Abstract
哺乳類の心臓は、ATPの主要な消費者であり、収縮のためのエネルギー基質の一定の供給を必要とします。驚くことではないが、心筋の代謝の変化は、収縮機能障害および心不全の発症に関連しています。したがって、代謝と収縮の間のリンクを解明する疾患状態における心臓の適応や不適応を支配するメカニズムの一部に光を当てる必要があります。単離された作業ラット心臓調製物は、同時に、リアルタイム、心収縮機能および酸化的代謝経路に基質を提供し、エネルギーのフラックスで、追跡するために使用することができます。現在のプロトコルは、グルコースおよび脂肪酸、心臓の基板を提供する主要なエネルギーのための酸化の速度を定量的に測定するための緩衝剤の調製及び利用において使用される方法の詳細な説明を提供することを目的とします。サンプル分析およびデータ解釈のために使用される方法も議論されています。簡単に言えば、この技術は、ex vivoでの14 C-放射性標識グルコースおよび3 H-放射性標識長鎖脂肪酸の供給に基づいて正常体温晶質灌流を介して心臓の鼓動。14 CO 2及び3 H 2 Oの端副産物基板を提供するこれらのエネルギーの利用に関与する酵素反応は、その後、定量的冠動脈流出物から回収されます。使用される放射性標識基質の比活性の知識によれば、個々の酸化経路におけるグルコースおよび脂肪酸のフラックスを定量することが可能です。単離された心臓の収縮機能は、適切な記録装置と並行して決定され、直接代謝フラックス値に相関させることができます。技術は、前および負荷および虚血、薬物またはcircula後の変更などの様々なストレス条件に応答して、代謝/収縮の関係を研究するために極めて有用ですティン因子、または遺伝子産物の発現の変化を以下。
Introduction
臨床的関連
哺乳類の心臓では、酸化的代謝経路、ATP生成と心仕事1を介して基板のフラックスとの間には強い正の相関があります。過去20年間、心臓の代謝と機能との間の複雑なリンクの調査は心臓代謝の変化は、収縮不全と心臓病2-4の異なるタイプの設定で可能性の病理学的構造の再構築のための原因であることを認識することがつながっています。したがって、ストレス、心臓の代謝リモデリングを支配するメカニズムの理解が心不全5-7の予防または治療のための治療標的の同定につながることが期待されます。 「心臓代謝の評価」に関する米国心臓協会（American Heart Association）からの科学的声明の最近の刊行物はトンのための科学界の関心の高まりを強調します研究8の彼のフィールド。心臓イメージングの技術進歩は今、心形態および機能の迅速かつ正確な評価を可能にしながら、しかし、心臓代謝のin vivoでの研究は限られており、負担のまま：核磁気共鳴（NMR）分光法およびポジトロン放出断層撮影（PET）イメージングはできますエクスビボこの日付.TO 9定常状態での心臓の高エネルギーリン酸代謝及びクレブス回路のアクティビティを追跡するために使用されるが、これらの技術は、高い運用コストによって、および酸化的代謝に様々な基板の寄与を決定することができないことに悩まされています心の準備作業は、酸化的代謝経路7,9に基板の唯一かつユニークな研究に利用可能な技術、同時にかつリアルタイムで、収縮機能とフラックスを表します。以下のプロトコールは、ラットを決定するために使用される試薬の調製および使用のガイドラインを提供することを目的と孤立した作業ラット心臓における基質利用のエス。
分離されたワーキングげっ歯類ハート装置
技術は、ほぼ半世紀の古いですが、孤立した作業ラットの心臓の準備は、心血管研究のための選択の方法のまま。ランゲンドルフ心臓標本と同様に、作業げっ歯類の心臓は神経ホルモン、他の器官、および他の循環要因の交絡影響から独立して心臓パラメータの広い範囲を測定するための比較的簡単で信頼性が高く、安価な方法を提供しています。しかし、ランゲンドルフ灌流心臓とは対照的に、作業の心臓は、近生理学的な心臓の仕事、in vivoの条件に関連するレベルへの酸化代謝フラックスを生成するための前提条件を実行し続けています。この左心房に接続されたカニューレを介して左心室（LV）に潅流緩衝液を提供することによって達成され、LVがいっぱいとの契約としてされ、バッファは、決定された後負荷静水圧に対する大動脈ラインを介して排出されます。もともとニーリーや同僚10によって記述灌流装置の設計は、その後Taegtmeyer、HEMSとクレブス11によって改善されたが、それ以来はほとんど変更されています。