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Immunology and Infection

"फेगोसोम बंद परख" तीन आयाम में फेगोसोम गठन कल्पना का प्रयोग कुल आंतरिक परावर्तन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (TIRFM)

Published: August 26, 2016 doi: 10.3791/54470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Inserm U1016, Institut Cochin, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

Introduction

Phagocytosis एक प्रमुख सेल समारोह में कहा कि मान्यता के साथ और रिसेप्टर्स की सतह के लिए है, जो तब internalization और किया जाता है सामग्री की गिरावट की ओर जाता है सामग्री के बंधन से शुरू होता है। ऐसे सांचे Dictyostelium discoideum और अमीबा के रूप में एक कोशिकीय eukaryotes बैक्टीरिया पर खिलाने के लिए phagocytosis का उपयोग करते हैं, उच्च जीवों पेशेवर कोशिकाओं के साथ विकसित किया है। मैक्रोफेज या वृक्ष के समान कोशिकाओं विभिन्न ऊतकों और अंगों में रोगजनकों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति रहे हैं, और प्रतिजन प्रस्तुति और साइटोकाइन उत्पादन 1-4 के माध्यम से अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। कुछ परिस्थितियों में phagocytosis गैर पेशेवर phagocytic कोशिकाओं, जैसे, endothelial और उपकला कोशिकाओं द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है। इस प्रक्रिया के दौरान विकास और सामान्य ऊतक कारोबार और remodeling के लिए वयस्कता में homeostasis को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। ऐसे वृषण या रेटिना में Sertoli कोशिकाओं के रूप में अंत में, विशेष फ़ैगोसाइटवर्णक उपकला कोशिकाओं अत्यंत शक्तिशाली फ़ैगोसाइट 5 हैं।

एक फेगोसोम के गठन जहां सूक्ष्मजीवों या सेलुलर मलबे की गिरावट phagocytic सेल की सतह पर phagocytic रिसेप्टर्स की क्लस्टरिंग के साथ शुरू होता है होता है। बहाव के संकेत ऐसे एफसी रिसेप्टर्स (एफसीआर) या पूरक रिसेप्टर्स (सीआरएस) के रूप में निम्नलिखित opsonic रिसेप्टर्स की क्लस्टरिंग घटनाओं में अच्छी तरह से विशेषता किया गया है। हालांकि, वहाँ भी टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLRs), lectins, mannose रिसेप्टर्स और मेहतर रिसेप्टर्स सहित कई गैर opsonic रिसेप्टर्स हैं। इन रिसेप्टर्स ऐसे mannose या fucose के अवशेष, phosphatidylserine, और lipopolysaccharides 1,6-9 के रूप में कण सतह पर निर्धारकों को पहचानते हैं।

