Introduction
La phagocytose est une fonction cellulaire importante qui commence par la reconnaissance et la liaison de matière à la surface des récepteurs, ce qui conduit alors à l'internalisation et la dégradation de la matière ingérée. Alors que les eucaryotes unicellulaires tels que le moule Dictyostelium discoideum et amibes utilisent phagocytose pour l' alimentation sur les bactéries, les organismes supérieurs ont évolué avec des cellules professionnelles. Macrophages ou les cellules dendritiques sont la première ligne de défense contre les agents pathogènes dans divers tissus et organes, et sont essentiels pour activer le système immunitaire adaptatif par la présentation de l' antigène et la production de cytokines 1-4. Dans certaines circonstances , la phagocytose peut être effectuée par des cellules phagocytaires non professionnelles, par exemple, les cellules endothéliales et épithéliales. Ce processus est important pour maintenir l'homéostasie au cours du développement et à l'âge adulte pour le chiffre d'affaires des tissus normaux et le remodelage. phagocytes Enfin, spécialisés tels que les cellules de Sertoli dans le testicule ou rétinienneles cellules épithéliales pigmentaires sont extrêmement puissants phagocytes 5.
La formation d'un phagosome où la dégradation des micro-organismes ou des débris cellulaires se produit commence par le regroupement des récepteurs phagocytaires sur la surface de la cellule phagocytaire. les événements de signalisation en aval des récepteurs suivants regroupement opsoniques tels que les récepteurs Fc (FcR) ou compléter les récepteurs (CR) ont été bien caractérisés. Cependant, il y a aussi de nombreux récepteurs non-opsoniques y compris les récepteurs Toll-like (TLR), des lectines, des récepteurs mannose et les récepteurs scavenger. Ces récepteurs reconnaissent les déterminants sur la surface des particules telles que des résidus de mannose ou fucose, la phosphatidylsérine et des lipopolysaccharides 1,6-9.
la reconnaissance des pathogènes ou des débris cellulaires implique la liaison et le regroupement de plusieurs types de récepteurs phagocytaires, qui mènent ensuite à un remodelage intense et transitoire de l'actine. En parallèle, l'exocytose focal du Compartiment à intracellulairets contribue à la libération de la tension de la membrane et est importante pour la phagocytose efficace des grosses particules. Les événements de signalisation conduisant à la polymérisation et de la membrane de déformation actine ont été disséqués dans des modèles expérimentaux qui ont déclenché un seul récepteur phagocytaire. Au cours de la phagocytose FcR-médiée, il y a polymérisation de l'actine intense qui est réglementée par les petites GTPases (Rac, Cdc42). Parmi les effecteurs en aval, la protéine du syndrome de Wiskott-Aldrich (WASP) conduit à l' activation de l'Actine-protéine associée au complexe 2/3 (Arp2 / 3) qui nucléation filaments d'actine 1,2,4,10. La production locale de phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate (PI (4,5) P 2) est crucial pour la polymérisation de l' actine initial qui entraîne la formation de pseudopodes. Sa conversion en PI (3,4,5) P 3 est nécessaire pour l' extension pseudopode et phagosome fermeture 11. Plusieurs voies contribuent à la disparition de PI (4,5) P2. Tout d'abord détachement de phosphatidylinositol phosphate kinaSES (PIPKIs) de l'arrestation de phagosome PI (4,5) P2 synthèse. En second lieu , il peut être phosphorylée et consommé par PI3K de classe I kinase (PI3K) et convertie en PI (3,4,5) P3 12. Un rôle pour phosphatases et phospholipases a également été impliqué dans PI (4,5) P 2 hydrolyse et élimination F-actine lors de la phagocytose dans les cellules de mammifères et Dictyostelium 13,14. La phospholipase C (PLC) δ hydrolyse PI (4,5) P2 en diacylglycérol et le phosphate de tris inositol-1,4,5-. La phosphatase OCRL PI (4,5) P2 et PI (3,4,5) P3 (Syndrome de Lowe de Lowe) a également été impliquée dans la formation du phagosome. formation locale précise de F-actine