元の装置で説明したように、収縮機能は、心拍出量の決意、メスシリンダーよりも多くを使用していないと大動脈と冠状動脈の流れ10,11を測定するためのストップウォッチを介して評価することができます。いくつかのベンダーは現在、完全な作業げっ歯類心臓灌流システムを提供しています。これらの市販の装置はflowprobes、圧力変換器、圧力 - 容積カテーテルと心臓機能データの取得および分析のために必要なすべての機器を用いて取得することができます。ベンダーは、自社の機器を持つ新しいユーザーを理解するために大規模なドキュメントやトレーニングセッションを提供します。また、いくつかの総説論文の作業心臓instrumに詳細プロトコルentationおよびげっ歯類12-15で心機能を測定するためのカテーテルの使用に関する。この理由のため、我々は簡単に潅流装置と記録装置のセットアップを言及します。現在のプロトコルではなく、同時に2つの主要なエネルギーは、正常な心臓で基質を提供し、グルコースの速度と長鎖脂肪酸酸化を測定するために実施することができる方法の説明ですでに利用可能な情報を補完することを目指しています。私たちは、サンプルの回収および処理するための試薬および緩衝液の調製から、データ分析のために、心筋の酸化的代謝の評価のための放射性標識されたエネルギー基質の利用に関わるすべての手順ここで説明します。
法の原則
心筋細胞は、（脂肪酸（主に長鎖脂肪酸）および炭水化物の酸化的リン酸化からの収縮のためのエネルギーの大部分を生成glucoseおよび乳酸）。心は非常に限られた精力的な埋蔵量を有しており、循環から基板を提供するこれらのエネルギーの安定供給に依存しています。解糖経路を介したグルコースの異化は、その後、ミトコンドリア内膜のピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体によって脱炭酸さピルビン酸を生成します。アルブミンまたはリポタンパク質トリグリセリドの循環から抽出された長鎖脂肪酸は、第一の細胞質ゾル中のアシル-CoA分子に活性化し、続いてβ酸化経路を入力するカルニチンシャトルを介してミトコンドリアのマトリックスの内部に搬送されます。グルコースおよび脂肪酸の異化作用によって生成されるアセチル-CoA分子は、ミトコンドリア内膜を横切ってプロトン起動力を構築する電子伝達系によって使用される還元当量（NADH及びFADH 2）を生成するクレブス回路を燃料とATP合成酵素の活性を介してATPを生成します。水および二酸化炭素は、端副生成物でありますクレブス回路の内部で起こっている酵素反応。 14 C-及び3 H-放射性標識された基質の供給を単離し作業心臓に（例えば14 C放射標識グルコースおよび3 H放射性標識オレイン酸のような）その結果、14 CO 2及び3 H 2 Oの生成をもたらすであろうことができます定量的冠動脈流出物から回収されます。 14 CO 2の回収は、密封されたチャンバー内に単離された灌流心を保つことによって、それが心を出るときに、すぐに冠動脈流出物を回収することによって行われます。小さな陰イオン交換カラムは、冠状動脈流出物から3 H 2 Oを分離し、回収するために使用されます。処理されたサンプルからの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定し、そして使用される放射性標識基質の比活性の知識を持って、それを個別におけるグルコースおよび脂肪酸のフラックスを定量することが可能です酸化は16,17の経路。
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Protocol
注：すべての動物の手順はヒューマンケアと動物の使用に関するNIH公衆衛生局・ポリシーに従って行われたとミシシッピ大学医療センターの施設内動物管理使用委員会によって承認されました。放射性同位元素の使用を含むすべての手順は、ミシシッピ大学医療センターの放射線安全事務所によって設定されたガイドラインに従って承認され、実施されました。
ストック緩衝溶液および試薬の調製
- クレブス - ヘンゼライト（KH）緩衝原液
- （モル/ Lで）を含む20倍濃縮された塩ストック溶液2Lの2.37のNaCl、0.0948のKCl、0.0236 KH 2 PO 4、および0.0236のMgSO 4 * 7H 2 Oを準備までの1ヶ月間室温で孔径0.45μm濾過ユニットとストアでフィルタリングします。
- NaHCO 3の20倍濃縮された（0.5モル/ L）の溶液2 Lを準備します。解決策は、することができます無期限に室温で保存。
