Abstract
Le coeur de mammifère est un grand consommateur d'ATP et nécessite un apport constant de substrats énergétiques pour la contraction. Sans surprise, les altérations du métabolisme du myocarde ont été associés au développement d'un dysfonctionnement contractile et l'insuffisance cardiaque. Par conséquent, démêler le lien entre le métabolisme et la contraction devrait faire la lumière sur certains des mécanismes qui régissent l'adaptation cardiaque ou maladaptation dans les états pathologiques. L'isolement de travail de préparation de coeur de rat peut être utilisé pour suivre simultanément et en temps réel, la fonction contractile cardiaque et le flux d'énergie fournissant des substrats dans des voies métaboliques oxydatives. Le présent protocole vise à fournir une description détaillée des méthodes utilisées dans la préparation et l'utilisation de tampons pour la mesure quantitative des taux d'oxydation du glucose et des acides gras, l'énergie principale fournissant des substrats du cœur. Les méthodes utilisées pour l'analyse de l'échantillon et l'interprétation des données sont également discutés.En bref, la technique est basée sur la fourniture de 14 C- glucose radiomarqué et un acide gras à longue chaîne radiomarqué 3 H- à un cœur battant ex vivo par perfusion cristalloïde normothermique. 14 CO 2 et 3 H 2 O, fin des sous - produits de les réactions enzymatiques impliquées dans l'utilisation de ces substrats énergétiques fournissant, sont ensuite quantitativement récupérées à partir de l'effluent coronaire. Avec la connaissance de l'activité spécifique des substrats radiomarqués utilisés, il est alors possible de quantifier individuellement le flux de glucose et d'acide gras dans les voies d'oxydation. la fonction contractile du cœur isolé peut être déterminée en parallèle avec l'appareil d'enregistrement approprié et directement corrélé aux valeurs de flux métaboliques. La technique est très utile pour étudier la relation métabolisme / contraction en réponse à diverses conditions de stress telles que des altérations de pré et après la charge et de l'ischémie, un médicament ou un circulafacteur ting ou après la modification de l'expression d'un produit génique.
Introduction
Pertinence clinique
Au coeur des mammifères, il existe une forte relation positive entre le flux de substrats par les voies métaboliques oxydatives, la génération d' ATP et le travail cardiaque 1. Au cours des deux dernières décennies, l'enquête sur le lien complexe entre le métabolisme et la fonction cardiaque a conduit à reconnaître que des altérations du métabolisme cardiaque sont une cause de dysfonctionnement contractile et le remodelage structurel éventuellement pathologique dans le cadre de différents types de maladies cardiaques 2-4. Par conséquent, il est prévu que notre compréhension des mécanismes qui régissent le remodelage métabolique du cœur souligné conduira à l'identification de cibles thérapeutiques pour la prévention ou le traitement de l' insuffisance cardiaque 5-7. La récente publication d'une déclaration scientifique de l'American Heart Association sur «l'évaluation cardiaque du métabolisme», souligne l'intérêt croissant de la communauté scientifique pour tson domaine de recherche 8. Mais alors que les avancées technologiques en imagerie cardiaque permettent maintenant d'une évaluation rapide et précise de la morphologie et de la fonction cardiaque, l'étude in vivo du métabolisme cardiaque reste limitée et lourde: résonance magnétique (RMN) et nucléaire tomographie par émission de positons (TEP) peut être utilisés pour suivre le métabolisme du phosphate de haute énergie cardiaque et l' activité du cycle de Krebs, mais ces techniques sont en proie à des coûts d'exploitation élevés et par leur incapacité à déterminer la contribution des différents substrats au métabolisme oxydatif dans des conditions stables 9 .Pour cette date , l'ex vivo travail de préparation cardiaque représente la technique seule et unique disponible pour étudier, simultanément et en temps réel, la fonction contractile et flux de substrats dans des voies métaboliques oxydatives 7,9. Le protocole suivant a pour but de fournir des lignes directrices pour la préparation et l'utilisation des réactifs utilisés pour déterminer le rates de substrats utilisation dans le coeur de rat de travail isolé.
Le Coeur Appareil Rongeur de travail isolé
Bien que la technique est vieille presque un demi-siècle, le travail isolé préparation de coeur de rat reste une méthode de choix pour la recherche cardiovasculaire. Comme pour la préparation cardiaque Langendorff, le cœur de rongeur de travail offre un moyen relativement simple, fiable et peu coûteux pour mesurer une large gamme de paramètres cardiaques, indépendamment des effets de confusion d'autres organes, neurohormonales et d'autres facteurs qui circulent. Mais contrairement au coeur Langendorff perfusé, le cœur de travail continue d'effectuer le travail cardiaque quasi-physiologique, une condition préalable à la génération de flux métabolique oxydative à des niveaux qui sont pertinents pour les conditions in vivo. Ceci est réalisé en fournissant le tampon de perfusion dans le ventricule gauche (VG) par l'intermédiaire d'une canule reliée à l'oreillette gauche, et que le LV se remplit et se contracte, letampon est éjecté à travers la ligne aortique contre une pression hydrostatique de postcharge déterminée. La conception de l'appareil de perfusion décrit initialement par Neely et ses collègues 10 a ensuite été améliorée par Taegtmeyer, Hems et Krebs 11, mais a très peu changé depuis. Comme décrit dans l'appareil d' origine, la fonction contractile peut être évaluée grâce à la détermination du débit cardiaque, sans utiliser des cylindres de plus de diplômés et un chronomètre pour mesurer aortique et coronaire flux 10,11. Plusieurs fournisseurs offrent maintenant des systèmes complets coeur de perfusion de rongeurs de travail. Ces appareils disponibles dans le commerce peut être acquise avec flowprobes, transducteurs de pression, un cathéter pression-volume et tout l'équipement nécessaire à l'acquisition de données fonctionnelle cardiaque et d'analyse. Les vendeurs offrent de nombreuses sessions de documentation et de formation pour familiariser le nouvel utilisateur avec leur équipement. Plusieurs articles de revue également les protocoles de détail sur le instrum travail cardiaqueentation et sur l'utilisation de cathéters pour mesurer la fonction cardiaque chez les rongeurs 12-15. Pour cette raison, nous allons brièvement parler de la mise en place de l'appareil de perfusion et de l'équipement d'enregistrement. Le présent protocole vise plutôt à compléter les informations déjà disponibles avec une description des méthodes qui peuvent être mises en œuvre pour mesurer simultanément les taux de glucose et de l'oxydation des acides gras à longue chaîne, les deux substrats énergétiques fournissant majeurs dans le cœur normal. Nous décrivons ici toutes les étapes impliquées dans l'utilisation des substrats énergétiques radiomarqués pour l'évaluation du métabolisme oxydatif du myocarde, de la préparation des réactifs et des tampons à la récupération et le traitement des échantillons, à l'analyse des données.