et son dépolymérisation est étroitement régulée dans l'espace et le temps et nous avons montré que le recrutement des compartiments intracellulaires est important de fournir localement la phosphatase OCRL, contribuant ainsi à la dépolymérisation de l'actine locale à la base de la coupe phagocytaire Les joueurs de mécanisme et moléculaires nécessaires à la clôture de phagosome et de scission membrane restent mal définies en raison des difficultés à visualiser et surveiller le site de la fermeture de phagosome. Jusqu'à récemment, la phagocytose a été observée sur des cellules fixes ou vivant qui internalisent des particules sur leur face dorsale ou sur leurs côtés, ce qui rend la visualisation en temps opportun du site de phagosome fermeture difficile. En outre, les méthodes de fixation pourraient provoquer la rétraction des membranes et biaiser les résultats sur l'extension de pseudopodes et la fermeture. En revanche, le test que nous avons mis en place et de décrire ici nous permet de visualiser l' extension pseudopode et l'étape de fermeture de la phagocytose dans les cellules vivantes 13, basée sur la microscopie interne totale de réflexion (TIRFM) 16. Cette technique optique utilise une onde évanescente pour exciter les fluorophores dans une zone mince à l'interface entre un transparent, de sortecouvercle (lamelle) et un liquide (milieu de culture cellulaire). L'épaisseur de la profondeur d'excitation est d'environ 100 nm à partir de la surface solide, ce qui permet la visualisation des événements moléculaires à proximité de la membrane plasmique. TIRFM permet un rapport signal-bruit de fond, et limite la fluorescence hors-focus collectées et la cytotoxicité due à l'éclairage des cellules. En profitant de la TIRFM, on a développé le "dosage de fermeture phagosome", dans lequel les lamelles sont activées par la poly-lysine et ensuite revêtue de globules rouges opsonisés IgG (IgG-GRM). Macrophages exprimant des protéines transitoirement marquées par fluorescence d'intérêt sont alors autorisés à engloutir les IgG-GRM. Alors que les cellules se détachent les particules cibles qui ne sont pas liés de façon covalente à la surface du verre, les pointes des pseudopodes peuvent être observés et enregistrés en mode TIRF. acquisitions TIRF sont combinées avec des acquisitions dans le mode épifluorescence, après le passage du stade 3 um ci-dessus, qui permet à la visualization de la base de la coupe phagocytaire. L'addition de médicaments pharmacologiques tels que ceux inhibant actine ou dynamine au cours du processus est également possible de disséquer le processus au niveau moléculaire. Le protocole décrit en détail ici est une lignée cellulaire de macrophages murins RAW264.7 et des particules opsonisées, mais pratiquement, il peut être adapté à toute autre cellule phagocytaire et avec d'autres cibles telles que des billes. Cette méthode permettra de mieux caractériser la régulation dans le temps et l'espace des acteurs moléculaires impliqués dans l'extension pseudopode et la fermeture de phagosome lors de divers processus phagocytaires.
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Protocol
Remarque: Le plasmide utilisé Lifeact-mCherry est un cadeau genre de Dr Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, généré après 17.
1. Cellules et Transfection
Nota: Les macrophages RAW264.7 sont cultivées à la sous confluence dans un milieu complet (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, HEPES 10 mM, pyruvate de sodium 1 mM, 50 uM de β-mercaptoéthanol, 2 mM de L-glutamine et 10% de FCS ( sérum de veau foetal)) dans une plaque de 100 mm. Ils sont transfectées avec des plasmides codant pour des protéines marquées par fluorescence par électroporation. Routinière environ 5 - 6 x 10 6 cellules sont transfectées avec 20 pg ou 10 pg de plasmide pour chaque transfection ou la co-transfection , respectivement. A noter que d'autres moyens de transfection à base de lipofection ou une électroporation peuvent être utilisés comme solutions de rechange.
