Introduction
Fagocytose er en stor celle funktion, der starter med genkendelsen og bindingen af materiale til overfladereceptorer, som derefter fører til internalisering og nedbrydning af den indtagne materiale. Mens encellede eukaryoter såsom formen Dictyostelium discoideum og amøber bruger fagocytose til fodring på bakterier, har højere organismer udviklet sig med professionelle celler. Makrofager eller dendritiske celler er den første linje i forsvaret mod patogener i forskellige væv og organer, og er afgørende for at aktivere det adaptive immunsystem gennem antigen præsentation og cytokinproduktion 1-4. Under visse omstændigheder fagocytose kan udføres af ikke-professionelle fagocytiske celler, fx, endotel- og epitelceller. Denne proces er vigtigt at opretholde homeostase under udvikling og i voksenalderen for normalt væv omsætning og remodeling. Endelig specialiserede fagocytter såsom Sertoli celler i testiklerne eller retinalpigment epitelceller er ekstremt potente fagocytter 5.
Dannelsen af en fagosomet hvor nedbrydning af mikroorganismer eller cellulært debris sker starter med gruppering af fagocytiske receptorer på overfladen af den fagocytiske celle. Downstream signalering begivenheder efter gruppering af opsoniske receptorer, såsom Fc-receptorer (FcR) eller supplerer receptorer (CRS) er blevet godt karakteriseret. Men der er også mange ikke-opsoniske receptorer, herunder Toll-lignende receptorer (TLRs), lectiner, mannose receptorer og scavenger-receptorer. Disse receptorer genkender determinanter på partikeloverfladen såsom mannose eller fucoserester, phosphatidylserin og lipopolysaccharider 1,6-9.
Patogen eller celledebris genkendelse involverer binding til og gruppering af flere typer af fagocyterende receptor, som derefter fører til intense og forbigående actin remodeling. Sideløbende omdrejningspunkt exocytose af intracellulær compartts bidrager til frigivelsen af membranspændingen og er vigtig for effektiv fagocytose af store partikler. De signaler, der fører til actin polymerisering og membran deformation blev dissekeret i forsøgsmodeller, der udløste en enkelt fagocytisk receptor. Under FcR-medieret fagocytose, der er intens actin polymerisering, der er reguleret af små GTPaser (Rac, Cdc42). Blandt deres nedstrømseffektorer, den Wiskott-Aldrich syndrom protein (WASP) fører til aktivering af actinrelaterede Protein 2/3 kompleks (ARP2 / 3), der nukleerer actinfilamenter 1,2,4,10. Lokal produktion af phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphat (PI (4,5) P2) er afgørende for indledende actinpolymerisation som driver pseudopod formation. Dets omdannelse til PI (3,4,5) P 3 er nødvendig for pseudopod udvidelse og fagosom lukning 11. Flere veje bidrager til forsvinden af PI (4,5) P2. For det første udstationering af phosphatidylinositol fosfat kinases (PIPKIs) fra fagosomet anholdelser PI (4,5) P2 syntese. For det andet kan det phosphoryleres og forbruges af klasse I PI3K kinaser (PI3K) og konverteres i PI (3,4,5) P 3 12. En rolle for phosphataser og phospholipaser er også blevet antydet i PI (4,5) P2 hydrolyse og F-actin fjernelse under fagocytose i mammale celler og i Dictyostelium 13,14. Phospholipasen C (PLC) δ hydrolyserer PI (4,5) P2 ind diacylglycerol og inositol-1,4,5- tris phosphat. PI (4,5) P2 og PI (3,4,5) P3 phosphatase OCRL (oculocerebrorenal syndrom af Lowe) har også været impliceret i fagosom formation. Præcis lokal dannelse af F-actin og dens depolymerisering er stramt reguleret i rum og tid, og vi har vist, at rekrutteringen af intracellulære rum er vigtigt at levere lokalt på OCRL fosfatase, hvilket bidrager til lokal actin depolymerisering i bunden af den fagocytiske kop Mekanismen og molekylære spillere er påkrævet fagosom lukning og membran opdeling forbliver dårligt defineret på grund af vanskelighederne ved at visualisere og overvåge det sted fagosom lukning. Indtil for nylig var fagocytose observeret på faste eller levende celler, der internaliserer partikler på deres dorsale ansigt eller på deres sider, hvilket gør rettidig visualisering af det sted fagosom lukning vanskelig. Desuden kunne fastgørelsesmetoder forårsage tilbagetrækning af membraner og prioritere resultaterne på