- CaCl 2の1モル/ Lの原液250ミリリットルを準備します。までの1ヶ月間室温で孔径0.45μm濾過ユニットとストアでフィルタリングします。
- 塩化フォームから水酸化物形態の陰イオン交換樹脂の変換
- 1Lの超純水に再懸濁することにより、陰イオン交換樹脂を洗浄します。樹脂が落ち着くと過剰の水を注ぐことを許可します。このステップを4回繰り返します。
- フィルタリングフラスコに取り付けられたガラスの微量分析真空フィルタホルダ内の樹脂を注ぎます。
- ゆっくりと1NのNaOHの22容積を通過することにより、水酸化物形態に樹脂を変換します。ステンレス製のへらで断続的にスラリーを混ぜます。
- pHが9.0を下回るまで超純水で樹脂を洗浄します。樹脂スラリーの表面付近のpH試験片を浸漬することにより、定期的にpH値をチェックしてください。 BOに超純水で樹脂をカバーし、保存rosilicateガラス瓶、光から保護します。樹脂は、使用前に乾燥させないでください。
注：適切に保存されている場合には、樹脂は、少なくとも3ヶ月持続します。
- オレイン酸 - アルブミン8倍濃縮原液
- 4Lの三角フラスコに、20倍濃縮された塩ストック溶液200ml及び3.6 Lの超純水で20倍濃縮のNaHCO 3溶液200mlを混合します。
- フリットシリンダとガス分散チューブを使用して、pH値を安定させるために二酸化炭素の混合物5％と酸素95％で15分間この溶液をガス。
- 470ミリリットルを1 Lのガラスビーカー内で緩衝液を注ぎます。 4Lの三角フラスコ内に残存する3530ミリリットルバッファに1モル/ LのCaCl 2ストック溶液8.75 mlおよび設定はさておき加えます。
- 1 Lのガラスビーカーに脂肪酸を含まないBSAを40gを加え、溶解するまで撹拌棒で撹拌しました。
- 超純水中のエタノール溶液：15ミリリットルの円錐管では、50％（V V）の4ミリリットルを準備します。 487ミリグラムsodiuを追加します。粉末までメートルオレイン酸と渦が完全に溶解されます。
注：一部の研究者は、灌流緩衝液にパルミチン酸の代わりにオレイン酸を使用しています。パルミチン酸 - アルブミン原液を同じ手順に従って調製することができます。しかし、パルミチン酸ナトリウムの完全な可溶化を達成するために、70ºCで溶液を温めることをお勧めします。 - 一定の撹拌下に脂肪酸フリーのBSA溶液にオレイン酸溶液を滴下して加え、形成するオレイン酸-BSA複合体のために10以上の分を待ちます。
注：ソリューションが淡黄色の色を持っているし、目に見える粒子を欠いているでなければなりません。沈殿物または不溶性粒子の存在は、BSAに対する脂肪酸の不完全な結合を示すことがあります。この問題が発生した場合、溶液を廃棄しなければならないとプロセスが再びやり直します。
注：ピペットで放置すると滴下することができない場合にパルミチン酸が沈殿します。 BSAの撹拌溶液にバインディンを容易にするために、37ºCで加温してもよいですパルミチン酸のG。 BSAの変性および凝集を引き起こす可能性があり、このように過熱しないでください。
注意：このプロトコルの次のステップは、放射性物質の操作を伴います。適切なPPEを着用し、施設の放射線安全事務所によって設定された安全性と廃棄物処理条例に従ってください。 - オレイン酸-BSAの撹拌溶液に160μlの（0.8 MCI）[9,10- 3 H]オレイン酸を加え、さらに10分間攪拌します。
- オレイン酸-BSAの撹拌溶液に1モル/ LのCaCl 2ストック溶液2.5ミリリットルを追加します。
- 約1.2メートル透析膜チューブをカットし、水道水で内側と外側の両方にすすいでください。膜のグリセロールコーティングを除去するために10〜15分間水道水で激しく透析チューブをスクラブ。また、使用前に1時間、暖かい水に透析チューブを浸漬することによりコーティングを除去。超純ウォートで透析チューブを洗浄することで完了rを。
- しっかり透析チューブの一方の端を縛ります。オレイン酸-BSA溶液で充填し、透析チューブのもう一方の端を縛ります。
- KHバッファの4 L三角フラスコに充填透析チューブを置き、攪拌棒で穏やかに攪拌下、4ºCで一晩透析することができます。
- 翌日、透析チューブから8倍に濃縮オレイン酸-BSA溶液を除去。 -20ºCで灌流またはアリコートとストアのすぐオレイン酸-BSA溶液を使用してください。凍結アリコートを、少なくとも2ヶ月間安定です。これはオレイン酸-BSA複合体の溶解性を損なう可能性があるように、複数の凍結融解の繰り返しは避けてください。