- Racler les cellules avec un dispositif de levage de cellules et remettre en suspension dans 10 ml de milieu de culture par pipetage de haut en bas plusieurs fois.
- Centrifugeuse lesuspension cellulaire 300 xg, 5 min à température ambiante en oscillant angle rotor.
- Préchauffage 10 ml de milieu complet supplémenté avec 10 pg / ml de gentamicine à 37 ° C.
- Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 3 ml de "tampon A de lavage" du kit d'électroporation.
- Centrifuger la suspension cellulaire 300 xg, 5 min à température ambiante dans oscillante angle rotor.
- Dans l'intervalle préparer le mélange d'ADN à température ambiante: 120 pi de 2 x tampon B, 20 pg de plasmide ADN codant pour la protéine d'intérêt, qsp 240 ul de H 2 O.
- Après centrifugation, jeter tout le surnageant.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans le mélange d'ADN et de 4 mm transférer dans des cuvettes d'électroporation.
- Incuber à température ambiante pendant 3 min.
- Électroporation à 250 V, 900 pF.
- remettre en suspension les cellules immédiatement au préchauffée (37 ° C) du milieu complet additionné de gentamicine et de la plaquem dans une boîte de 100 mm.
- Incuber les cellules transfectées pendant une nuit à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Le lendemain matin, à remplacer le milieu complet avec 10 ml de milieu de microscopie sans sérum (RPMI 1640 sans rouge de phénol, 10 mM HEPES, du pyruvate de sodium 1 mM, 50 uM de β-mercaptoéthanol, 2 mM de L-glutamine).
2. Opsonisation des globules rouges
Remarque: En tant que modèle de la cible de particule pour les macrophages, les cellules sanguines rouges de mouton (GRM) de l'utilisation. Habituellement, environ 7 x 10 6 GRM par boîte de 35 mm de fond de verre est utilisé.
- Laver les GRM avec 100 ul de PBS 1x (tampon phosphate salin) /0.1% BSA (sérum albumine bovine) et centrifuge (600 xg, 4 min).
- Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension les globules rouges dans 100 ul de 1 x PBS / 0,1% de BSA et de centrifugation (600 x g, 4 minutes).
- Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension les globules rouges dans 1x PBS / BSA à 0,1% avec IgG de lapin anti-GRMà la concentration de sous-agglutinant. Utiliser 500 pi d'une solution contenant un anticorps / 5 pi de GRM.
Remarque: La concentration sous-agglutinante d'anticorps correspond à la concentration la plus faible qui ne provoque pas d'agglutination détecté en tant que formation d'un réseau. D'une manière générale, la concentration en sous-agglutinant est de 8,2 ug / ml.- Déterminer la concentration d'anti-GRM IgG nécessaires pour opsoniser les GRM par un test d'hémagglutination. En série diluer l'IgG anti-GRM (stock à 13,1 mg / ml) entre 1/50 - 1 / 25.600 dans une microplaque. Ajouter 2 x 10 6 GRM dans chaque puits. Incuber la plaque dans l'obscurité à la température ambiante pendant plusieurs heures.
- Incuber à température ambiante pendant 30 minutes avec rotation lente.
- Après deux lavages dans 1 x PBS / BSA à 0,1%, comme décrit ci-dessus, remettre en suspension les globules rouges opsonisés IgG (IgG-GRM) dans un milieu exempt de sérum microscopie préchauffée (2 ml / boîte).
Coating 3. Poly-lysine de Lamelles
- Pendant ce temps, Traiter des plats de 35 mm de fond de verre avec 2 ml de 0,01% de poly-L-lysine pendant 30 min à température ambiante.
- Laver les plats deux fois avec 2 ml de PBS 1x.