pseudopodia udvidelse og lukning. Derimod analysen, at vi har sat op og beskrive her giver os mulighed for at visualisere pseudopod udvidelse og lukning trin i fagocytose i levende celler 13, baseret på total intern refleksion mikroskopi (TIRFM) 16. Denne optiske teknik anvender en kortvarig bølge til at excitere fluoroforer i en tynd område ved grænsefladen mellem et transparent sålåg (dækglas), og en væske (celledyrkningsmedium). Tykkelsen af excitation dybde er omkring 100 nm fra den faste overflade, hvilket tillader visualisering af molekylære begivenheder tæt på plasmamembranen. TIRFM tillader et højt signal-til-baggrund-forhold, og begrænser ud af fokus fluorescens opsamlet, og cytotoksicitet skyldes belysning af celler. Ved at udnytte TIRFM udviklede vi "fagosom lukning assay", hvor dækglas aktiveres med poly-lysin og derefter overtrukket med IgG-opsoniseret røde blodlegemer (IgG-SRBC'er). Makrofager udtrykker transient fluorescens mærkede proteiner af interesse får derefter lov at opsluge IgG-SRBC'er. Mens cellerne løsnes målpartiklerne som er ikke-kovalent bundet til glasoverfladen, kan spidserne af pseudopodier og registreres i TIRF tilstand. opkøb TIRF kombineres med opkøb i epifluorescens tilstand, efter skift etapen 3 um ovenfor, som gør det muligt visualization af bunden af den fagocytiske kop. Tilsætning af farmakologiske lægemidler, såsom dem, inhiberende actin eller dynamin under processen er også muligt yderligere at dissekere processen på det molekylære niveau. Fremgangsmåden beskrevet i detaljer her protokol er for en RAW264.7 murin makrofag cellelinie og opsoniseret partikler, men praktisk talt, kan den tilpasses til enhver anden fagocytisk celle og med andre mål, såsom perler. Denne metode vil muliggøre bedre karakterisering af forordningen i tid og rum af de molekylære aktører i pseudopod udvidelse og fagosom lukning under forskellige fagocytiske processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Det plasmid brugt Lifeact-mCherry er en slags gave fra Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, genereret efter 17.
1. Celler og transfektion
Bemærk: RAW264.7 makrofager dyrkes til sub konfluens i komplet medium (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat, 50 uM β-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamin og 10% FCS ( føtalt kalveserum)) i en 100 mm plade. De transficeres med plasmider kodende fluorescens mærkede proteiner ved elektroporering. Rutinemæssigt ca. 5 - 6 x 10 6 celler transficeres med 20 ug eller 10 ug plasmid for hver transfektion eller co-transfektion hhv. Bemærk, at andre midler til transfektion baseret på elektroporation eller lipofektion kan anvendes som alternative tilgange.
- Skrab cellerne med en celle løfteren og resuspender dem i 10 ml dyrkningsmedium ved pipettering op og ned adskillige gange.
- Centrifugercellesuspension 300 xg 5 min ved stuetemperatur i svingende vinkel rotor.
- Forvarm 10 ml komplet medium suppleret med 10 ug / ml gentamicin ved 37 ° C.
- Efter centrifugering, supernatanten og pellet resuspenderes i 3 ml "vaskebuffer A" fra elektroporation kit.
- Centrifuger cellesuspensionen 300 xg 5 min ved stuetemperatur i svingende vinkel rotor.
- I mellemtiden forberede DNA-blandingen ved stuetemperatur: 120 pi 2x puffer B, 20 ug plasmid DNA, der koder for proteinet af interesse, QSP 240 pi H 2 O.
- Efter centrifugering, kasseres hele supernatant.
- Resuspender cellepelleten i DNA-blandingen og overføres til 4 mm elektroporation kuvetter.
- Inkuber ved stuetemperatur i 3 min.
- Elektroporere på 250 V, 900 uF.
- resuspender Umiddelbart cellerne i den forvarmet (37 ° C) komplet medium suppleret med gentamicin og plade denm i en 100 mm skål.
- Inkuber de transficerede celler natten over ved 37 ° C, 5% CO2.
- Den næste morgen, erstatte det komplette medium med 10 ml serumfrit mikroskopi medium (RPMI 1640 uden phenolrødt, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat, 50 uM β-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamin).
2. opsonisering af røde blodlegemer
Bemærk: Som en model af mål partikel for makrofager, der får røde blodlegemer (SRBC'er), der anvendes. Normalt er omkring 7 x 10 6 SRBC'er pr 35 mm glasbund fad brugt.
