Summary

Yüksek Verim, Mineralize Dokuların Çoklu Resim Cryohistology

Published: September 14, 2016
doi:

Summary

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

Abstract

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

Introduction

Biyolojik araştırmalar genellikle sık histolojik analiz 1-3 çeşit ile ilişkili verimli fenotiplendirilmesini gerektirir. Bu ihtiyaç, fare genomuna 4 her genin bozmaya daha da belirgin iddialı projelerle olduğunu. Bu histolojik analizler tek tek hücrelere spesifik genlerin veya proteinlerin eşleme ifadesi hücre morfolojisi ve / veya anatomik özellikleri değerlendirmek arasında olabilir. Aslında, genomik alana histoloji temel katkılardan biri, belirli bir bölge ya da hücre tipine özel bir moleküler sinyali ilişkilendirmek yeteneğidir.

Özellikle kas-iskelet dokular için histoloji geleneksel yöntemler, genellikle zaman alıcı ve zahmetli, bazen düzeltmek için hafta gerektiren vardır, decalcify, bölüm, leke ve görüntü numune daha sonra insan yorumuna aracılığıyla görüntüleri analiz. In situ hybridizat edip, immünohistokimya ile, çoklu moleküler sinyallerin incelenmesiiyon ya da özel lekeleri, uygun gerçekleştirmek için birden çok bölüm ve hatta birden fazla örnekleri gerektirir. Ayrıca, bu çoklu tepkiler verilen bir örnekten içinde belirli bir bölgeye eş lokalize edilemez bazen aynı hücreye birlikte lokalize ve olamaz. genomik ve epigenomics alan dijital çağa hareket ettikçe, histolojik alanı da verimli, yüksek verim ve tek histolojik bölüm içinde moleküler sinyallerin çeşitli otomatik analizini sağlamak için davayı takip gerekir.

Gerçekten de, belirli bir numune içindeki belirli hücrelere birden fazla moleküler sinyalleri ilişkilendirmek geliştirilmiş histolojik teknikler için bir talep vardır. Son zamanlarda, mineralize dokusundan 5-14, belirli bir bölüm içinde birkaç yanıt tedbirleri değerlendirmek için yeni bir yüksek verimli cryohistological yöntemi yayınlamıştır. işlem, bir mikroskop lamı katı bantlanmış bölümüne yapışan, dondurulmuş cryotape ile cryosection stabilize içerir veHer bölümünde boyama ve görüntüleme birkaç tur yürütülmesi. Görüntülerin bu tur daha sonra elle veya görüntü analiziyle önce bilgisayar otomasyon (Şekil 1) ile hizalanır. Burada, bu sürecin ayrıntılı protokolleri sunmak ve bu tekniklerin değişik biyolojik süreçlerin anlayışımızı geliştirdik örnekler sunmak.

Protocol

Connecticut Sağlık Merkezi kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi Üniversitesi, tüm hayvan prosedürleri onayladı. 1. Sabitleme ve katıştırma CO 2 boğulma veya onaylanmış diğer yöntemlerle hayvan Euthanize. Düzgün bir şekilde monte kadar 4 ° C'de% 10 nötr tamponlu formalin ilgi doku (örneğin, bacak, omurga, vb) ve yer Hasat. önce fiksasyon tutarlı anatomik yerleşimi korumak için özel dikkat gösterin. Örneğin, …

Representative Results

Yüksek Verim, Çok Görüntü Cryohistology için Genel İş Akışı Şekil 1, bu teknik için kullanılan genel akışını gösterir. Bu görüntüleme ve nihayet görüntü hizalama / analiz birkaç tur aracılığıyla tespit edildiği yerden birkaç adım içerir. Haftada o örneklerin bu tür kirecini için gereken daha az zaman görüntüleme 4 mermi yoluyla numune sabitleme gitmek i?…

Discussion

Burada birlikte lokalize ve tek bir bölüm üzerinde lekelenme / görüntüleme birden mermi görüntüleri hizalayarak çeşitli biyolojik önlemlerin ölçmek için detaylı bir cryohistology protokolü sundu. Bu bölüm, dokuya güç morfolojisi (örneğin, mineralize edilmiş kemik ve kıkırdak) muhafaza etmesi cryotape kullanılarak belirtilen yöntem özellikle faydalıdır. Buna ek olarak, kesit doku, aynı bölümün boyama / görüntüleme sanmı için izin cam slayt sıkıca yapıştırılır; seri …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge the following funding sources: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283, and T90-DE021989.