पैथोजन या सेल मलबे मान्यता के लिए और phagocytic रिसेप्टर के कई प्रकार है, जो तब तीव्र और क्षणिक actin remodeling के लिए नेतृत्व की क्लस्टरिंग बाध्यकारी शामिल है। intracellular compartmen के समानांतर, फोकल exocytosis मेंटीएस झिल्ली तनाव की रिहाई के लिए योगदान देता है और बड़े कणों के कुशल phagocytosis के लिए महत्वपूर्ण है। actin polymerization और झिल्ली विरूपण करने के लिए अग्रणी संकेत घटनाओं प्रयोगात्मक मॉडल है कि एक भी phagocytic रिसेप्टर ट्रिगर में विच्छेदित कर रहे थे। एफसीआर की मध्यस्थता phagocytosis के दौरान, वहाँ तीव्र actin polymerization कि छोटे GTPases (आरएसी, Cdc42) द्वारा विनियमित किया जाता है। उनकी डाउनस्ट्रीम प्रभावोत्पादक के बीच, Wiskott-एल्ड्रिच सिंड्रोम प्रोटीन (ततैया) एक्टिन से संबंधित प्रोटीन 2/3 परिसर (Arp2 / 3) कि एक्टिन तंतु 1,2,4,10 nucleates की सक्रियता के लिए होता है। Phosphatidylinositol-4, 5-बाइफोस्फेट (पीआई (4,5) पी 2) के स्थानीय उत्पादन प्रारंभिक actin polymerization कि pseudopod गठन ड्राइव के लिए महत्वपूर्ण है। गड़बड़ी (3,4,5) पी 3 इसका रूपांतरण pseudopod विस्तार और फेगोसोम बंद 11 के लिए आवश्यक है। कई रास्ते के पीआई (4,5) पी 2 लापता होने के लिए योगदान करते हैं। phosphatidylinositol फॉस्फेट चीन के सबसे पहले टुकड़ीसत्र फेगोसोम गिरफ्तारी पीआई (4,5) पी 2 संश्लेषण से (PIPKIs)। दूसरे, यह phosphorylated और वर्ग से भस्म मैं kinases (PI3K) PI3K और पीआई (3,4,5) पी 3 से 12 परिवर्तित किया जा सकता है। फास्फेटेजों और phospholipases के लिए एक भूमिका भी स्तनधारी कोशिकाओं में और Dictyostelium 13,14 में phagocytosis दौरान पीआई (4,5) पी 2 hydrolysis और एफ actin हटाने में निहित कर दिया गया है। Phospholipase सी (पीएलसी) δ diacylglycerol और inositol-1,4,5- Tris फॉस्फेट में hydrolyzes पीआई (4,5) पी 2। पीआई (4,5) पी 2 और पीआई (3,4,5) पी 3 फॉस्फेट OCRL (लोव की oculocerebrorenal सिंड्रोम) भी फेगोसोम गठन में फंसाया गया है। एफ actin और उसके depolymerization की सटीक स्थानीय गठन कसकर स्थान और समय में नियंत्रित किया जाता है और हम intracellular डिब्बों की है कि भर्ती से पता चला है स्थानीय स्तर पर OCRL फॉस्फेट देने के लिए, इस प्रकार phagocytic कप के आधार पर स्थानीय actin depolymerization के लिए योगदान महत्वपूर्ण है

तंत्र और आणविक फेगोसोम बंद करने और झिल्ली तराश के लिए आवश्यक खिलाड़ियों खराब क्योंकि visualizing और फेगोसोम बंद होने के साइट की निगरानी करने में कठिनाइयों का परिभाषित रहते हैं। अभी हाल तक, phagocytosis निश्चित या जीवित कोशिकाओं है कि उनके पृष्ठीय चेहरे पर या अपने पक्ष पर कणों internalize पर मनाया गया, फेगोसोम बंद मुश्किल की साइट के समय पर दृश्य बना रही है। इसके अलावा, फिक्सिंग के तरीकों झिल्ली और पूर्वाग्रह pseudopodia विस्तार और बंद करने पर परिणाम के त्याग का कारण बन सकता है। इसके विपरीत, परख है कि हम स्थापित किया है और यहाँ का वर्णन है हमें pseudopod विस्तार और जीवित कोशिकाओं में 13 phagocytosis को बंद करने के कदम, कुल आंतरिक प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (TIRFM) 16 के आधार पर कल्पना करने के लिए अनुमति देता है। इस ऑप्टिकल तकनीक के लिए एक पारदर्शी बीच इंटरफेस में एक पतली क्षेत्र में fluorophores उत्तेजित करने के लिए एक क्षणभंगुर लहर उपयोग करता है तोढक्कन (coverslip) और एक तरल (सेल संस्कृति के माध्यम से)। उत्तेजना गहराई की मोटाई प्लाज्मा झिल्ली के करीब आणविक घटनाओं के दृश्य की अनुमति, ठोस सतह से करीब 100 समुद्री मील दूर है। TIRFM एक उच्च संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात की अनुमति देता है, और कोशिकाओं की रोशनी के कारण एकत्र बाहर का ध्यान केंद्रित प्रतिदीप्ति और cytotoxicity सीमा।