- Vask SRBC'er med 100 pi 1x PBS (phosphatpufret saltvand) /0.1% BSA (bovint serumalbumin) og centrifugeres (600 xg, 4 min).
- Efter centrifugering, supernatanten og resuspender SRBC'er i 100 pi 1x PBS / 0,1% BSA og centrifuger (600 xg, 4 min).
- Efter centrifugering, supernatanten og resuspender SRBC'er i 1x PBS / 0,1% BSA med kanin IgG anti-SRBC'erved sub-agglutinerende koncentration. Brug 500 pi opløsning indeholdende antistof / 5 pi SRBC'er.
Bemærk: sub-agglutinerende koncentration af antistoffer svarer til den laveste koncentration, der inducerede ikke agglutination detekteres som dannelsen af et netværk. Generelt sub-agglutinerende koncentration er 8,2 ug / ml.- Bestemme koncentrationen af IgG anti-SRBC'er kræves for at opsonisere de SRBC'er ved en hæmagglutinationstest. Serielt fortynde IgG anti-SRBC'er (lager ved 13,1 mg / ml) mellem 1/50 - 1 / 25.600 i en mikroplade. Tilsæt 2 x 10 6 SRBC'er i hver brønd. Inkubér pladen i mørke ved stuetemperatur i flere timer.
- Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter under langsom rotation.
- Efter to vaske i 1 x PBS / 0,1% BSA som beskrevet ovenfor, resuspenderes IgG-opsoniseret SRBC'er (IgG-SRBC'er) i forvarmet serumfrit mikroskopi medium (2 ml / skål).
3. Poly-lysin Overfladebehandling af Dækglas
- I mellemtiden, Behandle 35 mm glasbund skåle med 2 ml 0,01% poly-L-lysin i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vaske op to gange med 2 ml 1x PBS.
4. Ikke-kovalent Fiksering af SRBC'er på Glass Bottom Dishes
- Hæld 2 ml SRBC'er suspension pr 35 mm glasbund skål.
- Centrifuge med en svingende rotor ved 500 xg i 2 min på 35 mm glasbund retter.
- Fjern supernatanten og vask en gang med 2 ml 1 x PBS / 10% BSA.
- Inkuber partiklerne i 30 minutter med 2 ml 1 x PBS / 10% BSA pr skål.
- Vaske op tre gange med 2 ml 1x PBS.
- Erstat 1x PBS med 2 ml foropvarmet (37 ° C) serumfrit mikroskopi medium.
5. Fagocytose visualiseret ved TIRFM
- Mikroskop
Bemærk: TIRFM blev udført under anvendelse af et mikroskop udstyret med en olieimmersionsobjektiv (N 100X, NA1.49), et varmekammer med CO2, og to single foton afsløring kameraer EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) kombineret med en 1,5 x linse.- Dagen før TIRF mikroskop session, tænde for opvarmningen kammer ved 37 ºC for at tillade en homogen opvarmning af mikroskopet scenen.
- Kritiske vinkel Bestemmelse
Bemærk: ImageJ Color Profiler software bruges til at behandle TIRF billede streams.- Placer en 35 mm glasbund skål indeholdende opsoniseret SRBC med serumfrit mikroskopi medium under mikroskopet.
- Skrab cellerne og resuspender dem i mediet, før du tilføjer dem (100 - 500 pi) i skålen.
- Brug "Live Acquisition" software til styring mikroskopet og udfør excitation med en 491 nm og / eller en 561 nm laser til at identificere celler, der udtrykker fluorescerende mærkede proteiner.
- Identificere en celle, der udtrykker de fluorescerende mærkede proteiner.
- Placer den i midten af feltet og erhverve 500 imaldre på en excitationsbølgelængde, med forskellige vinkler startende fra 0º op til 5º, ved en forøgelse af 0.01º (figur 2A). Vinklerne er automatisk ændres af mikroskop system.
- Bestem den kritiske vinkel tillader det indfaldende lys bliver totalt reflekteret ved glas / medium-grænsefladen og generere kortvarige bølge. Brug ImageJ Color Profiler software, åbne billedet sekvens ved at klikke på "File", "Open" og vælg den fil.
- Vælg et område af interesse (ROI), med det rektangulære værktøj, i cellen med en ensartet fluorescens (figur 2B gul 1).