Materials

10% neutral buffered formalin Sigma Aldrich HT501128-4L Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose Sigma Aldrich S9378 Multiple suppliers available.
PBS Sigma Aldrich P5368 Multiple suppliers available.
Cryomolds Fisher Scientific Fisherbrand #22-363-554 Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix Thermo Scientific 6769006 Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane Sigma Aldrich M32631 Multiple suppliers available.
Cryostat Leica Biosystems 3050s Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc Leica Biosystems 14037008587 Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades Thermo Scientific 3051835 Can be substituted with other brands/models.
Cryotape Section Lab Cryofilm 2C
Roller Electron Microscopy Sciences 62800-46 Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides Electron Microscopy Sciences 71890-01 Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides Thermo Scientific 3051 Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61 Norland Optical Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light General Electric F15T8-BLB
Glacial acetic acid Sigma Aldrich ARK2183 Multiple suppliers available.
Chitosan Sigma Aldrich C3646 Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres ThermoFisher Scientific I-14787
InSpeck green microspheres ThermoFisher Scientific I-14785
Calcein Blue Sigma Aldrich M1255 Multiple suppliers available.
Calcein Sigma Aldrich C0875  Multiple suppliers available.
Alizarin complexone Sigma Aldrich A3882  Multiple suppliers available.
Demeclocycline Sigma Aldrich D6140  Multiple suppliers available.
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761 Multiple suppliers available.
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate ThermoFisher Scientific E-6588
DAPI ThermoFisher Scientific 62247 Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain) ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific R37108 Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous Sigma Aldrich S2889 Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate  Sigma Aldrich T6521 Multiple suppliers available.
Sodium nitrite Sigma Aldrich S2252 Multiple suppliers available.
Tris Sigma Aldrich 15504 Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate Sigma Aldrich M9272 Multiple suppliers available.
NaCl Sigma Aldrich S7653 Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt Sigma Aldrich F8764 Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX  Sigma Aldrich N4875 Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide Sigma Aldrich D158550 Multiple suppliers available.
Toluidine blue O Sigma Aldrich T3260 Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1 Carl Zeiss AG Axio Scan.Z1 Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set Chroma Technology Corp. 49000
CFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49001
GFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49020
YFP Filter Set Chroma Technology Corp. 49003
Custom yellow (ELF 97) Filter Set Chroma Technology Corp. custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter Set Chroma Technology Corp. 49004
Cy5 Filter Set Chroma Technology Corp. 49009
CryoJane Tape Transfer System Electron Microscopy Sciences 62800-10 Multiple suppliers available.
CryoJane Tape Windows Electron Microscopy Sciences 62800-72 Multiple suppliers available.
CryoJane Adhesive Slides Electron Microscopy Sciences 62800-4X Multiple suppliers available.

References

  1. Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).
  2. Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).
  3. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61 (2006).
  4. Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).
  5. Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
  6. Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).
  7. Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).
  8. Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).
  9. Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).
  10. Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).
  11. Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
  12. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
  13. Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004 (2012).
  14. Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
  15. Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).
  16. Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).
  17. Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).
  18. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).

Play Video

Cite This Article
Dyment, N. A., Jiang, X., Chen, L., Hong, S., Adams, D. J., Ackert-Bicknell, C., Shin, D., Rowe, D. W. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J. Vis. Exp. (115), e54468, doi:10.3791/54468 (2016).

View Video