TIRFM का लाभ उठाते हुए, हम "फेगोसोम बंद परख" जिसमें coverslips पाली lysine के साथ सक्रिय कर रहे हैं और उसके बाद आईजीजी opsonized लाल रक्त कोशिकाओं (आईजीजी SRBCs) के साथ लेपित विकसित की है। ब्याज की क्षणिक fluorescently टैग प्रोटीन व्यक्त मैक्रोफेज तो आईजीजी SRBCs निमग की अनुमति दी जाती है। कोशिकाओं को लक्षित कणों कि कांच की सतह लिए बाध्य कर रहे गैर covalently को अलग करते हैं, pseudopods के सुझावों मनाया और TIRF मोड में दर्ज किया जा सकता है। TIRF अधिग्रहण epifluorescence मोड में अधिग्रहण के साथ संयुक्त कर रहे हैं ऊपर चरण 3 माइक्रोन स्थानांतरण, जो तुलना की अनुमति देता है के बादphagocytic कप के आधार की ualization। इस तरह की प्रक्रिया के दौरान बाधा actin या dynamin उन के रूप में औषधीय दवाओं के अलावा आगे आणविक स्तर पर प्रक्रिया टुकड़े करना भी संभव है।

प्रोटोकॉल यहाँ विस्तार में वर्णित एक RAW264.7 murine बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन और opsonized कणों के लिए है, लेकिन वास्तव में, यह किसी भी अन्य phagocytic सेल करने के लिए और इस तरह के मोती के रूप में अन्य लक्ष्यों के साथ अनुकूलित किया जा सकता है। इस विधि समय और आणविक विभिन्न phagocytic प्रक्रिया के दौरान pseudopod विस्तार और फेगोसोम बंद में शामिल खिलाड़ियों के अंतरिक्ष में विनियमन के बेहतर लक्षण वर्णन की अनुमति देगा।

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Protocol

नोट: इस्तेमाल किया Lifeact-mCherry प्लाज्मिड डॉ Guillaume Montagnac, संस्थान क्यूरी, पेरिस, 17 के बाद उत्पन्न की एक तरह का उपहार है।

1. कोशिकाओं और अभिकर्मक

नोट: RAW264.7 मैक्रोफेज पूरा मध्यम में उप confluency (RPMI (रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान) 1640 मध्यम, 10 मिमी HEPES, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 50 माइक्रोन के β-mercaptoethanol, के लिए बड़े हो रहे हैं 2 मिमी एल glutamine और 10% एफसीएस ( भ्रूण बछड़ा सीरम)) एक 100 मिमी प्लेट में। वे electroporation द्वारा fluorescently टैग प्रोटीन एन्कोडिंग plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं। नियमित रूप से लगभग 5 - 6 x 10 6 कोशिकाओं क्रमश: 20 माइक्रोग्राम या 10 प्रत्येक अभिकर्मक या सह अभिकर्मक के लिए प्लाज्मिड की माइक्रोग्राम साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं। ध्यान दें कि electroporation या lipofection पर आधारित अभिकर्मक के अन्य साधनों के वैकल्पिक तरीकों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. एक सेल चोर के साथ कोशिकाओं परिमार्जन और ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे संस्कृति के माध्यम से 10 मिलीलीटर में उन्हें resuspend।
  2. अपकेंद्रित्रसेल निलंबन 300 XG, झूल कोण रोटर में आरटी पर 5 मिनट।
  3. पूरा माध्यम से पहले से गरम 10 मिलीलीटर 37 डिग्री सेल्सियस पर जेंटामाइसिन के 10 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ पूरक।
  4. Centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और electroporation किट से "धुलाई बफर ए" के 3 मिलीलीटर में गोली resuspend।
  5. सेल निलंबन अपकेंद्रित्र 300 XG, झूल कोण रोटर में कमरे के तापमान पर 5 मिनट।
  6. इस बीच में कमरे के तापमान पर डीएनए मिश्रण तैयार: 120 μl 2x बफर बी, 20 माइक्रोग्राम ब्याज की प्रोटीन, QSP 240 μl एच 2 ओ के लिए प्लास्मिड डीएनए कोडिंग की
  7. Centrifugation के बाद, पूरे सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  8. डीएनए मिश्रण में सेल गोली Resuspend और 4 मिमी electroporation cuvettes में स्थानांतरित।
  9. 3 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  10. 250 वी, 900 μF पर Electroporate।
  11. इसके तत्काल बाद पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) में कोशिकाओं जेंटामाइसिन के साथ पूरक पूरा मध्यम resuspend और प्लेटएक 100 मिमी पकवान में हूँ।
  12. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में रात भर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को सेते हैं।
  13. अगली सुबह, (RPMI 1640 लाल फिनोल के बिना, 10 मिमी HEPES, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 50 माइक्रोन के β-mercaptoethanol, 2 मिमी एल glutamine) सीरम मुक्त माइक्रोस्कोपी के माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ पूरा मध्यम जगह।