4. Fixation non covalente de GRM sur verre Plats Bas
- Verser 2 ml de GRM suspension par 35 mm de verre plat en bas.
- Centrifugeuse avec un rotor oscillant à 500 g pendant 2 min sur des boîtes de fond 35 mm de verre.
- Retirer le surnageant et laver une fois avec 2 ml de 1 x PBS / BSA à 10%.
- Incuber les particules pendant 30 min avec 2 ml de 1 x PBS / BSA à 10% par boîte.
- Laver la vaisselle trois fois avec 2 ml de PBS 1x.
- Remplacer 1 x PBS avec 2 ml d'préchauffée (37 ° C) Agent de microscopie sans sérum.
5. La phagocytose visualisées par TIRFM
- Microscope
Remarque: TIRFM a été réalisée à l' aide d' un microscope équipé d'un objectif à immersion (N 100X, NA1.49), une chambre de chauffage avec le CO 2, et deux chanterle caméras de détection de photons EMCCD (Electron Charge Multipliant Coupled Device) couplé à une lentille de 1.5X.- La veille de la session de microscope TIRF, allumer la chambre de chauffage à 37 ° C pour permettre un chauffage homogène de la platine du microscope.
- Critical Détermination Angle
Remarque: le logiciel ImageJ Color Profiler est utilisé pour traiter les flux d'image FRBR.- Placer une boîte à fond de verre de 35 mm contenant SRBC opsonisées avec du milieu sans sérum microscopie au microscope.
- Racler les cellules et les remettre en suspension dans le milieu avant de les ajouter (100 - 500 ul) dans le plat.
- Utilisez le logiciel "Acquisition Live" pour contrôler le microscope et effectuer une excitation avec un 491 nm et / ou un laser 561 nm pour identifier les cellules exprimant des protéines marquées par fluorescence.
- Identifier une cellule qui exprime les protéines marquées par fluorescence.
- Placez-le dans le milieu du terrain et d'acquérir 500 imvieillit à une longueur d' onde d'excitation, avec des angles différents à partir de 0 ° à 5 °, avec un incrément de 0,01 ° (figure 2A). Les angles sont modifiés automatiquement par le système de microscope.
- Déterminer l'angle critique permettant la lumière incidente d'être totalement réfléchi à la / interface support de verre et de générer l'onde évanescente. En utilisant le logiciel ImageJ Color Profiler, ouvrez la séquence d'images en cliquant sur "Fichier", "Ouvrir" et sélectionnez le fichier.
- Sélectionnez une région d'intérêt (ROI), avec l'outil rectangulaire, dans la cellule avec une fluorescence homogène (figure 2B jaune 1).
- Tracer le «profil de l' axe Z" intensité moyenne de fluorescence mesurée dans le retour sur investissement avec la fonction des angles sur l'axe des x en cliquant sur l' onglet "Image", "Stacks" dans le menu déroulant et "Plot axe Z Profil" vers le bas (figure 2B rouge 2).
Remarque: L'angle critique est l'angle menant à la mafluorescence ximum avant une forte diminution de la fluorescence. - Utilisez une valeur d'angle sur l'axe des x supérieur à l'angle critique au cours de la session de microscopie pour obtenir un signal de FRBR comme exemple 2.00 (figure 2C).
- Acquisitions
- Utilisation d'un logiciel d' acquisition en direct, configurer les paramètres d'acquisition avec le module "Protocole Editor" (figure 3A).
- Créer un protocole avec une "boucle" comprenant "Canaux multi" acquisition pour acquérir signal fluorescent de protéines d'intérêt dans la région de la FRBR. Entrer l'angle TIRF (par exemple 2,00), le temps d'exposition (par exemple 50 ms) et l'intensité du laser (par exemple 50%) (figure 3B 1).
- L'introduction d'un "Z move" de l'objectif 3 pm au-dessus de la région FRBR pour obtenir l'acquisition du signal en épifluorescence avec l'outil "Multi-Canaux". Entrez un angle inférieur til angle critique (par exemple 1,00), le temps d'exposition (50 ms) et l'intensité du laser (50%) (figure 3B, 2 et 3).