Principes de la méthode
Cardiomyocytes génèrent la plus grande partie de leur énergie pour la contraction de la phosphorylation oxydative d'acides gras (principalement des acides gras à longue chaîne) et des glucides (glucose et de lactate). Le cœur a très limité des réserves énergétiques et repose sur un approvisionnement constant de ces énergies fournissant des substrats de la circulation. Le catabolisme du glucose par la voie glycolytique donne pyruvate, qui est ensuite décarboxylé par le complexe pyruvate déshydrogénase de la membrane mitochondriale interne. Les acides gras à longue chaîne, extraits de l'albumine circulante ou des triglycérides de lipoprotéines sont d'abord activés dans des molécules d'acyl-CoA dans le cytosol et ensuite transporté à l'intérieur de la matrice mitochondriale par l'intermédiaire de la navette carnitine pour entrer dans la voie bêta-oxydation. Les molécules d'acétyl-CoA produites par le catabolisme du glucose et des acides gras alimentent le cycle de Krebs pour générer les équivalents réducteurs (NADH et FADH 2) qui sont utilisés par la chaîne de transport d'électrons pour créer la force proton motrice à travers la membrane mitochondriale interne et générer l'ATP par l'activité de l'ATP synthase. L'eau et le dioxyde de carbone sont les sous-produits d'extrémité deles réactions enzymatiques qui se déroulent à l'intérieur du cycle de Krebs. La fourniture de 14 C et 3 H- substrats radiomarqués (tels que le glucose 14 C-radiomarquée et l' acide oléique radiomarqué 3 H) au travail cardiaque isolé sera par conséquent conduire à la production de 14 CO 2 et de H 2 O 3 qui peut être quantitativement récupéré de l'effluent coronaire. La collecte de 14 CO 2 est réalisée en maintenant le cœur isolé perfusé dans une chambre étanche et en récupérant immédiatement l'effluent coronaire à sa sortie du coeur. Une petite colonne d'échange d'anions est utilisée pour séparer et récupérer 3 H 2 O dans l'effluent coronaire. La radioactivité des échantillons traités est mesurée avec un compteur à scintillation liquide, et avec la connaissance de l'activité spécifique des substrats radiomarqués utilisés, il est alors possible de quantifier individuellement le flux de glucose et d'acide gras dans laoxydation pathways 16,17.
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Protocol
NOTE: Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément à la politique du Service de santé publique sur le NIH Human Care et l'utilisation des animaux et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université du Mississippi Medical Center. Toutes les procédures impliquant l'utilisation de radioisotopes ont été approuvés et réalisés selon les lignes directrices établies par le bureau de l'Université du Mississippi Medical Center de sûreté radiologique.
1. Préparation du stock tampon Solutions et réactifs
- Krebs-Henseleit (KH) du stock régulateur Solutions
- Préparer 2 L d'une solution saline concentrée 20x mère contenant (en mol / L) 2,37 NaCl, 0,0948 KCl, 0,0236 KH 2 PO 4, et 0,0236 MgSO 4 * 7H 2 O. Filtrer sur une unité et un magasin de filtration de la taille des pores de 0,45 um à température ambiante pendant 1 mois.
- Préparer 2 litres d'une solution concentrée 20X (0,5 mol / L) de NaHCO 3. La solution peut êtrestocké à température ambiante pendant une période de temps indéfinie.
- Préparer 250 ml d'une / L solution stock 1 mol de CaCl 2. Filtrer sur une unité et un magasin de filtration de la taille des pores de 0,45 um à température ambiante pendant 1 mois.
- Conversion des Anion Résine Exchange à partir du formulaire Chloride au formulaire Hydroxide
- Laver la résine échangeuse d'anions en le remettant en suspension dans 1 L d'eau ultrapure. Laisser la résine pour régler et verser l'excès d'eau. Répétez cette étape 4 fois plus.
- Verser la résine dans un porte-filtre sous vide de microanalyse de verre monté sur un flacon de filtration.
- Convertir la résine à la forme hydroxyde en faisant passer lentement à travers 22 volumes de 1 N NaOH. Mélanger la suspension de façon intermittente avec une spatule en acier inoxydable.
- Laver la résine avec de l'eau ultrapure jusqu'à ce que le pH tombe en dessous de 9,0. Vérifier le pH régulièrement par immersion d'une bande d'essai de pH près de la surface de la suspension de résine. Couvrir et conserver la résine avec de l'eau ultrapure dans un bobouteille en verre rosilicate et protéger de la lumière. Ne pas laisser la résine sécher avant de l'utiliser.
NOTE: En cas de stockage correctement, la résine va durer au moins 3 mois.
- Acid-albumine Solution 8x concentré Stock oléique
- Dans un ballon à 4 L Erlenmeyer, mélanger 200 ml de la solution mère 20x concentrée de sel et 200 ml de concentré NaHCO3 solution 20x avec 3,6 L d' eau ultrapure.
- En utilisant un tube de dispersion de gaz comprenant un cylindre fritte, le gaz de la solution pendant 15 min avec un mélange de dioxyde de carbone à 5% et 95% d'oxygène pour stabiliser le pH.
- Verser 470 ml de tampon dans un bécher de 1 L de verre. Ajouter 8,75 ml de la / L CaCl2 solution stock 1 mol au tampon 3530 ml restant dans le ballon 4 L Erlenmeyer et mettre de côté.
- Ajouter 40 g de sans acide gras BSA à 1 L bêcher en verre et remuer avec une barre d'agitation jusqu'à dissolution.
- Dans un tube conique de 15 ml, la préparation de 4 ml de 50% (v: v) une solution d'éthanol dans de l'eau ultrapure. Ajouter 487 mg sodium oléate et vortex jusqu'à ce que la poudre est entièrement dissous.
REMARQUE: Certains chercheurs utilisent de l'acide palmitique à la place de l'acide oléique dans le tampon de perfusion. Une solution stock d'acide palmitique-albumine peut être préparé en suivant la même procédure. Toutefois, il est recommandé de chauffer la solution à 70 ° C pour obtenir la solubilisation complète du palmitate de sodium. - Ajouter goutte à goutte une solution d'oléate à la solution de BSA dépourvue d'acides gras sous agitation constante et attendre 10 minutes supplémentaires pour le complexe acide oléique-BSA à se former.
REMARQUE: La solution doit avoir une couleur jaune clair et être dépourvue de particules visibles. La présence d'un précipité ou les particules insolubles peut indiquer la conjugaison incomplète de l'acide gras à la BSA. Si cela se produit, la solution doit être jeté et le processus a commencé encore.
NOTE: palmitate précipitera si elle est autorisée à siéger dans une pipette et ne peut être ajouté goutte à goutte. La solution agitée de BSA peut être chauffé à 37 ° C pour faciliter binding d'acide palmitique. Ne pas surchauffer car cela peut provoquer la dénaturation et l'agrégation des BSA.
ATTENTION: Les prochaines étapes de ce protocole implique la manipulation de matières radioactives. Porter des EPI appropriés et suivre les consignes d'élimination de la sécurité et des déchets fixés par le bureau de sécurité de rayonnement de l'institution. - Ajouter 160 pi (0,8 mCi) [9,10 3 H] d'acide oléique à la solution d'agitation de l' acide oléique-BSA et agiter pendant encore 10 min.
- Ajouter 2,5 ml de la / L CaCl2 solution stock 1 mol à la solution d'agitation de l' acide oléique-BSA.
- Couper environ 1,2 m de tuyau de membrane de dialyse et rincer à l'intérieur et à l'extérieur avec de l'eau du robinet. Frotter le tube de dialyse vigoureusement sous l'eau du robinet pendant 10 à 15 min pour éliminer le revêtement de glycérol de la membrane. Vous pouvez également retirer le revêtement par trempage du tube de dialyse dans l'eau chaude pendant 1 heure avant utilisation. Finition par rinçage du tube de dialyse avec ultrapure water.
- Solidement attacher une extrémité du tube de dialyse. Remplir avec la solution acide oléique-BSA et attacher l'autre extrémité du tube de dialyse.
- Placer le tube de dialyse rempli dans le ballon 4 L Erlenmeyer de tampon KH et permettre à dialyser une nuit à 4 ° C sous agitation douce avec un barreau d'agitation.