注：のみを使用し、超純水（25ºCで18.2MΩ.cmの抵抗率、全有機炭素は、<10 ppbで、微生物≤1 CFU / mlを、0.22μmの≤1/ mlのオーバーサイズの微粒子）は、試薬および緩衝液を調製し、心臓灌流のために使用されます。その塩化物から陰イオン交換樹脂のための変換水酸化物形態へのmは、追加費用で水酸化物形の直接購入することによって回避することができる（ 材料表を参照してください）。オレイン酸またはパルミチン酸の他に、天然に存在する脂肪酸の任意の他のタイプはまた、脂肪酸のトリチウム化バージョンはその酸化を追跡するために利用可能である限り、使用することができます。
灌流バッファーの調製
- 4Lの三角フラスコに、20倍濃縮された塩ストック溶液200ml及び3.6 Lの超純水で20倍濃縮のNaHCO 3溶液200mlを混合します。二酸化炭素の混合物5％と酸素95％で15分間溶液をガスし、次いで遊離Caの濃度を設定する2+ 2.5ミリモル/ Lに1モル/ LのCaCl 2ストック溶液10mlを加えます。
注意：次の手順は、放射性物質の操作を伴います。適切なPPEを着用し、機関のRAによって設定された安全性と廃棄物処理条例に従ってくださいdiation安全オフィス。 - 2 Lホウケイ酸ガラスボトルに1.750 L KHバッファを転送します。 8倍の250ミリリットルは、オレイン酸-BSA溶液、1.802グラムのD-グルコース、0.4 U / mlで400μlのインスリン、および200μlの（0.2 MCI）[U- 14 C]グルコースを濃縮する追加します。混合するために、ボトルを反転。これは、オレイン酸（0.4ミリモル/ L）、D-グルコース（5ミリモル/ L）、およびインスリン（40μU/ ml）を含む完全な潅流バッファの2 Lを与えます。
注：2 Lの量は、少なくとも60分間、非循環状態で作業成体ラットの心臓を灌流するのに十分です。 - 2解剖皿を埋めるために非放射性KHバッファの一部を使用し、冷却するために氷の上に置きます。
灌流装置の調製
注：研究者は、このようなTaegtmeyer、HEMSとクレブス11、または商業的に利用可能なシステムの1によって説明したもののようにカスタムビルド灌流装置を使用するように選択することができます。潅流システムは、通常で構成されています以下の図1に記載の要素。チューブとガラス製品のほかに、記録装置の残りの部分は任意であり、その利用が求められている実験的な質問に対処するために、研究者のニーズに依存します。それにもかかわらず、我々は、バッファ入り中のO 2濃度を決定するために酸素微小電極の使用を推奨し、冠循環（ 図1）を出ました。これは、心臓が酸素の適切な量が供給される研究者の制御を助ける、および酸素供給は実験間で変化しないこと。また、「動」の酸素差の決意は、心筋酸素消費量及び心臓効率16,18を計算するために使用することができます。
- 循環水浴をオンにして、灌流装置を温めるために37ºCに設定してください。
- コンピュータとするデータ収集システムをオンにします心機能を測定するために使用することができます。
- データ収集システムへの記録装置（圧力カテーテル、圧-容積カテーテル、酸素微小電極、流量計など ）を接続し、製造元の指示に従って機器のキャリブレーションを行います。
- 超純水でバッファ容器を埋めます。蠕動ポンプの電源を入れ、システムを洗浄するために、すべてのチューブとガラス製品を通して水を洗い流します。蠕動ポンプの電源をオフにして、これは灌流緩衝液の濃度と心の準備に影響を与える可能性があるとして、水がチューブおよび/またはガラス製品に留まるないことを確認してください。
- システムに新しい1.0μmのガラス繊維フィルターを接続します。酸素供給室に二酸化炭素5％と酸素95％の混合物を含むガスのタンクを接続します。
注意：次の手順は、放射性物質の操作を伴います。適切なPPEを着用し、機関によって設定された安全性と廃棄物処理条例に従ってください放射線安全事務所。 - 灌流バッファーでバッファ容器を埋めます。ポンプの電源をオンにし、灌流緩衝液ですべてのチューブとガラス製品の充填を確保します。使用前に少なくとも30分間再循環モードと含酸素で灌流装置を介して灌流バッファを実行します。