2. opsonization लाल रक्त कोशिकाओं के

नोट: मैक्रोफेज के लिए कण लक्ष्य की एक मॉडल के रूप में, भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं (SRBCs) का इस्तेमाल किया जाता है। आमतौर पर, प्रति 35 मिमी गिलास नीचे पकवान लगभग 7 एक्स 10 6 SRBCs प्रयोग किया जाता है।

  1. 1x पीबीएस (फॉस्फेट बफर खारा) /0.1% बीएसए (गोजातीय सीरम albumin) और सेंट्रीफ्यूज (600 XG, 4 मिनट) के 100 μl के साथ SRBCs धो लें।
  2. Centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1x पीबीएस के 100 μl / 0.1% BSA और सेंट्रीफ्यूज (600 XG, 4 मिनट) में SRBCs resuspend।
  3. Centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और खरगोश आईजीजी विरोधी SRBCs साथ / 0.1% बीएसए 1x पीबीएस में SRBCs resuspendपर उप agglutinating एकाग्रता। SRBCs की एंटीबॉडी / 5 μl युक्त समाधान के 500 μl का प्रयोग करें।
    नोट: एंटीबॉडी के उप agglutinating एकाग्रता सबसे कम एकाग्रता है कि एक नेटवर्क के गठन के रूप में पहचान की समूहन के लिए प्रेरित नहीं किया था से मेल खाती है। सामान्य तौर पर, उप agglutinating एकाग्रता 8.2 माइक्रोग्राम / एमएल है।
    1. आईजीजी विरोधी SRBCs एक hemagglutination परीक्षण द्वारा SRBCs opsonize के लिए आवश्यक की एकाग्रता का निर्धारण। एक microplate में 1 / 25,600 - क्रमानुसार 1/50 के बीच (13.1 मिलीग्राम / एमएल पर शेयर) आईजीजी विरोधी SRBCs पतला। प्रत्येक कुएं में 2 एक्स 10 6 SRBCs जोड़ें। कई घंटे के लिए आरटी पर अंधेरे में थाली सेते हैं।
  4. धीमी गति रोटेशन के साथ 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  5. 1x पीबीएस में दो washes / 0.1% बीएसए के रूप में ऊपर वर्णित के बाद, पूर्व गर्म सीरम मुक्त माइक्रोस्कोपी माध्यम में आईजीजी opsonized SRBCs (आईजीजी SRBCs) (2 मिलीग्राम / पकवान) resuspend।

Coverslips के 3. पाली lysine कोटिंग

  1. इस बीच मेंकमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 0.01% पाली एल लाइसिन के 2 मिलीलीटर के साथ 35 मिमी गिलास नीचे व्यंजन का इलाज।
  2. व्यंजन 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं।

4. गिलास नीचे बर्तन पर SRBCs की गैर-सहसंयोजक फिक्सेशन

  1. 35 मिमी गिलास नीचे पकवान प्रति SRBCs निलंबन के 2 मिलीलीटर डालो।
  2. 35 मिमी गिलास नीचे व्यंजन पर 2 मिनट के दौरान 500 XG पर एक झूलते रोटर के साथ अपकेंद्रित्र।
  3. तैरनेवाला निकालें और 1x पीबीएस / 10% बीएसए के 2 मिलीलीटर के साथ एक बार धो लें।
  4. 1x पीबीएस पकवान प्रति / 10% बीएसए के 2 मिलीलीटर के साथ 30 मिनट के लिए कणों को सेते हैं।
  5. व्यंजन 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं।
  6. पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) सीरम मुक्त माइक्रोस्कोपी के माध्यम से 2 मिलीलीटर के साथ 1x पीबीएस बदलें।