- Le lendemain, retirer la solution concentrée d'acide-BSA 8x oléique du tube de dialyse. Utiliser la solution acide oléique-BSA immédiatement pour perfusion ou aliquote et conserver à -20 ºC. aliquotes congelés sont stables pendant au moins 2 mois. Évitez de multiples cycles de gel-dégel, car cela pourrait compromettre la solubilité du complexe acide oléique BSA.
REMARQUE: Utilisez uniquement l'eau ultrapure (résistivité de 18,2 MΩ.cm à 25 ° C, le carbone organique total <10 ppb, micro-organismes ≤ 1 UFC / ml, les particules dont la taille est plus de 0,22 um ≤1 / ml) pour préparer les réactifs et tampons utilisé pour le coeur perfusion. La conversion de la résine échangeuse d'anions à partir de son chlorure pourm de la forme hydroxyde peut être évité par l' achat direct de la forme d'hydroxyde à une dépense supplémentaire (voir tableau des matériaux). En plus de l'oléate ou le palmitate, tout autre type d'origine naturelle d'acides gras peuvent également être utilisés, tant que la version tritiée de l'acide gras est disponible pour suivre son oxydation.
2. Préparation du tampon Perfusion
- Dans un ballon à 4 L Erlenmeyer, mélanger 200 ml de la solution mère 20x concentrée de sel et 200 ml de concentré NaHCO3 solution 20x avec 3,6 L d' eau ultrapure. Gaz la solution pendant 15 min avec un mélange de dioxyde de carbone de 5% et de l' oxygène à 95%, puis ajouter 10 ml de la / L CaCl2 solution stock 1 mol pour régler la concentration de Ca libre 2+ à 2,5 mmol / L.
ATTENTION: Les étapes suivantes impliquent la manipulation de matières radioactives. Porter des EPI appropriés et suivre les règles de sécurité et d'élimination des déchets fixés par le ra de l'institutionbureau de la sécurité de diation. - Transfert 1.750 tampon L KH à un 2 L bouteille en verre borosilicate. Ajouter 250 ml de la solution concentrée 8x acide oléique-BSA, 1,802 g de D-glucose, 400 ul de l' insuline à 0,4 U / ml et 200 pi (0,2 mCi) [U- 14 C] glucose. Inversez la bouteille pour mélanger. Cela donnera à 2 L de tampon de perfusion complet contenant de l'acide oléique (0,4 mmol / L), D-glucose (5 mmol / L) et de l'insuline (40 uU / ml).
REMARQUE: Un volume de 2 litres est suffisante pour perfuser un coeur de rat adulte travaillant dans des conditions de non-recirculation pendant au moins 60 min. - Utiliser une partie de la mémoire tampon KH non radioactif pour remplir deux plats de dissection et de mettre sur la glace pour refroidir.
3. Préparation de l'appareil de perfusion
NOTE: L'enquêteur peut choisir d'utiliser un appareil de perfusion sur mesure telle que celle décrite par Taegtmeyer, Hems et Krebs 11, ou l' un des systèmes disponibles dans le commerce. Les systèmes de perfusion sont typiquement composés de lales éléments décrits à la figure 1 ci - dessous. Outre le tube et la verrerie, le reste de l'équipement d'enregistrement est facultative et son utilisation dépendra des besoins de l'enquêteur d'aborder la question expérimentale posée. Néanmoins, nous recommandons l'utilisation de microélectrodes d'oxygène pour déterminer la concentration en O 2 dans l'entrée de la mémoire tampon et la sortie de la circulation coronaire (figure 1). Cela aidera le contrôle de l'enquêteur que le cœur est fourni avec une quantité appropriée d'oxygène, et que l'apport d'oxygène ne varie pas entre les expériences. En outre, la détermination de la différence d'oxygène "artérioveineuse" peut être utilisé pour calculer la consommation d'oxygène du myocarde et efficacité cardiaque 16,18.
- Allumez le bain d'eau circulant et réglé à 37 ° C pour réchauffer l'appareil de perfusion.
- Allumez l'ordinateur et le système d'acquisition de données qui seraêtre utilisé pour mesurer la fonction cardiaque.
- Connecter les appareils d'enregistrement (de cathéter de pression, pression-volume cathéter, microélectrodes d'oxygène, débitmètres, etc.) au système d'acquisition de données et d' effectuer l' étalonnage des instruments en suivant les instructions du fabricant.
- Remplir le réservoir tampon avec de l'eau ultrapure. Allumez la pompe péristaltique et rincer l'eau à travers tous les tubes et verrerie pour rincer le système. Éteignez la pompe péristaltique et assurez-vous qu'aucune eau reste dans le tube et / ou la verrerie, car cela peut affecter la concentration du tampon de perfusion et la préparation cardiaque.
- Connecter un nouveau filtre en fibre de verre de 1,0 um au système. Raccorder le réservoir de gaz contenant un mélange de dioxyde de carbone à 5% et 95% d'oxygène à la chambre d'oxygénation.
ATTENTION: Les étapes suivantes impliquent la manipulation de matières radioactives. Porter des EPI appropriés et suivre les règles de sécurité et d'élimination des déchets fixés par l'institutionradioprotection du bureau ». - Remplir le réservoir tampon avec un tampon de perfusion. Allumez la pompe et assurer le remplissage de tous les tuyaux et verrerie avec le tampon de perfusion. Exécuter le tampon de perfusion à travers l'appareil de perfusion dans le mode de remise en circulation et oxygéner pendant au moins 30 minutes avant utilisation.
- Étroitement fixer le tube d'une seringue de 20 ml sous la chambre cardiaque pour récupérer l'effluent coronaire. Branchez la pointe de la seringue vers le haut d'un robinet à trois voies. Connectez le bras latéral à une seringue de 3 ml. Connectez le bras inférieur via un tube à un conteneur pour déchets radioactifs liquides.
NOTE: Lors de l'utilisation du complexe d'acide gras-BSA, oxygénation du tampon de perfusion ne peut pas être réalisée par barbotage direct avec un tube de dispersion de gaz car cela provoquerait un moussage excessif de la solution. Utiliser un oxygénateur à membrane (figure 1) ou d' une chambre d'oxygénation du flux de feuilles à cet effet. Il est fortement recommandé de vérifier qu'un niveau approprié of oxygénation est atteinte en plaçant un micro - électrode à oxygène dans le circuit de perfusion (Figure 1).
4. Rat Isolation cardiaque et Cannulation
- Peser rat sur une échelle.
- Préparer une seringue avec une dose anesthésique de 150 mg / kg thiobutabarbital hydrate de sel de sodium et une seringue à tuberculine avec 200 unités USP d'héparine.
- Injecter thiobutabarbital IP et attendre que l'animal à perdre conscience. D' autres agents d'induction peuvent être utilisés aussi longtemps que cela ne va pas interférer avec l'objectif de l'expérience (voir le choix de l'anesthésique dans la section ci - après).
- Vérifier le niveau approprié de l'anesthésie en confirmant l'absence de pincement de l'orteil réflexe. Assurez-vous de maintenir une bonne profondeur de l'anesthésie pour assurer que l'animal ne ressent pas la douleur pendant la procédure.
- Une fois que le rat est totalement inconscient et ne répond pas aux pincement de l'orteil, placez-le sur le dos sur la table d'opération et secmembres ure avec du ruban adhésif ou des broches.
- Clip de la libre abdomen des cheveux et effectuer une incision médiane de l'abdomen. Ne pas ouvrir la cavité thoracique à ce stade encore. Déplacer l'estomac et de l'intestin côté pour révéler la veine cave inférieure. Injecter l'héparine directement dans la veine cave inférieure et attendre 5 à 10 secondes avant de poursuivre.
- À l'aide de ciseaux couper le diaphragme et les parois de la cage thoracique afin d'exposer le contenu de la cavité thoracique.