- Plot "Z-akse profil" betyder fluorescensintensitet målt i ROI med funktion af vinkler på x-aksen ved at klikke på "Image" fanen, "Stakke" i drop down menuen og "Plot Z-aksen profil" (figur 2B rød 2).
Bemærk: Den kritiske vinkel er den vinkel, der fører til maremt fluorescens før et kraftigt fald i fluorescens. - Bruge enhver værdi af vinklen på x-aksen bedre end den kritiske vinkel under mikroskopi session for at opnå et TIRF signal som eksempel 2,00 (Figur 2C).
- Opkøb
- Med Live Acquisition software, oprettet parametrene for erhvervelse med modulet "Protokol Editor" (figur 3A).
- Opret en protokol med en "loop" omfattende "Multi Channels" erhvervelse at erhverve fluorescerende signal fra proteiner af interesse i TIRF regionen. Indtast TIRF vinkel (for eksempel 2,00), behandlingstid (f.eks 50 ms) og laseren intensitet (f.eks 50%) (figur 3B 1).
- Indføre en "Z bevægelse" af målet 3 um over TIRF regionen for at få signal erhvervelse i epifluorescens med "Multi Channels" værktøj. Indtast en vinkel under than kritiske vinkel (som eksempel 1,00), tidspunktet for redegørelsen (50 ms) og laseren intensitet (50%) (figur 3B, 2 og 3).
- Næste tilføje en "z move" af målet 3 um nedenfor, for at vende tilbage i TIRF region (figur 3B 4). Tilføj en "øjebliksbillede" af cellen i skarpt lys LED (Light-Emitting Diode) (figur 3B 5).
- Find en celle af interesse med et moderat niveau af fluorescens mærket protein ekspression, der initierer fagocytose af SRBC ved at udvide plasmamembranen omkring partiklen.
- Placer den i midten af feltet.
- Start streaming køb af 500 - 1000 frames. I fanen "loop count" indtastes "750 frames" (figur 3B 1).
Bemærk: ImageJ Color Profiler software bruges til at behandle TIRF billede streams. - Åbn sekvens billeder i billede J software ved at klikke på"File", "Open" og vælge filen.
- Adskil kanalerne ved at klikke på fanebladet "Image", "Hyperstacks" drop down menuen og på "Stack at hyperstack" funktion. Gennemfør dukkede vindue: Bestil: xyctz; Channel (c): antallet af kanaler (ex: "2", hvis du har to fluorokromer); Skiver (z): antal skiver i z-aksen (ex: "1", hvis der ikke er nogen bevægelse i Z- akse); Frames (t): antal billeder opdelt pr antal kanaler; Visningstilstand: Gråtoner.
Bemærk: To separate billedsekvenser genereres, svarende til de to forskellige kanaler.
- Med Live Acquisition software, oprettet parametrene for erhvervelse med modulet "Protokol Editor" (figur 3A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den eksperimentelle system er beskrevet i dette manuskript er skematisk vist i figur 1. Transficerede RAW264.7 makrofager udtrykker proteinerne af interesse fusioneret til et fluorescerende mærke bringes i kontakt med IgG-opsoniseret røde blodlegemer fra får (SRBC'er), der var ikke-kovalent fast på dækglasset. Makrofagerne kan frigøre SRBC fra dækglasset at opsluge det. Den TIRF mikroskop anvendte tillader samtidig erhvervelse af signaler fra TIRF areal svarende til spidsen af pseudopodier og signaler i epifluorescens tilstand efter en Z skift 3 um ovenfor.
Det er vigtigt at bestemme den kritiske vinkel for total indre refleksion fluorescens som beskrevet i figur 2. Dette sikrer en ren TIRF signal fra en 100 nm under plasmamembranen. Figur 3 viser udviklingen af køb af virksompå parametre gennem et modul kaldet "Protokol Editor" indgår i Live Acquisition software. Dette modul giver brugerne mulighed for at oprette og administrere arbejdsgange, før de sendes til mikroskopet, som vil udføre processen. Ved afslutningen af købet, at brugeren indsamler en TIFF stream.
Figur 4 viser, en repræsentativ live-cell TIRFM filmen af en "fagosom lukning assay" i RAW264.7 makrofager transficeret med plasmidet (f.eks Lifeact-mCherry, en slags gave fra Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, genereret efter 17) at følge actinpolymerisation. Makrofager vedvarende udtrykker plasmid fik lov til at opsluge IgG-SRBC'er bundet til dækglas. Da spidsen af pseudopodier blev apposed til dækglas omkring en SRBC blev en F-actin ring påvist i TIRF området (øverste panel), der gradvist indsnævret indtil det lukkede. Parallelt hermed sløret F-actindetekteret ved epifluorescens efter skift bordet 3 um ovenfor (nederste panel) svarede til depolymerisation ved foden af den fagocytiske kop. Efter 3 min for erhvervelsen blev SRBC helt internaliseret, hvilket bekræftes med transmitteret lys (panel til højre).