5. Phagocytosis TIRFM द्वारा visualized

  1. माइक्रोस्कोप
    नोट: TIRFM एक तेल विसर्जन उद्देश्य (एन 100X, NA1.49), सीओ 2 के साथ एक हीटिंग चैम्बर से लैस एक माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था, और दो ​​गानाLe फोटान का पता लगाने कैमरों EMCCD (इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज कपल्ड डिवाइस) एक 1.5X लेंस के साथ मिलकर।
    1. दिन TIRF माइक्रोस्कोप सत्र से पहले, माइक्रोस्कोप मंच का एक सजातीय हीटिंग अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग कक्ष पर बारी।
  2. महत्वपूर्ण कोण निर्धारण
    नोट: ImageJ रंग प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर TIRF छवि धाराओं पर कार्रवाई करने के लिए किया जाता है।
    1. एक 35 मिमी गिलास नीचे खुर्दबीन के नीचे सीरम मुक्त माइक्रोस्कोपी माध्यम के साथ opsonized SRBC युक्त पकवान रखें।
    2. कोशिकाओं परिमार्जन और उन्हें जोड़ने से पहले मध्यम में उन्हें resuspend (100 - 500 μl) डिश में।
    3. "लाइव अधिग्रहण" सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें माइक्रोस्कोप को नियंत्रित करने और एक 491 एनएम और / या एक 561 एनएम लेजर fluorescently टैग प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं की पहचान करने के साथ उत्तेजना प्रदर्शन करने के लिए।
    4. एक सेल कि fluorescently टैग प्रोटीन व्यक्त पहचानें।
    5. आईटी क्षेत्र के बीच में रखें और 500 im अधिग्रहणएक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में उम्र, विभिन्न कोणों के साथ 5º अप करने के लिए 0 º से शुरू, 0.01º (2A चित्रा) की एक वेतन वृद्धि के साथ। कोण स्वचालित रूप से माइक्रोस्कोप प्रणाली से बदल रहे हैं।
    6. महत्वपूर्ण कोण की इजाजत देने की घटना प्रकाश पूरी तरह से ग्लास / मध्यम इंटरफेस में परिलक्षित होना निर्धारित करें और क्षणभंगुर लहर उत्पन्न करते हैं। ImageJ रंग प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर का प्रयोग, "फाइल" पर क्लिक करके छवि अनुक्रम खुला, "ओपन" और फ़ाइल का चयन करें।
    7. एक समान प्रतिदीप्ति (चित्रा 2 बी पीला 1) के साथ ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र का चयन करें, आयताकार उपकरण के साथ, सेल में।
    8. "Z अक्ष प्रोफ़ाइल" साजिश (चित्रा 2 बी मेनू और "प्लॉट जेड अक्ष प्रोफाइल" ड्रॉप डाउन में "छवि" टैब, "ढेर" पर क्लिक करके प्रतिदीप्ति तीव्रता एक्स अक्ष पर कोणों के समारोह के साथ रॉय में मापा मतलब लाल 2)।
      नोट: महत्वपूर्ण कोण कोण एमए करने के लिए अग्रणी हैप्रतिदीप्ति में तेजी से कमी से पहले ximum प्रतिदीप्ति।