- Délicatement saisir le coeur entre le pouce, l'index et le majeur et l'accise le cœur et les poumons ensemble. Couper au niveau de l'aorte descendante, en faisant attention à ne pas endommager la crosse aortique et l'aorte ascendante dans le processus. transférer immédiatement le cœur et les poumons à l'un des plats de dissection remplis avec le tampon KH glacé.
- Après le cœur cesse de battre, transférer dans le deuxième plat de dissection et couper les gros morceaux de tissu pulmonaire attachés tout en gardant le cœur immergé dans un tampon KH glacé. Couper la descenteing aorte juste au-dessus de l'arc aortique.
ATTENTION: Les étapes suivantes impliquent la manipulation de matières radioactives. Porter des EPI appropriés et suivre les consignes d'élimination de la sécurité et des déchets fixés par le bureau de sécurité de rayonnement de l'institution. - Rincer la ligne aortique de l'appareil de perfusion pour remplir la canule aortique avec un tampon chaud et pour éliminer toute l'eau ou l'air qui peuvent encore être présents dans le tube. Laisser le tampon de perfusion au goutte à goutte de la canule aortique pour réduire au minimum le risque d'embolie gazeuse au moment où le coeur est attaché à la canule.
- L'utilisation de deux micro pince de dissection ouvrir soigneusement l'aorte et faites glisser le coeur vers le haut sur la canule aortique. Fixer l'aorte sur la canule avec un micro pince et initier Langendorff perfusion du cœur. Observer le cœur commence à battre et expulser tout le sang restant dans la vasculature coronaire dans les secondes qui suivent le début de la perfusion.
NOTE: Il est très important d'effectuer les étapes 4.6 à 4,10 aussi vite que possible pour éviter les lésions ischémiques irréversibles au cœur. Avec l'expérience, toute la procédure devrait prendre entre 1 et 2 min. Lorsque vous faites glisser l'aorte sur la canule, veillez à ne pas passer la racine aortique, car cela pourrait entraîner une hypoperfusion myocardique et des dommages à la valve aortique. - Attachez l'aorte à la canule aortique avec une suture de soie 3-0 et enlever le micro clip. Repérez la veine pulmonaire. Il peut être nécessaire de couper les tissus non-cardiaques pour le trouver, mais ne pas couper trop de tissus non-cardiaques, car ils servent à attacher l'oreillette gauche à la canule.
- Rincer la ligne auriculaire gauche de l'appareil de perfusion pour remplir la canule auriculaire avec un tampon chaud et pour éliminer toute l'eau ou l'air qui peuvent encore être présents dans le tube. Soyez particulièrement prudent pour éliminer toute bulle d'air de l'appareil pour minimiser le risque d'embolies d'air au moment où le cœur est attaché à la canule.
- L'utilisation de deux micro-dissection forceps saisir délicatement l'ouverture de la veine pulmonaire et faites glisser le coeur vers le haut sur la canule auriculaire. Il peut être nécessaire de repositionner le coeur en faisant tourner doucement la canule auriculaire et / ou de l'aorte pour réaliser cette étape. Dans tous les cas, veiller à ce que la procédure n'impose pas une contrainte excessive sur le cœur et provoque la flexion de l'aorte. Attachez l'oreillette gauche à la canule auriculaire avec une suture 3-0 en soie.
- Ouvrez la ligne auriculaire et passer simultanément la ligne aortique du mode Langendorff au mode de travail. En cas de fuite de mémoire tampon sur de l'oreillette gauche, fermer la ligne auriculaire, basculer en arrière de la ligne de l'aorte à perfusion de Langendorff, et utiliser une autre suture 3-0 en soie pour attacher l'oreillette gauche de manière plus sécurisée à la canule.
5. Mesure de la fonction cardiaque et de prélèvement d'échantillons
REMARQUE: La détermination des flux métaboliques nécessite la connaissance du débit coronaire (CF). Comme cela est décrit ci-dessous, les valeurs de débit coronarien peuvent êtreobtenu par la simple utilisation d'un chronomètre. En outre, la mesure du flux aortique (AF) avec la même méthode permet la détermination du débit cardiaque (CO = CF + AF), qui peut ensuite être utilisé pour calculer la puissance cardiaque (CP) comme une mesure générale de la fonction cardiaque en appliquant la formule CP = CO (m 3 / s) * Postcharge (Pa). Une autre méthode disponible pour l'évaluation de la fonction cardiaque repose sur la mesure en temps réel de la pression d'impulsion d'un transducteur de pression (figures 3 et 4). Bien que facultative, les mesures les plus précises et détaillées de la fonction et de l'hémodynamique contractile cardiaque, y compris la détermination de la gauche systolique ventriculaire et les fonctions diastolique, seront atteints avec l'utilisation d'une pression-volume (PV) conductance cathéter. Cette section décrit brièvement le cathétérisme du cœur isolé. Des informations supplémentaires concernant l'étalonnage des cathéters PV et l'analyse des données avec un logiciel statistique peut êtretrouvé dans les références 14,15.
ATTENTION: Les étapes suivantes impliquent la manipulation de matières radioactives. Porter des EPI appropriés et suivre les consignes d'élimination de la sécurité et des déchets fixés par le bureau de sécurité de rayonnement de l'institution.
- Si l'expérience comprend la mesure directe de la fonction VG avec un cathéter, percer le sommet LV avec une aiguille 26 G et d'introduire le cathéter par l'intermédiaire de la ponction.
- Lors de l'utilisation d'un cathéter de pression-volume, positionner soigneusement le cathéter de telle sorte que son axe soit aligné avec l'axe longitudinal LV, l'électrode distale juste en dessous de la valve aortique et adjacente à la frontière endocardique et l'électrode proximale juste à l'intérieur de la paroi ventriculaire.
- Sceller le coeur dans la chambre cardiaque chemisé d'eau et de surveiller les paramètres fonctionnels cardiaques avec le logiciel d'acquisition de données. Commencer l'enregistrement après les paramètres cardiaques de base ont été stables pendant plus de 5 min.
- Déterminer le débit coronaire par meaSuring le temps nécessaire pour remplir le tube de seringue de 20 ml fixé sous la chambre de coeur. Après la mesure, ouvrir le robinet à trois voies pour vider l'effluent coronaire dans le conteneur de déchets liquides radioactifs.
NOTE: Les mesures de débit peuvent également être effectuées à l'aide d'un débitmètre et flowprobes. - Utiliser la seringue de 3 ml fixée au bras latéral du robinet à trois voies pour récupérer ~ 2 ml d'effluent lorsqu'il sort coronaire du coeur. Transférer 0,5 ml de l'effluent coronaire dans un tube 2 ml capless microcentrifugeuse et procéder immédiatement à la détermination des taux d'oxydation du glucose (section 6 ci-dessous).
- Transférer le reste de l'échantillon d'effluent coronaire (~ 1,5 ml) dans un tube à centrifuger étiquetés de façon appropriée et de les stocker sur la glace.
- Répétez les étapes 5/4 à 5/6 à intervalles réguliers (par exemple tous les 5 ou 10 minutes) jusqu'à la fin de l'expérience de perfusion.
- Si l'on utilise un cathéter de pression-volume, injecter un bolus de 10 pl d'une solution saline hypertonique (15%)dans la ligne auriculaire et juste avant la canule auriculaire avant de conclure l'expérience. Utiliser cette injection d' un bol pour calculer la conductance parallèle (V p), ce qui est critique pour la détermination précise du volume cardiaque 15.