- Ensuite , ajoutez un "z mouvement" de l'um objectif 3 ci - dessous, pour revenir dans la région de la FRBR (figure 3B 4). Ajouter un «instantané» de la cellule en pleine lumière LED (Light-Emitting Diode) (Figure 3B 5).
- Trouvez une cellule d'intérêt avec un niveau modéré de fluorescence expression de protéine marquée qui initie la phagocytose des SRBC en étendant la membrane plasmique autour de la particule.
- Placez-le au milieu du champ.
- Lancer l'acquisition de 500 flux - 1000 cadres. Dans l'onglet "compte de boucles", entrez "750 frames" (figure 3B 1).
Remarque: le logiciel ImageJ Color Profiler est utilisé pour traiter les flux d'image FRBR. - Ouvrez les images de séquence dans l'image J logiciel en cliquant"Fichier", "Ouvrir" et en choisissant le fichier.
- Séparer les canaux en cliquant sur l'onglet "Image", "Hyperstacks" dans le menu déroulant et sur la fonction "Stack HyperStack". Remplissez la fenêtre apparue: Ordre: xyctz; Channel (c): nombre de canaux (ex: "2" si vous avez deux fluorochromes); Tranches (z): nombre de tranches dans l'axe z (ex: "1" s'il n'y a pas de mouvement dans l'axe z); Cadres (t): nombre d'images divisées par le nombre de canaux; Mode d'affichage: Niveaux de gris.
Note: Deux séquences d'images séparées sont générées, correspondant aux deux canaux différents.
- Utilisation d'un logiciel d' acquisition en direct, configurer les paramètres d'acquisition avec le module "Protocole Editor" (figure 3A).
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Representative Results
Le système expérimental décrit dans ce manuscrit est représenté schématiquement à la figure 1. Macrophages transfectées RAW264.7 exprimant les protéines d'intérêt fusionné à un marqueur fluorescent sont placées en contact avec les moutons IgG-opsonisé globules rouges (GRM) qui étaient non covalente fixe sur la lamelle. Les macrophages peuvent détacher le SRBC de la lamelle à l'engloutir. Le microscope TIRF utilisé permet l'acquisition simultanée de signaux provenant de la zone FRBR correspondant aux extrémités des pseudopodes et des signaux en mode épifluorescence après un changement de Z 3 um ci-dessus.
Il est essentiel de déterminer l'angle critique pour la fluorescence par réflexion interne totale , comme décrit dans la Figure 2. Ceci garantit un signal TIRF propre provenant d' une région de 100 nm en dessous de la membrane plasmique. La figure 3 représente l'évolution de acquisitisur les paramètres par le biais d'un module appelé "Protocole Editor" inclus dans le logiciel Acquisition Live. Ce module permet aux utilisateurs de créer et de gérer les flux de travail avant qu'ils ne soient envoyés au microscope, qui va exécuter le processus. A la fin de l'acquisition, l'utilisateur recueille un flux TIFF.
Figure 4 montre, un live-cell film TIRFM représentant d'une «fermeture dosage phagosome" dans les macrophages RAW264.7 transfectées avec le plasmide (par exemple, Lifeact-mCherry, une sorte don de Dr Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, généré après 17) à suivre la polymérisation de l' actine. Macrophages transitoirement plasmide exprimant ont été autorisés à engloutir IgG-GRM liés à la lamelle. Comme les conseils des pseudopodes ont été apposés à la lamelle de verre autour d'un SRBC, un anneau F-actine a été détecté dans la zone de la FRBR (panneau supérieur) qui rétrécit progressivement jusqu'à sa fermeture. En parallèle, la F-actine flouesignal détecté par épifluorescence après décalage l'étape 3 ci-dessus um (panneau inférieur) correspond à dépolymérisation à la base de la coupe phagocytaire. Après 3 min de l'acquisition, le SRBC a été totalement intériorisée, comme l'a confirmé avec la lumière transmise (panneau sur la droite).