    9. उदाहरण के 2.00 (चित्रा 2 सी) के रूप में एक TIRF संकेत प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोपी सत्र के दौरान महत्वपूर्ण कोण से बेहतर एक्स अक्ष पर कोण के किसी भी मूल्य का प्रयोग करें।
  3. अधिग्रहण
    1. लाइव अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग, मॉड्यूल "प्रोटोकॉल संपादक" (चित्रा 3) के साथ अधिग्रहण के मापदंडों की स्थापना की।
      1. एक "पाश" जिसमें "मल्टी चैनल" अधिग्रहण TIRF क्षेत्र में ब्याज की प्रोटीन से फ्लोरोसेंट संकेत प्राप्त करने के साथ एक प्रोटोकॉल बनाएँ। (उदाहरण के लिए 2.00) TIRF कोण, (उदाहरण के लिए 50 मिसे) जोखिम समय और लेजर तीव्रता (उदाहरण के लिए 50%) (चित्रा 3 बी 1) दर्ज करें।
      2. TIRF क्षेत्र के ऊपर उद्देश्य 3 माइक्रोन की एक "Z चाल" "मल्टी चैनल" उपकरण के साथ epifluorescence में संकेत अधिग्रहण प्राप्त करने के लिए परिचय। टी नीचे एक कोण दर्जवह महत्वपूर्ण कोण (उदाहरण के 1.00 के रूप में), प्रदर्शनी के समय (50 मिसे) और लेजर तीव्रता (50%) (चित्रा 3 बी, 2 और 3)।
      3. अगले नीचे उद्देश्य 3 माइक्रोन की एक "Z चाल" जोड़ने के लिए, TIRF क्षेत्र (चित्रा 3 बी 4) में लौटने के लिए। एक सेल के "स्नैपशॉट" उज्ज्वल प्रकाश एलईडी (प्रकाश उत्सर्जक डायोड) (चित्रा 3 बी 5) में जोड़ें।
    2. कि कण के आसपास प्लाज्मा झिल्ली का विस्तार से SRBC के phagocytosis शुरू की fluorescently टैग प्रोटीन अभिव्यक्ति के एक मध्यम स्तर के साथ ब्याज की एक सेल का पता लगाएं।
    3. यह मैदान के बीच में रखें।
    4. 1,000 फ्रेम - 500 के अधिग्रहण स्ट्रीमिंग शुरू। "पाश गिनती" टैब में, "750 फ्रेम" (चित्रा 3 बी 1) दर्ज करें।
      नोट: ImageJ रंग प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर TIRF छवि धाराओं पर कार्रवाई करने के लिए किया जाता है।
    5. क्लिक करके छवि जम्मू सॉफ्टवेयर में अनुक्रम छवियों को खोलें"फाइल", "ओपन" और फ़ाइल चुनने।
    6. टैब "छवि" पर क्लिक करके चैनलों को अलग, "Hyperstacks" नीचे मेनू और "ढेर hyperstack करने के लिए" समारोह पर छोड़ देते हैं। छपी खिड़की को पूरा करें: आदेश: xyctz; चैनल (ग): चैनलों की संख्या (पूर्व: "2" आप दो fluorochromes है); स्लाइस (जेड): z अक्ष में स्लाइस की संख्या (पूर्व: "1" अगर वहाँ z- अक्ष में कोई आंदोलन है); फ्रेम्स (टी): चैनलों की संख्या के अनुसार विभाजित छवियों की संख्या; प्रदर्शन मोड: स्केल।
      नोट: दो अलग छवि दृश्यों उत्पन्न कर रहे हैं, दो अलग अलग चैनलों के लिए इसी।