- Décachetez la chambre cardiaque et retirer le cathéter du LV si l'on a utilisé dans l'expérience. Récupérer le coeur en utilisant l'une des options suivantes:
- S'il n'y a pas besoin d'isoler des zones spécifiques du cœur pour les analyses en aval et si l'appareil de perfusion permet, des lignes à la fois auriculaire et de l'aorte à proximité et immédiatement geler-pince le cœur sur ses canules à l'aide de pinces Wollenberger pré-refroidi dans de l'azote liquide.
- Vous pouvez également couper le cœur au large des canules et déposez-le dans le tampon KH glacé. sécher rapidement le coeur sur une serviette en papier et de mesurer son poids humide. Le cœur peut alors être disséqué et des échantillons de tissus collectés pour des mesures spécifiques. Congeler le tissu restant en utilisant Wollenberger tongs préalablement refroidi dans de l'azote liquide.
- Stocker le tissu cardiaque congelé à -80 ° C jusqu'à la détermination du poids sec (Voir la section 8. Calculs).
6. Détermination du glucose myocardique Oxydation Tarifs
Remarque: Le procédé consiste en la récupération quantitative de 14 CO 2 dans l'effluent coronaire avec une solution de piégeage d'hydroxyde de hyamine. Le 14 CO 2 dissous en H 14 CO3- est récupéré suivant l' acidification du tampon avec de l' acide perchlorique. Les échantillons doivent être traitées immédiatement après leur récupération que la diffusion passive de gaz entre l' air et l' échantillon se traduira par une perte de 14 CO 2 au fil du temps. Les flacons de scintillation doivent être hermétiquement scellés par les bouchons de douille en caoutchouc pour empêcher la perte de 14 CO 2 après l' ajout d' acide perchlorique. Si nécessaire, parafilm peut être utilisé pour fixer les bouchons de manchon en caoutchouc à laflacons (figure 2).
- Ajouter 1 ml de 10x concentrée d'hydroxyde de hyamine à des flacons à scintillation en verre (une fiole pour chaque échantillon + deux flacons supplémentaires pour la détermination de l'activité de fond).
ATTENTION: Hydroxyde de hyamine est hautement toxique et provoque de graves brûlures. Consulter la fiche signalétique de ce produit pour la manipulation et le stockage approprié. - Utiliser des pinces délicatement transférer le tube capless microcentrifugeuse de 2 ml contenant l'échantillon d'effluent de 0,5 ml coronaire à un flacon pré-rempli avec l'hydroxyde de hyamine. En utilisant 0,5 ml de tampon de perfusion pour la détermination de l'activité de fond.
- Boucher le flacon avec un bouchon à manchon en caoutchouc. Parafilm peut être utilisé pour assurer l'étanchéité du flacon. En utilisant une seringue de 1 ml et une longue aiguille 23 G, injecter 200 pi d'acide perchlorique (60% w: w%) à travers le bouchon de manchon en caoutchouc et directement dans le tube 2 ml de capless.
NOTE: L'effluent coronaire devrait devenir blanc en raison de la précipitation de BSA. - Que les flacons spendant la nuit.
ATTENTION: L' acide perchlorique est très corrosif, peut agir comme un comburant et / ou causer un risque d'explosion. Consulter la fiche signalétique de ce produit pour la manipulation et le stockage approprié. - Le lendemain, retirez les bouchons de manchon en caoutchouc. récupérer soigneusement chaque tube capless 2 ml avec des pincettes et laver le fond du tube sur le dessus du flacon ouvert avec 1 ml de cocktail de scintillation pour récupérer tous de l'hydroxyde de hyamine. Jeter le tube capless dans un conteneur de déchets radioactifs étiquetés de manière appropriée.
- Ajouter un 9 ml de cocktail de scintillation supplémentaire par flacon. Ajouter 0,5 ml de tampon de perfusion directement à deux flacons remplis avec 10 ml d'un cocktail de scintillation liquide pour la détermination de l'activité spécifique. Agiter les flacons vigoureusement à la main et attendre au moins 6 heures pour permettre aux bulles d'air de se dissiper avant de mesurer dans un compteur à scintillation liquide fixé de manière appropriée pour des expériences sur l'étiquette double.
REMARQUE: Utilisez des flacons en verre transparent pour visualiser le necedle lorsque percer les bouchons de manchon en caoutchouc. Ne pas laisser tomber l'acide perchlorique dans l'hydroxyde de hyamine car cela va ruiner la réaction. L' ajout des acides perchlorique libère le 14 CO 2 de l'effluent coronaire dans l'air. Bien que les flacons doivent être hermétiquement fermés et tout le 14 CO 2 doivent être pris au piège dans le hyamine d'hydroxyde, il est recommandé d'effectuer cet essai sous la hotte chimique.
7. Détermination de Myocardial oléate Oxydation Tarifs
Remarque: La méthode est basée sur la séparation et la récupération quantitative de 3 H 2 O dans l'effluent coronaire en utilisant une résine échangeuse d'anions forte. Contrairement à la récupération de 14 CO 2, il n'y a pas de problème de stabilité de l' échantillon et l'effluent coronaire peut être conservé sur la glace ou stocké dans le congélateur avant d' effectuer le test.
- Préparer des colonnes de résine échangeuse d'anions (par exemple une colonne + two colonnes supplémentaires pour la détermination de l'activité de fond) en remplissant la pointe des tubes de seringue 3 ml avec de la laine de verre. Ajouter la suspension de résine / eau avec une pipette de transfert jusqu'à ce que la résine atteigne la marque de 2 ml sur le tube de seringue.
- Laver la résine en faisant passer 2 ml d'eau ultrapure à travers la colonne. Répétez cette étape deux fois plus.
- Placez des flacons de scintillation ouverts sous les colonnes et charger 0,5 ml d'effluent coronaire par colonne. Charger 0,5 ml de tampon de perfusion pour la détermination de l'activité de fond.
- Laver les colonnes successivement avec 0,5, 1 et 2 ml d'eau ultrapure. Une fois l'élution se fait, jeter les colonnes dans un conteneur de déchets radioactifs étiquetés de manière appropriée.
- Ajouter cocktail de scintillation 13 ml de liquide par flacon à scintillation. Ajouter 0,5 ml de tampon de perfusion directement à deux flacons remplis avec 13 ml d'un cocktail de scintillation liquide pour la détermination de l'activité spécifique. Agiter les flacons vigoureusement et attendre au moins 6 heures avant de mesurer dans un sci liquidentillation contre convenablement mis en place pour des expériences sur l'étiquette double.
8. calculs
- Si pas déjà fait, de déterminer le poids humide de l'ensemble perfusé cœur.
NOTE: Ne laissez pas le tissu congelé à décongeler si les analyses moléculaires et biochimiques doivent être effectuées ultérieurement sur le tissu restant. - Déterminer le poids humide d'un échantillon de tissu de l'ensemble perfuse-coeur (utiliser environ 15 à 30% de l'ensemble du coeur). Placer l'échantillon de tissu dans un four réglé à 50 ° C pendant la nuit et de mesurer son poids sec. Utilisez le poids humide / poids sec de l'échantillon de tissu pour déterminer le poids sec de tout le cœur en grammes (g de poids sec.).
- Pour chaque point x de temps exprimer la valeur de coronariennes CF d'écoulement x en ml / min.
- Détermination de la vitesse d'oxydation du glucose
- Moyenne , les deux désintégration / min (dpm) les valeurs mesurées pour l'activité de fond de 14 C à détermiNE le facteur de correction 14C dpm ba.
- Déterminer le 14 C la valeur de l' activité spécifique 14C dpm sa moyenne.
