In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.
There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.
وغالبا ما يتطلب الأبحاث البيولوجية phenotyping كفاءة، والتي كثيرا ما يرتبط مع بعض النوع من التحليل النسيجي 1-3. وهذه الحاجة هي أكثر وضوحا مع المشاريع الطموحة لتعطيل كل جين في الماوس الجينوم 4. ويمكن لهذه التحليلات النسيجية تتراوح من تقييم مورفولوجيا الخلايا و / أو الخصائص التشريحية للتعبير رسم خرائط جينات معينة أو البروتينات إلى الخلايا الفردية. في الواقع، واحدة من المساهمات الأساسية من الأنسجة في مجال علم الجينوم هو القدرة على ربط إشارة الجزيئية محددة لمنطقة أو خلية معينة نوع.
الطرق التقليدية في الأنسجة، وخاصة لأنسجة العضلات والعظام، وغالبا ما تكون مضيعة للوقت وشاقة، تتطلب أسابيع لإصلاح بعض الأحيان، ويزيل الكلس، القسم، وصمة عار، وصورة العينة ثم تحليل الصور عن طريق تفسير بشري. تحليل الإشارات الجزيئية متعددة، سواء عن طريق المناعية، في hybridizat الموقعيتطلب أيون، أو البقع الخاصة، مقاطع متعددة وحتى عينات متعددة لأداء مناسب. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الاستجابات متعددة لا يمكن أن يشترك في تتمركز في نفس الخلية، وأحيانا لا يمكن أن يشترك مترجمة إلى منطقة محددة ضمن عينة معينة. كما يتحرك علم الجينوم وepigenomics الملعب في العصر الرقمي، يجب مجال النسيجي أيضا أن تحذو حذوها لتوفير كفاءة والإنتاجية العالية، والتحليل الآلي من مجموعة متنوعة من العلامات الجزيئية في قسم النسيجي واحد.
في الواقع، هناك طلب لتحسين تقنيات النسيجية التي يمكن ربط الإشارات الجزيئية متعددة لخلايا معينة في عينة معينة. في الآونة الأخيرة، نشرنا طريقة cryohistological الإنتاجية العالية جديد لتقييم العديد من تدابير الاستجابة في قسم معين من الأنسجة المعدنية 5-14. وتنطوي العملية على استقرار cryosection مع cryotape المجمدة، والتمسك قسم مسجلة بشكل صارم لشريحة المجهر، وإجراء عدة جولات من تلطيخ والتصوير على كل قسم. ثم يتم محاذاة هذه الجولات من الصور يدويا أو عن طريق أتمتة الكمبيوتر قبل تحليل الصور (الشكل 1). هنا، نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لهذه العملية وتقديم أمثلة حيث تحسنت هذه التقنيات فهمنا من العمليات البيولوجية المختلفة.
هنا قدمنا بروتوكول cryohistology مفصل للمشاركة في توطين وتحديد العديد من الإجراءات البيولوجية عن طريق مواءمة الصور من جولات متعددة من تلطيخ / التصوير في مقطع واحد. الطريقة الموضحة باستخدام cryotape يكون مفيدا بشكل خاص لأنها تحافظ على التشكل من الصعب قسم الأنسجة (على سبيل …
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the following funding sources: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283, and T90-DE021989.
10% neutral buffered formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde. |
Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Multiple suppliers available. |
PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Multiple suppliers available. |
Cryomolds | Fisher Scientific | Fisherbrand #22-363-554 | Different sizes can be used depending on tissue |
Cryomatrix | Thermo Scientific | 6769006 | Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands. |
2-methyl-butane | Sigma Aldrich | M32631 | Multiple suppliers available. |
Cryostat | Leica Biosystems | 3050s | Can be substituted with other brands/models. |
Specimen disc | Leica Biosystems | 14037008587 | Can be substituted with other brands/models. |
Cryostat blades | Thermo Scientific | 3051835 | Can be substituted with other brands/models. |
Cryotape | Section Lab | Cryofilm 2C | |
Roller | Electron Microscopy Sciences | 62800-46 | Can be substituted with other brands/models. |
Plastic microscope slides | Electron Microscopy Sciences | 71890-01 | Can be substituted with other brands/models. |
Glass microscope slides | Thermo Scientific | 3051 | Can be substituted with other brands/models. |
Norland Optical Adhesive, 61 | Norland Optical | Norland Optical Adhesive, 61 | |
UV Black Light | General Electric | F15T8-BLB | |
Glacial acetic acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | Multiple suppliers available. |
Chitosan | Sigma Aldrich | C3646 | Multiple suppliers available. |
InSpeck red microscopheres | ThermoFisher Scientific | I-14787 | |
InSpeck green microspheres | ThermoFisher Scientific | I-14785 | |
Calcein Blue | Sigma Aldrich | M1255 | Multiple suppliers available. |
Calcein | Sigma Aldrich | C0875 | Multiple suppliers available. |
Alizarin complexone | Sigma Aldrich | A3882 | Multiple suppliers available. |
Demeclocycline | Sigma Aldrich | D6140 | Multiple suppliers available. |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | Multiple suppliers available. |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Multiple suppliers available. |
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate | ThermoFisher Scientific | E-6588 | |
DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes. |
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | R37108 | Multiple suppliers available. |
Sodium acetate anhydrous | Sigma Aldrich | S2889 | Multiple suppliers available. |
sodium tartrate dibasic dihydrate | Sigma Aldrich | T6521 | Multiple suppliers available. |
Sodium nitrite | Sigma Aldrich | S2252 | Multiple suppliers available. |
Tris | Sigma Aldrich | 15504 | Multiple suppliers available. |
MgCl2 hexahydrate | Sigma Aldrich | M9272 | Multiple suppliers available. |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Multiple suppliers available. |
Fast Red TR Salt | Sigma Aldrich | F8764 | Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300) |
Naphthol AS-MX | Sigma Aldrich | N4875 | Multiple suppliers available. |
N,N dimethylformamide | Sigma Aldrich | D158550 | Multiple suppliers available. |
Toluidine blue O | Sigma Aldrich | T3260 | Multiple suppliers available. |
Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss AG | Axio Scan.Z1 | Other linear or tiled scanners may also be used. |
DAPI Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49000 | |
CFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49001 | |
GFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49020 | |
YFP Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49003 | |
Custom yellow (ELF 97) Filter Set | Chroma Technology Corp. | custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr | |
TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49004 | |
Cy5 Filter Set | Chroma Technology Corp. | 49009 | |
CryoJane Tape Transfer System | Electron Microscopy Sciences | 62800-10 | Multiple suppliers available. |
CryoJane Tape Windows | Electron Microscopy Sciences | 62800-72 | Multiple suppliers available. |
CryoJane Adhesive Slides | Electron Microscopy Sciences | 62800-4X | Multiple suppliers available. |