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Representative Results

प्रयोगात्मक इस पांडुलिपि में वर्णित प्रणाली रेखाचित्र के चित्र 1 में प्रतिनिधित्व किया है। ट्रांसफ़ेक्ट RAW264.7 मैक्रोफेज एक फ्लोरोसेंट टैग के लिए जुड़े हुए ब्याज की प्रोटीन व्यक्त आईजीजी opsonized भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं (SRBCs) थे कि गैर covalently नियत के साथ संपर्क में रखा जाता है coverslip पर। मैक्रोफेज यह निमग की coverslip से SRBC अलग कर सकते हैं। TIRF इस्तेमाल माइक्रोस्कोप 3 माइक्रोन से ऊपर एक जेड पारी के बाद pseudopods और epifluorescence मोड में संकेतों के सुझावों के लिए इसी TIRF क्षेत्र से संकेतों के सहवर्ती अधिग्रहण की अनुमति देता है।

यह कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति के लिए महत्वपूर्ण कोण निर्धारित करने के लिए आवश्यक चित्रा 2. यह प्लाज्मा झिल्ली के नीचे एक 100 एनएम क्षेत्र से एक साफ संकेत TIRF सुनिश्चित करता है के रूप में वर्णित है। चित्रा 3 और अधिग्रहण के विकास का प्रतिनिधित्व करता हैएक मॉड्यूल "प्रोटोकॉल संपादक" कहा जाता है के माध्यम से मानकों पर रहते अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में शामिल थे। इस मॉड्यूल उपयोगकर्ताओं को बनाने और वर्कफ़्लोज़ का प्रबंधन करने से पहले वे माइक्रोस्कोप, जो इस प्रक्रिया पर अमल करेंगे करने के लिए भेजा जाता है की अनुमति देता है। अधिग्रहण के अंत में, उपयोगकर्ता एक झगड़ा धारा एकत्र करता है।

चित्रा 4 शो, एक प्रतिनिधि रहते सेल एक "फेगोसोम बंद परख" RAW264.7 मैक्रोफेज में प्लाज्मिड (जैसे, Lifeact-mCherry, डॉ Guillaume Montagnac, संस्थान क्यूरी, पेरिस के एक तरह का उपहार, के बाद उत्पन्न साथ ट्रांसफ़ेक्ट की TIRFM फिल्म 17) actin polymerization का पालन करें। मैक्रोफेज क्षणिक व्यक्त प्लाज्मिड आईजीजी SRBCs coverslip करने के लिए बाध्य निमग की अनुमति दी गई। जैसा कि pseudopods के सुझावों के एक SRBC चारों ओर कांच coverslip के लिए apposed रहे थे, एक एफ actin अंगूठी TIRF क्षेत्र में (शीर्ष पैनल) कि उत्तरोत्तर संकुचित जब तक यह बंद पाया गया। समानांतर में, धुँधली एफ actinऊपर नीचे (पैनल) phagocytic कप के आधार पर depolymerization के लिए corresponded चरण 3 माइक्रोन स्थानांतरण के बाद epifluorescence द्वारा पता लगाया संकेत। अधिग्रहण के 3 मिनट के बाद, SRBC पूरी तरह से भली भाँति के रूप में प्रेषित प्रकाश (सही पर पैनल) के साथ की पुष्टि की थी।