- Déterminer la radioactivité spécifique du glucose dans dpm / pmol (F Glu) en appliquant la formule
REMARQUE: où n Glu (pmol) = C - Glu (pmol / L) * volume de l' échantillon (L) = 2,5 lors de l' utilisation du glucose à 5 mmol / L et un échantillon de 0,5 ml. - Déterminer pour chaque point x le taux de production de 14 CO 2 en dpm / min (A) de temps en appliquant la formule
NOTE: Lorsque Vol x (ml) = 0,5 - Diviser A par la valeur déterminée du poids du cœur sec pour obtenir le taux normalisé de production de 14 CO 2 (A Norm
- Appliquer la formule GO = A Norm / F Glu pour obtenir le taux d'oxydation du glucose (GO) en pmol de glucose / min par g de poids sec.
- Détermination du taux d'oxydation oléate
- Calculer la moyenne des dpm / min (deux) , les valeurs mesurées de désintégration pour l'activité de fond de 3 H pour déterminer le facteur de correction 3H dpm ba.
- Déterminer la 3 H valeur de l' activité spécifique 3H dpm sa moyenne.
- Déterminer la radioactivité spécifique de l' oléate en dpm / pmol (F Ol e) en appliquant la formule
NOTE: Lorsque n Ole (pmol) = C Ole (pmol / L) * volume d'échantillon (L) = 0,2 en utilisant oléate à 0,4 mmol / L et un échantillon de 0,5 ml. - Déterminer pour chaque time point x le taux de production de 3 H 2 O en dpm / min (B) en appliquant la formule
NOTE: Lorsque Vol x (ml) = 0,5 - Diviser B par la valeur déterminée du poids du cœur sec pour obtenir le taux normalisé de production de 3 H 2 O (B Norm) en dpm / min par g de poids sec.
- Appliquer la formule OO = B Norm / F Ole pour obtenir le taux d'oxydation de l' oléate (OO) en pmol d'oléate / min par g de poids sec.
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Representative Results
Deux expériences représentatives sont décrites dans les figures ci-dessous. Dans les deux cas, le coeur d'un homme âgé de 16 semaines chez le rat Sprague Dawley a été isolé et perfusé dans le mode de fonctionnement avec un tampon KH préparé selon le protocole précédent. Dans chaque expérience, le cœur a été soumis à une condition de stress pour affecter le travail cardiaque. la fonction contractile cardiaque a été évaluée par enregistrement continu de la pression d'impulsion par l'insertion d'un transducteur de pression dans la conduite aortique et par la détermination de la puissance cardiaque. Les conséquences de chaque état de contrainte sur l'utilisation de l'énergie fournissant des substrats ont été simultanément déterminées par la mesure des taux de glucose et de l'oxydation de l'oléate.
Dans la première expérience, une augmentation aiguë de la charge de travail a été simulée après 20 min perfusion à la charge de travail quasi-physiologique en augmentant la postcharge de 40% (réalisé par la mainélévation de la chambre de trop-plein de l' aorte) , et en ajoutant de l' épinéphrine (1 pmol / L) dans le tampon de perfusion (figure 3A). La fréquence cardiaque, qui peut être déterminé en mesurant l'intervalle entre les valeurs de la pression systolique de pointe sur la courbe de pression d'impulsion, immédiatement augmenté de plus de 50% lors workjump induction (figure 3B). Puissance cardiaque a augmenté de plus de 40% à workjump, qui a été accompagnée d'une augmentation des taux de glucose et de l' oxydation de l' oléate (figure 3C). Les résultats montrent que, sous la pression d'une forte augmentation de la charge de travail, le cœur s'adapte rapidement pour augmenter la production d'énergie pour la contraction à la fois le glucose et l'oxydation des acides gras. Cependant, l'augmentation relative du taux d'oxydation était plus important pour le glucose (~ 2,8 fois) qu'elle ne l'était pour oléate (~ 1,3 fois). Le recours accru aux glucides oxydation pour faire face à la charge de travail supplémentaire est une caractéristique typique du coeur mammalienne pression surchargé 18
Dans la deuxième expérience, le coeur est perfusé dans les conditions de base pendant 20 min puis 15 min au total, l' ischémie normothermique globale (induite par la fermeture à la fois l'oreillette et les lignes de l' aorte) , et 30 minutes de reperfusion (figure 4A). Dans ces conditions expérimentales, une pression quasi normale a été rétablie impulsion comprise entre 2 et 3 minutes après le début de la reperfusion (figure 4B). Puissance cardiaque a augmenté rapidement au- dessus des valeurs pré-ischémie pendant les 10 premières minutes de reperfusion avant de retomber à des valeurs quasi-référence (Figure 4C). Par rapport à la ligne de base, le taux d'oxydation de l'oléate a augmenté pendant la reperfusion alors que l'oxydation du glucose retourné rapidement à des niveaux ischémiques pré. En mesurant simultanément la fonction contractile et les taux d'oxydation du substrat on peut clairement comprendre que, dans les conditions expérimentales présentes, la variation des taux de protoxyde d'acide grasation est le principal déterminant des changements dans la quantité de travail produite à reperfusion. Le commutateur supérieur vers l' acide gras d' utilisation après l' ischémie est une caractéristique bien estalished du cœur reperfusé 19.
Figure 1:. Schéma simplifié du coeur isolé de rat Appareil de travail de la mémoire tampon de Krebs-Henseleit additionné de la solution de BSA acide gras est oxygéné en passant à travers un oxygénateur à membrane. précharge et postcharge valeurs cardiaques typiques pour un coeur de rat perfusé dans des conditions quasi-physiologique sont indiqués. Les paramètres peuvent être modifiés en ajustant les hauteurs du réservoir auriculaire et la chambre de trop-plein aortique. Les tubes de seringues graduées ont été placés sous la chambre cardiaque et la chambre de débordement de l'aorte afin de mesurer le débit coronaire et le débit aortique, respectivement. L'écoulement dele tampon peut être arrêté (lorsque l'on mesure les flux aortique et coronarien) ou réacheminé (lors du passage du Langendorff au mode de fonctionnement) par l'utilisation de trois voies robinets d'arrêt. Les flèches rouges indiquent le positionnement optimal en ligne microlelectrodes d'oxygène pour déterminer la différence d'oxygène "artérioveineuse." En ligne des sondes d'écoulement et des capteurs de pression peuvent être placés dans les lignes de précharge et postcharge pour mesurer les débits et pressions (flèches vertes) écoulement auriculaire et de l'aorte. les pressions et les volumes ventriculaires gauche peuvent également être enregistrées avec un cathéter PV inséré à travers la pointe du ventricule gauche. Non indiqué sur la figure est la chemise d'eau entourant tous les éléments de verrerie et de la tubulure de perfusion dans la couleur bleu foncé. Ces éléments chemisé d'eau sont tous connectés en série par l' intermédiaire d'un tube à un bain d'eau circulant réglé à 37 ° C. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de tsa figure.