Derfor kan denne fremgangsmåde anvendes til at skelne ordentligt de molekylære begivenheder, der finder sted i det ender af pseudopodier og de molekylære hændelser ved basis af den fagocytiske kop.
Figur 1. Skematisk repræsentation af "fagosomet Lukning Assay" Analyseret af TIRFM. Fagosomet lukning analysen udføres under anvendelse af makrofager transient udtrykker en eller to fluorescerende mærkede protein. Makrofager deponeres på IgG-opsoniseret SRBC'er ikke-kovalent fastgjort på poly-lysin CoAted dækglas. Billeder optages i TIRF tilstand for at opdage det sted fagosom lukning og i epifluorescens tilstand for at detektere bunden af fagocyterende kop. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Bestemmelse af den kritiske vinkel for TIRFM. (A) Brug af "Levende erhvervelse", er en celle der udtrykker fluorescens mærkede proteiner placeret i midten af feltet (område 1 i rødt). Med TIRF Stack mulighed, blev billeder erhverves til en excitation bølgelængde, med forskellige vinkler startende fra 0 ° til 5 °, med en stigning på 0,01 ° (område 2 i rødt). (B) Rækkefølgen af billederne er åbnet ved hjælp ImageJ Color Profiler-software, og den gennemsnitlige fluorescensintensitet af aregion af interesse (ROI) er plottet med funktion af vinklerne på x-aksen ved hjælp af "Stacks" og "Plotz aksen profil" (område 1 i rødt). (C) X position af toppen af fluorescens på grunden svarer til den kritiske vinkel: 1,98 ° (sort stiplet linje). Enhver værdi efter denne vinkel kan anvendes. Som et eksempel, kan vælges 2,00 ° (rød linje). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Workflow Process bruger Live Acquisition Module: "Protokol Editor". (A) I "Protokol Editor" vinduet, er et workflow lærred oprettet. (B) Denne protokol omfatter en "Loop" af handlinger, som mikroskopet vil gentage det antal gange besluttetaf brugeren. Som et eksempel: 750 (1). Et loop inkluderet: "Multi Channels" erhvervelse med laser excitation af fluorescerende proteiner af interesse i TIRF tilstand. Som eksempel: Laser 491 nm intensitet 50% -TIRF vinkel 2,00 (2); "Z flytte" af mål 3 um (3); "Multi Channels" erhvervelse i epifluorescens mode (4); "Z move" af målet tilbage til TIRF regionen (5) og en "Snapshot" i transmitteret lys (6). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. F-actin er akkumuleret som et punkt på det sted, fagosomet Lukning. Fagosomet lukning assay blev udført under anvendelse af RAW264.7 makrofager vedvarende udtrykker plasmidet Lifeact-mCherry (en venlig gave fra Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, genereret efter 17). Plasmidet signal blev erhvervet i TIRF området (øverst) og i epifluorescens mode (nederst). Den røde pilespids angiver actin akkumulering i TIRF region. Transmitteret lys billede på 3 min præsenteres, hvilket indikerer en internaliseret SRBC. Scale bar, 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: F-actin akkumuleres i spidsen af pseudopodier og på det sted, fagosomet Lukning, mens den er fjernet fra Base af fagocytisk Cup fagosomet lukning assay blev udført ved hjælp af RAW264.7 makrofager forbigående udtrykker plasmidet.. Plasmid billeddannelse i TIRF område (øverst) og i epifluorescens-tilstand (nederst) ved hjælp af TIRFM udførtes alternativly hver 50 ms i løbet 3 min ved 37 ° C. Klik her for at se denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4 mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100X, NA1.49), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10 x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S.
- Underhill, D. M., Ozinsky, A.
- Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity. Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).
- Schlam, D., et al. Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins. Nat Commun. 6, 8623 (2015).
- Marion, S., et al. The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles. Dev Cell. 23, 954-967 (2012).
- Loovers, H. M., et al. Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4. Traffic. 8, 618-628 (2007).
- Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences. Traffic. 14, 355-364 (2013).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Curr Protoc Cytom. , (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure. Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).