Par conséquent, cette méthode peut être utilisée pour distinguer correctement les événements moléculaires qui ont lieu au niveau des extrémités mêmes des pseudopodes et les événements moléculaires qui se produisent à la base de la coupe phagocytaire.
Figure 1. Représentation schématique de la "Phagosome Clôture Assay" Analysé par TIRFM. Le dosage de la fermeture phagosome est réalisée en utilisant des macrophages exprimant de manière transitoire une ou deux protéine marquée par fluorescence. Macrophages sont déposés sur GRM IgG-opsonisées non covalente fixés sur poly-lysine coated lamelles de. Les images sont enregistrées en mode FRBR pour détecter le site de la fermeture du phagosome et en mode épifluorescence pour détecter la base de la coupe phagocytaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Détermination de l'angle critique pour TIRFM. (A) Utilisation de "acquisition Live", une cellule exprimant les protéines marquées par fluorescence est placé au milieu du champ (région 1 en rouge). Avec l'option TIRF pile, les images ont été acquises à une longueur d' onde d'excitation, avec des angles différents à partir de 0 ° à 5 ° avec un incrément de 0,01 ° C (zone 2 en rouge). (B) La séquence d'images est ouvert en utilisant ImageJ un logiciel de profils couleur et l'intensité de fluorescence moyenne d'arégion d'intérêt (ROI) est tracée avec la fonction des angles sur l'axe des x en utilisant "Stacks" et "PLÖTZ axe profil" (région 1 en rouge). (C) La position x du pic de la fluorescence sur la parcelle correspond à l'angle critique: 1,98 ° (ligne pointillée noire). Toute valeur après cet angle peut être utilisé. A titre d'exemple, 2.00 ° peuvent être choisis (ligne rouge). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Processus de flux de travail à l' aide du module d' acquisition en direct: "Protocole Editor". (A) Dans la fenêtre "Protocole Editor", une toile de flux de travail est créé. (B) Ce protocole comprend une «boucle» d'actions que le microscope répétera le nombre de fois décidépar l'utilisateur. A titre d'exemple: 750 (1). Une boucle inclus: "Multi-Canaux" acquisition avec excitation laser des protéines fluorescentes d'intérêt en mode FRBR. A titre d'exemple: Laser 491 nm intensité de 50% Angle -TIRF 2,00 (2); "Z move" de l'objectif 3 pm (3); "Multi-canaux" acquisition en mode épifluorescence (4); "Z move" de l'objectif de retour à la région FRBR (5) et un "instantané" à la lumière transmise (6). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. F-actine est accumulé en tant que point sur le site de Phagosome Fermeture. Phagosome test de fermeture a été réalisée en utilisant des macrophages RAW264.7 exprimant transitoirement le plasmide Lifeact-mCherry (une sorte don de Dr Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, généré après 17). Le signal plasmidique a été acquise en FRBR zone (en haut) et en mode épifluorescence (en bas). La flèche rouge indique l'accumulation d'actine dans la région de la FRBR. image lumineuse transmise à 3 min est présenté, indiquant une SRBC intériorisé. Barre d'échelle, 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film 1: F-actine est accumulé dans les Conseils de la pseudopodes et sur le site de Phagosome fermeture, alors qu'il est effacé de la base de l'essai de fermeture phagocytaire Cup Phagosome a été réalisée en utilisant les macrophages RAW264.7 exprimant transitoirement le plasmide.. Imagerie plasmide dans la zone TIRF (en haut) et en mode épifluorescence (en bas) en utilisant la TIRFM a été réalisée alternatifly toutes les 50 msec pendant 3 min à 37 ° C. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4 mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100X, NA1.49), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10 x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
References
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