Figure 2:. La représentation des différentes étapes de l'installation du piège CO 2 (A) Ajouter 1 ml de 10x concentrée d' hydroxyde de hyamine. (B) Ajouter un échantillon de 0,5 ml contenu dans un tube de capless. (C) Sceller le flacon. (D) Injecter 200 ul d'acide perchlorique (60% w: w%). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Les résultats représentatifs d'une expérience Workjump (A) l' enregistrement en continu de la pression pulsée.. (B) court enenregistrement représentant l'intervalle de changement de la pression d'impulsion au moment de l'initiation workjump. (C) les taux cardiaques de l' oxydation du glucose (trace rouge avec des cercles) et de l' oxydation de l' oléate (trace bleue avec des carrés) ont été déterminées par analyse de l'effluent coronaire à un intervalle de 5 min. Puissance cardiaque (trace noire avec des triangles) a été déterminée par la mesure du débit cardiaque en même temps les échantillons d' effluents coronaires ont été récupérés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Les résultats représentatifs d'une expérience Ischémie-reperfusion (A) l' enregistrement en continu de la pression pulsée.. (B) intervalle d' enregistrement court représentant la récupération de la fonction contractile dusonner les 5 premières minutes de reperfusion. (C) Taux cardiaques d'oxydation du glucose (de trace rouge avec des cercles) et de l' oxydation de l' oléate (trace bleue avec des carrés) ont été déterminées par analyse de l'effluent coronaire à un intervalle de 5 minutes, sauf pendant les 5 premières minutes de reperfusion où des analyses ont été effectuées à un intervalle de 1 min. Puissance cardiaque (trace noire avec des triangles) a été déterminée par la mesure du débit cardiaque en même temps les échantillons d' effluents coronaires ont été récupérés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le protocole précédent décrit en détail les méthodes pour quantifier simultanément le flux du substrat à travers l'oxydation du glucose et de l'oxydation des acides gras dans le coeur de rat isolé de travail. Les mesures peuvent ensuite être superposées aux paramètres fonctionnels cardiaques enregistrés pour déterminer la relation entre les substrats du métabolisme et du travail cardiaque sous base et le stress des conditions (changement dans la charge de travail, l' ischémie-reperfusion, etc ...). Il est également possible d'évaluer la façon dont la relation métabolisme / contraction est affectée par les conditions préexistantes telles que l'insuffisance cardiaque et le diabète. En outre, le coeur de rongeurs génétiquement modifiées peuvent être utilisées pour interroger l'effet d'une protéine spécifique sur le métabolisme et la fonction cardiaque. Enfin, l'effet des médicaments et d'autres facteurs qui circulent sur ces paramètres peuvent être testés individuellement. Étant donné que le flux de glucose par glycolyse ne pas toujours en corrélation avec la vitesse d'oxydation du glucose, il peut être informative de suivre les taux de flux de glucose à travers les deux voies dans un cadre expérimental unique.
Les taux de glycolyse peuvent être déterminées en ajoutant [5- 3H] glucose dans le tampon de perfusion, puisque la libération de 3 H 2 O est déterminée par l'activité de l'étape d'énolase de la glycolyse 20. En variante [2- 3 H] glucose, ce qui conduit à la production de 3 H 2 O à l'étape phosphoglucose isomérase de la voie glycolytique, peut être utilisé pour interroger les taux de captage du glucose par le muscle cardiaque 16,17,21. La possibilité de choisir parmi plusieurs traceurs radiomarqués pour enquêter sur le sort de glucose à différents niveaux de son catabolisme est un autre exemple de la polyvalence de la technique. Cependant, parce que toutes les mesures des flux reposent sur la récupération quantitative de l' une 3 H 2 O ou CO 2 14 de l'effluent coronaire, seuls deux radiomarqueurtraceurs (ed une 3 H étiquetée et l'autre marqué avec 14 C) peut être utilisé dans le tampon de perfusion à la fois.
considérations méthodologiques
Il y a des limites inhérentes à la mesure du flux métabolique cardiaque et la fonction en utilisant ce protocole. Bien que l'utilisation d'un tampon KH permet un contrôle total sur la composition du perfusat, la pertinence physiologique de cette installation expérimentale peut être discutable. Tout d' abord, l'utilisation d'une solution cristalloïde sur le sang est connu d'avoir un impact négatif sur l' hémodynamique cardiaque et la résistance à l' ischémie 22,23. Deuxièmement, le tampon de perfusion, nous décrivons ici manque une variété d'hormones et de nutriments qui peut directement moduler le métabolisme cardiaque et par conséquent un impact sur la réponse du coeur à un état de stress simulé. En effet, le coeur de mammifère est un omnivore métabolique et peut, en plus de glucose et d'acides gras, utiliser d'autres substrats à fulfill ses besoins énergétiques (lactate, pyruvate, corps cétoniques, à chaîne ramifiée acides aminés). Il y a des preuves croissantes que certains de ces substrats jouent un rôle important dans le remodelage métabolique du cœur malade 24,25. Il est tout à fait possible pour le chercheur d'ajouter ces substrats à la mémoire tampon de perfusion, de moduler leur concentration afin d'imiter plus étroitement les différentes conditions physiologiques (par exemple , l' état alimenté par rapport à l' état à jeun) états ou de maladies, et de suivre leurs taux d'oxydation en utilisant le traceurs radiomarqués appropriés 26,27. Le métabolisme des triglycérides peut également être tracée, et dans ce cas, il est recommandé d'éviter l'utilisation de l'héparine avant l'excision du coeur, car cela va entraîner la libération de la lipoprotéine lipase de l'endothélium et de diminuer significativement l'extraction de triglycérides à partir du tampon 28. Avec une sélection rigoureuse des traceurs radiomarqués, l'incorporation de la radioactivité dans varmétabolites de tissus diffé- peuvent également être mesurés après perfusion afin de déterminer des paramètres tels que la synthèse de novo de triglycérides, le chiffre d' affaires du glycogène, ou les taux de synthèse des protéines 18,29,30. En d'autres termes, l'enquêteur peut travailler avec une grande variété de substrats / hormones combinaisons et concentrations. Le choix de la composition de tampon dépendra essentiellement sur les objectifs de l'expérience. Parce que ces conditions de tampon contrôlées créent un modèle physiologique "simplifié", les résultats de l' ex vivo de travail expériences de perfusion cardiaque doivent être interprétés avec prudence et , si possible , les données doivent encore être validés in vivo.
Le choix de l'anesthésique
L'anesthésique utilisé sur des rats avant l'excision du coeur doit être soigneusement sélectionné en fonction de ses effets connus sur la fonction cardio-respiratoire et le métabolisme pour assurer que ce ne sera pas interférer avec l'expérience à effectuered. Les deux anesthésiques injectables et inhalés induisent rapidement une hyperglycémie et des degrés variables de l' intolérance au glucose qui peut affecter le métabolisme cardiaque pendant la perfusion 31,32. Par rapport à d' autres agents, les effets à court terme de barbituriques (pentobarbital et thiobutabarbital) sur l' homéostasie du glucose sont relativement négligeables 31. Cependant, intrapéritonéale pentobarbital anesthésie préalable à cœur l' excision a été montré pour diminuer le débit cardiaque, altérer la fonction ventriculaire gauche, et d' augmenter le lactate libération du myocarde chez un ex vivo protocole d'ischémie-reperfusion 33. L'effet inotrope négatif que pentobarbital a sur le coeur isolé de rat est suggéré d'être causé par l' accumulation de tissus de la drogue 34. Inversement , l'utilisation d'anesthésiques inhalés, qui sont plus rapidement lavés à partir du tissu cardiaque, est associée à une meilleure fonction contractile ex vivo 33. Les anesthésiques volatils peuvent effectivement fournir des cardioprotection pendant une ischémie-reperfusion par le biais d' un mécanisme impliquant l'ouverture des canaux K ATP mitochondriaux et une liaison accrue de l' hexokinase 32 mitochondriale. En résumé, le type d'anesthésique utilisé dans un travail de protocole cardiaque de perfusion isolée est une variable importante dans l'évaluation des paramètres à la fois fonctionnels et métaboliques qui peuvent influer directement sur les résultats de l'expérience. Par conséquent, le type et la dose de utilisée anesthésique doivent toujours être signalés dans la section des méthodes d'une expérience, et ces paramètres ne doivent pas être modifiées entre les expériences qui sont destinés à être comparés.
