, men er også en sentral forutsetning for helbredelse av gastrointestinale sår eller anastomotic lekkasje etter gastrointestinal kirurgi ^7. Epitelial sårheling kan simuleres i in vitro assays sårheling og i murine modeller av tarmbetennelse ^8,9. Både in vitro og in vivo fremgangsmåter har ulemper, som begrenser nøyaktigheten av eksperimentell bedømmelse. In vitro-undersøkelser, som klassisk skrape analyser krever langvarige flekker prosedyrer eller transfeksjon med fluorescerende chromophores. De er ofte begrenset av deres usammenhengende overvåking av celleproliferasjon og migrasjon som ikke kan automatiseres ^10. In vivo modeller, for eksempel dekstran natriumsulfat (DSS) -indusert kolitt, mangler ofte robuste read-outs, delvis på grunn av den betydelige variasjonen sett i laboratoriemarkører, making slike markører upassende å evaluere kolitt alvorlighetsgrad ^11,12. Histologisk analyse av den betente slimhinne er for tiden fortsatt den mest gyldig metode for å bestemme graden kolitt, men dette, som in vitro epiteliale sårheling assays krever farging og er avhengig av undersøkers ekspertise ^13.

Nylig digital holografisk mikroskopi (DHM), en variant av kvantitativ fasemikroskopi ^14, ble identifisert som nyttig verktøy for evaluering av epiteliale sårheling in vitro og in vivo ^15. DHM tillater vurdering av vev tetthet ved å måle optisk veilengde forsinkelse (OPD) som utsiktene roman kreftdiagnose ^16-18 og kvantifisering av betennelser relatert vev endringer ^19. I tillegg gir DHM overvåking av cellemorfologi dynamikk ved å bestemme celletykkelse, celle dekket flateareal og intracellulært (protein) innhold mengde <sup> 15,20. I in vitro-analyser, DHM muliggjør også analyse av fysiologiske prosesser, f.eks, cellulær vannpermeabiliteten ved å evaluere forandringer i cellevolumet og tykkelse ^21,22. Videre kan DHM målinger automatiseres som hindrer etterforsker-forbundet sample bias.

Her viser vi bruken av DHM i en murin modell av intestinal inflammasjon, og gjelder også DHM for analyse av humane vev prøver for kvantitativ overvåkning av sårheling som en etikett fritt in vitro-analysen. Først vurderer vi inflammatoriske forandringer av ulike colonic vegg-lag i colitic mus og seksjoner vev fra mennesker med IBD. Etter beskriver DHM kvantitativ fase bildebehandling prosedyren, gir vi detaljerte instruksjoner for bruk av mikroskop komponenter, utarbeidelse av vevssnitt og også beskrive evalueringen av de oppkjøpte kvantitative fase bilder.

Deretter viser vi at DHM kan være UVIlized for kontinuerlig multimodal overvåking av epitel sårtilheling in vitro, og beskrive analyse av mobilnettet egenskaper som cellelag tykkelse, tørr masse og cellevolum gi innsikt i legemiddelinduserte og fysiologisk celle forandringer.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av regional etisk komité (den Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Tyskland) i henhold til tysk Dyrevernloven. Den lokale etikkutvalg ved universitetet i Münster godkjent bruk av menneskelig vev for histologisk og mikroskop analyse. 1. Dyr og materialer Bruk kvinnelig eller mannlig mus av den nødvendige DSS-mottakelig stamme som veier 20-25 g, og huset i henhold til lokale dyr omsorg lovgivning. Gi spesiell chow for gnagere og…

Representative Results

Typisk oppsett for DHM Imaging for Digital Holografisk Mikroskopi (DHM) For å utføre lyse felt avbildning og kvantitativ DHM fasekontrast-imaging, søkte vi en invertert mikroskop som angitt i figur 1 B. Systemet ble modifisert ved å feste en DHM-modul, som beskrevet tidligere 25. Digitale hologrammer ble samlet ved belysning av prøven med lys a…

Discussion

Vi viser at DHM gir nøyaktig vurdering av histologiske skader i murine kolitt modeller og prøver ex vivo menneskelige colonic vev. Videre har vi vist DHM kan kontinuerlig overvåke epitel sårheling samtidig gi multimodal informasjon om cellulære endringer. I DHM, er gjenoppbyggingen av digitalt fanget hologrammer utføres numerisk ^32. Derfor, i forhold til lyse felt mikroskopi, Zernike fasekontrast og differensial interferens kontrast mikroskopi, gir DHM kvantitativ fase kontrast med eve…

Materials

Reagents
Azoxymethane (AOM)	Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany	A5486
Cell Culture Flask	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	658170
Costar Stripette	Corning Inc., New York, USA	4488
Dextran sulphate sodium (DSS)	TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden	DB001
DMEM/Ham´s F12	PAA Laboratories – Pasching – Austria	E15-813
EGF	Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany	SPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany	E 9884
Falcon Tube 50ml	BD Biosciences, Erembodegem, Belgium	352070
Isopentane (2- Methylbutane)	Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany	M32631-1L
Methylene blue	Merck, Darmstadt, Germany	1159430025
Mitomycin C	Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany	M4287
Microscope Slides	G. Menzel, Braunschweig, Germany	J1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound	Sakura, Zoeterwonde, Netherlands	4583
Pen/Strep/Amphotericin B	Lonza, Verviers, Belgium	1558
Phosphate buffered saline, PBS	Lonza, Verviers, Belgium	4629
RPMI 1640	Lonza, Verviers, Belgium	3626
Sodium Chloride 0,9%	Braun, Melsungen, Germany	5/12211095/0411
Standard diet	Altromin, Lage, Germany	1320
Tissue-Tek Cryomold	Sakura, Leiden, Netherlands	4566
Trypsin EDTA	Lonza, Verviers, Belgium	7815
Vitro – Clud	R. Langenbrinck, Teningen, Germany	04-0002
µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high	ibidi GmbH, Munich, Germany	81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert	ibidi GmbH, Munich, Germany	80050
Equipment
MICROM HM550	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA	46320
Digital holographic microscope
Component	Model	Company
Inverted Microscope	iMIC	Till Photonics, Graefelfing, Germany
Laser	Compass 315M	Coherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lens	Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3	Zeiss, Goettingen, Germany
CCD camera	DMK 41BF02	The Imaging Source, Bremen, Germany