इसलिए, इस विधि ठीक से आणविक घटनाओं है कि pseudopods के बहुत समाप्त होता है और आणविक phagocytic कप के आधार पर होने वाली घटनाओं पर जगह ले भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. "फेगोसोम बंद परख" TIRFM द्वारा विश्लेषण की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। फेगोसोम बंद परख मैक्रोफेज का उपयोग कर क्षणिक एक या दो fluorescently टैग प्रोटीन व्यक्त किया जाता है। मैक्रोफेज आईजीजी opsonized SRBCs गैर covalently पाली lysine सीओए पर तय पर जमा कर रहे हैंटेड coverslips। छवियाँ फेगोसोम बंद करने की और epifluorescence मोड में साइट का पता लगाने के phagocytic कप के आधार का पता लगाने के TIRF मोड में दर्ज हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: TIRFM के लिए महत्वपूर्ण कोण का निर्धारण। (ए) "लाइव अधिग्रहण" का उपयोग करना, एक सेल fluorescently टैग प्रोटीन व्यक्त (लाल रंग में क्षेत्र 1) मैदान के बीच में रखा गया है। TIRF ढेर विकल्प के साथ, छवियों को एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर हासिल किया गया, विभिन्न कोणों 5 ° 0 डिग्री से शुरू, 0.01 ° (क्षेत्र लाल रंग में 2) की एक वेतन वृद्धि के साथ। (बी) छवियों के अनुक्रम ImageJ का उपयोग कर खोला जाता है रंग प्रोफाइलर सॉफ्टवेयर और गिरफ्तारी का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रताब्याज की egion (आरओआई) "ढेर" और "PlotZ अक्ष प्रोफ़ाइल" (लाल रंग में क्षेत्र 1) का उपयोग एक्स अक्ष पर कोणों के समारोह के साथ साजिश रची है। (सी) भूखंड पर प्रतिदीप्ति की चोटी की एक्स स्थिति से मेल खाती है महत्वपूर्ण कोण: 1.98 ° (काला बिंदीदार रेखा)। इस कोण के बाद किसी भी मूल्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, 2.00 ° चुना जा सकता है (लाल रेखा)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. कार्यप्रवाह प्रक्रिया लाइव अधिग्रहण मॉड्यूल का उपयोग: "प्रोटोकॉल संपादक"। (ए) "प्रोटोकॉल संपादक" विंडो में, एक कार्यप्रवाह कैनवास बनाई गई है। (बी) इस प्रोटोकॉल शामिल एक क्रिया है कि माइक्रोस्कोप का फैसला किया है समय की संख्या दोहराना होगा की "लूप"उपयोगकर्ता द्वारा। एक उदाहरण के रूप में: 750 (1)। एक पाश में शामिल हैं: TIRF मोड में ब्याज की फ्लोरोसेंट प्रोटीन की लेजर उत्तेजना के साथ "मल्टी चैनल" अधिग्रहण। उदाहरण के रूप में: लेजर 491 एनएम तीव्रता 50% -TIRF कोण 2.00 (2); उद्देश्य की "Z कदम" 3 माइक्रोन (3); epifluorescence मोड में "मल्टी चैनल" प्राप्ति (4); उद्देश्य की "Z कदम" वापस TIRF क्षेत्र (5) और एक "स्नैपशॉट" प्रेषित प्रकाश (6) में है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. एफ actin फेगोसोम बंद। फेगोसोम बंद परख के स्थल पर एक प्वाइंट क्षणिक प्लाज्मिड Lifeact-mCherry (डॉ Guillaume मो की एक तरह का उपहार व्यक्त RAW264.7 मैक्रोफेज उपयोग किया गया था के रूप में जमा हैntagnac, संस्थान क्यूरी, पेरिस, 17 के बाद उत्पन्न)। प्लाज्मिड संकेत TIRF क्षेत्र (ऊपर) में और epifluorescence मोड (नीचे) में अधिग्रहण कर लिया था। लाल नोक TIRF क्षेत्र में actin संचय इंगित करता है। 3 मिनट पर प्रेषित प्रकाश छवि प्रस्तुत किया जाता है, एक भाँति SRBC का संकेत है। स्केल बार, 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 1
फिल्म 1: एफ actin, pseudopods की युक्तियाँ और फेगोसोम बंद के स्थल पर जमा है, जबकि यह Phagocytic कप फेगोसोम बंद परख क्षणिक प्लाज्मिड व्यक्त RAW264.7 मैक्रोफेज उपयोग किया गया था के आधार से मंजूरी दे दी है।। TIRF क्षेत्र (ऊपर) में प्लाज्मिड इमेजिंग और epifluorescence मोड में (नीचे) का उपयोग कर TIRFM विकल्प प्रदर्शन किया गया थाLy 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के दौरान हर 50 मिसे। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-sheep red blood cells IgG MP Biomedicals 55806
Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98%  Sigma A7906
Cell lifter Corning 3008
Cuvettes 4 mm Cell project EP104
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fischer Scientific 14190-094 Room temperature
Electrobuffer kit Cell project EB110
100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning 353003
Gene X-cell pulser Biorad 165-2661
Gentamicin solution Sigma G1397
Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 MatTek corporation P35G-1.5-14-C Case
iMIC TILL Photonics Oil-immersion objective (N 100X, NA1.49), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens
Poly-L-Lysine Solution 0.1% Sigma P8920-100ml Dilution at 0.01% in water 
RPMI 1640 medium GLUTAMAX  Supplement Life technologies 61870-010
RPMI 1640 medium, no phenol red (10 x 500 ml) Life technologies 11835-105 Warm in 37 °C water bath before use
Sheep red blood cells (SRBCs) Eurobio DSGMTN00-0Q Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 114 फेगोसोम actin pseudopods मैक्रोफेज बंद करने phagocytosis TIRFM
"फेगोसोम बंद परख" तीन आयाम में फेगोसोम गठन कल्पना का प्रयोग कुल आंतरिक परावर्तन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (TIRFM)
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Marie-Anaïs, F., Mazzolini, J., Bourdoncle, P., Niedergang, F. "Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM). J. Vis. Exp. (114), e54470, doi:10.3791/54470 (2016).

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