Radioisotopes à coeur perfusion
Toutes les mesures de flux réalisées avec le protocole précédent sont effectuées dans le mode de non-remise en circulation, ce qui signifie que l'effluent coronaire est mis au rebut au lieu d'être renvoyé vers le réservoir tampon (figure 1). L'enquêteur peut plutôtchoisir d'utiliser l'appareil de perfusion dans le mode de remise en circulation, ce qui présente l'avantage de nécessiter un volume beaucoup plus faible de tampon et, partant, la radioactivité à fonctionner. Cependant, le recyclage de l'effluent coronaire compromet la composition de l' état d' équilibre du tampon de perfusion à travers la récupération de sous - produits provenant de l'activité métabolique du cœur (y compris le lactate, mais aussi 3 H 2 O et H 14 CO3-), ce qui complique la détermination de les flux métaboliques et peuvent même modifier la fonction cardiaque au fil du temps 35. Ces problèmes sont évités dans le mode de non-remise en circulation. En raison de la quantité de radioactivité et du grand volume de tampon de perfusion utilisé dans une expérience unique, l'enquêteur doit être particulièrement prudent lors de l'utilisation du travail cardiaque de rat dans les analyses des flux métaboliques. Lors de l'utilisation d'un appareil de perfusion pour la première fois, il est recommandé d'effectuer plusieurs expériences simulées avec un tampon non radioactif de se familiariser avec ledifférentes étapes du protocole et avec les procédures de sécurité. Le montage du cœur sur les canules est une étape particulièrement sensible car il faut établir un contact étroit avec l'appareil et parce que le tampon peut fuir ou de tirer à partir de l'un des vaisseaux sanguins sectionnés du cœur. Le dispositif de perfusion décrit par Taegtmeyer et ses collaborateurs 11 présente l'avantage d'inclure un réservoir de Langendorff qui est totalement indépendant du reste de l'appareil de perfusion, et peut donc être rempli avec du tampon KH non radioactif pour éviter tout déversement de matière radioactive au cours de la canulation du cœur . Quel que soit le système utilisé, les expériences doivent être effectuées dans un espace dédié avec un accès restreint. La salle devrait inclure un évier et un approvisionnement d'eau ultrapure pour effectuer la préparation et le nettoyage de l'équipement contaminé tampon dans la même zone. Les chercheurs devraient travailler en étroite collaboration avec le bureau de sécurité de rayonnement de leur institution pour établir spécifique confinement, le contrôle et les procédures de décontamination.
Le nettoyage de l'appareil de perfusion
Le poste de nettoyage expérimental de l'appareil de perfusion est une étape critique qui est trop souvent négligé et, sinon exécuté avec soin, responsable de la plupart des problèmes liés à une mauvaise reproductibilité expérimentale. Le tampon de perfusion riche en éléments nutritifs et la température élevée du système de perfusion présentant des conditions idéales pour la croissance bactérienne et fongique. L'utilisation de protéines (insuline, BSA) et des acides gras dans le tampon de perfusion ajoute un autre degré de complexité à la procédure de nettoyage parce que ces composés vont coller à la surface du tube et de la verrerie, ce qui les rend difficiles à débusquer de l'appareil. L'utilisation de radioisotopes également imposer des contraintes supplémentaires telles que la création d'une zone de confinement dédié au laboratoire pour la manipulation de l'équipement et de l'élimination d'un solide contaminéd déchets radioactifs liquides. Par conséquent, la procédure de nettoyage adéquat dépendra essentiellement à la fois la composition du tampon de perfusion et le type d'appareil de perfusion utilisé. Si vous utilisez un appareil commercial, consultez le site Web du fabricant ou contacter le service à la clientèle pour obtenir des informations sur la façon d'effectuer un nettoyage sans endommager l'un des composants de l'appareil. D'une manière générale, toutes les pièces de verrerie et de plastique peuvent être lavés avec une large gamme de savons. détergents alimentés Enzyme-actifs sont particulièrement utiles pour éliminer les résidus d'acide gras-BSA. La plupart des contaminants seront éliminés en exécutant HCl 0,1 M ou 0,1 M , de HNO 3 à travers l'appareil pendant plusieurs heures. Nous obtenons des résultats de nettoyage satisfaisants en rinçant le système d'abord avec HCl 0,1 M, puis avec un nouveau 1% (p: v) une solution de détergent à moteur enzyme-actif préparé dans l'eau chaude, et enfin en rinçant le système avec de l'eau ultrapure. Lors de l'utilisation d'un appareil de perfusion sur mesure que celle à l'origine described par Taegtmeyer et ses collaborateurs 11, il peut être plus facile et plus efficace de démonter complètement l'appareil à la fin de chaque jour expérimental. La verrerie est nettoyé par une immersion de 15 minutes dans un bain concentré d'un mélange d'acide chromique et d'acide sulfurique. Les pièces en plastique et le tuyau en PVC peut être lavé avec un détergent sans résidus. Nous avons trouvé qu'il est plus rapide et plus fiable pour remplacer entièrement le tube PVC tous les jours, car elle limite la manipulation du matériel contaminé par des radiochimiques et parce qu'il évite de laisser des résidus d'agents de nettoyage derrière. Dans tous les cas, l'enquêteur doit appliquer les règles suivantes: 1- Nettoyer l'appareil de perfusion et tout l'équipement sale immédiatement après avoir terminé l'expérience de perfusion. Attente ne fera que rendre le nettoyage consommant plus difficile et plus. 2- Vérifier le bain de circulation du système de veste de l'eau régulièrement pour contaminations. Utilisation d'un conditionneur d'eau va augmenter l'intervalle entre les cpenchant du bain d'eau. 3- Après le nettoyage, rincer soigneusement toute la verrerie et de tubes avec de l'eau du robinet plusieurs fois et terminer le rinçage avec de l'eau ultrapure pour éliminer les résidus de produits de nettoyage. 4- Deux préparations de coeur défaillant consécutivement lorsque la dissection a été soigneusement exécutée et le tampon de perfusion préparée avec soin sont susceptibles d'indiquer une contamination de l'appareil (que ce soit par des bactéries ou par des résidus de solvant). Si cela se produit, le lavage et le rinçage des procédures doivent être entièrement répétées.
Mise à l' échelle vers le coeur de la souris
Bien que le protocole précédent se concentre sur la détermination des taux métaboliques dans un coeur de rat isolé de fonctionnement, les mêmes procédures peuvent être appliquées sur le cœur de souris avec quelques modifications à l'appareil de perfusion et l' équipement d' acquisition de données 36. En raison de sa petite taille le coeur isolé de la souris de travail est techniquement plus difficile, mais en raison de sa manière significativedébit plus faible, il a l'avantage de nécessiter un volume beaucoup plus faible de tampon de perfusion. Le grand nombre de modèles de souris génétiquement modifiées qui sont déjà disponibles rend également le coeur isolé de la souris de travail très attrayant pour étudier la fonction d'un produit d'un seul gène sur métabolisme cardiaque et le remodelage fonctionnel. Cependant, les récentes avancées technologiques dans l'édition du génome et un catalogue en croissance rapide des rats transgéniques et knockout ferment rapidement l'écart entre les deux espèces de rongeurs. En outre, le rat a longtemps été salué comme un modèle animal supérieur d'enquêter sur les maladies cardiovasculaires , car sa physiopathologie imite étroitement les conditions humaines 37. Pour ces raisons, nous pensons que le coeur isolé de rat travaille toujours tenir une place importante dans l'ère moderne de la recherche cardiovasculaire.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100 - 200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100 - 200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10x Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 ml Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 ml HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
References
- Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
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