- しっかりと冠状動脈流出液を回収するために、心臓の室の下に20ミリリットルの注射器のチューブを取り付けます。三方活栓のトップに注射器の先端を接続します。 3ミリリットルシリンジにサイドアームを接続します。液体放射性廃棄物用の容器にチューブを介して、下アームを接続します。
注：脂肪酸BSA複合体を使用する場合、これは溶液の過度の発泡を引き起こすように、灌流緩衝液の酸素化は、ガス分散管を直接バブリングにより行うことができません。膜型人工肺（ 図1）またはその目的のためにシートフロー酸素供給室を使用してください。非常に適切なレベルのOていることを確認することをお勧めしますF酸素は灌流回路（ 図1）の酸素微小電極を配置することによって達成されます。
4.ラット心臓の単離とカニューレ挿入
- 規模でラットを計量。
- 150ミリグラムの麻酔薬の投与量で注射器を準備/ 200 USP単位のヘパリンをチオブタバルビタールナトリウム塩の水和物とツベルクリン注射器をkgです。
- チオブタバルビタールIPを注入し、意識を失うために動物を待ちます。これは実験の目的を妨げないように、他の誘導剤は、（下のディスカッション セクションで麻酔薬の選択を参照してください）限り使用することができます。
- つま先ピンチ反射の欠如を確認することにより、麻酔の適切なレベルを確認してください。動物が処置中に痛みを感じていないことを保証するために、麻酔の適切な深さを維持することを確認します。
- ラットは、完全に無意識であり、手術台と秒に背の上に置き、つま先のピンチに応答しないいったんテープまたはピンとUREの手足。
- 髪の腹部自由をクリップし、腹部の正中切開を行います。まだこの時点では胸腔を開けないでください。下大静脈を明らかにすることはさておき、胃や腸を移動します。下大静脈に直接ヘパリンを注入し、先に進む前に5〜10秒待ってください。
- はさみを使用して振動板をカットし、胸郭の側面は、胸腔の内容を公開します。
- 微妙に親指、人差し指と中指の間に心をつかみ、一緒に心臓や肺の両方を切り出します。プロセスにおける大動脈弓と上行大動脈を損傷しないように注意しながら、下行大動脈のレベルでカットします。直ちに氷冷KH緩衝液で満たされた解剖皿の一つに心臓や肺を転送します。
- 心臓が鼓動を停止した後、第二解剖皿に移し、氷冷KHバッファに沈め心を保ちながら、添付の肺組織のいずれかの大部分を切り落とします。下降をカット右大動脈弓の上行大動脈をる。
注意：次の手順は、放射性物質の操作を伴います。適切なPPEを着用し、施設の放射線安全事務所によって設定された安全性と廃棄物処理条例に従ってください。 - 暖かい緩衝液で大動脈カニューレを埋めるために潅流装置の大動脈ラインをフラッシュし、まだチューブ中に存在し得る任意の水や空気を排除します。灌流バッファは心臓がカニューレに接続されている時に空気塞栓の可能性を最小限にするために、大動脈カニューレから滴下することを可能にします。
- 2つのマイクロ解剖鉗子を使用すると、慎重に大動脈を開き、大動脈カニューレに心をスライドさせます。マイクロクリップでカニューレに大動脈を確保し、心臓のランゲンドルフ灌流を開始します。再び暴行を開始し、灌流の開始後数秒で冠血管系に残っている全ての血を追放心を守ってください。
注：ステップ4を実行することが非常に重要です。心臓への不可逆的な虚血性損傷を防ぐため、できるだけ速く4.10を通じて6。経験により、全体の手順は、1〜2分を取る必要があります。カニューレに大動脈をスライドすると、これは心筋の低灌流と大動脈弁の破損の原因となり大動脈基部に合格しないように注意してください。 - 3-0絹縫合糸で大動脈カニューレに大動脈を結ぶマイクロクリップを削除します。肺静脈の位置を確認します。それを見つけるために、非心臓組織をトリミングする必要があるかもしれないが、彼らはカニューレに左心房を結ぶために役立つような非心臓組織のあまりカットしないでください。
- 暖かい緩衝液で心房カニューレを埋めるために、まだチューブ中に存在し得る任意の水や空気を除去するための灌流装置の左心房ラインをフラッシュします。心臓がカニューレに接続されている時に空気塞栓の可能性を最小限にするための装置から任意の気泡を除去するために特に注意してください。
- 2つのマイクロ解剖FORCを使用して、EPSは微妙に肺静脈の開口部をつかみ、心房カニューレに心をスライドさせます。静かにこのステップを達成するために、心房および/または大動脈カニューレを回転させることによって、心臓の位置を変更する必要があるかもしれません。いずれの場合も、手順は心臓に過度の負担を課すと大動脈の曲げ起こさないことを確認してください。 3-0絹縫合糸で心房カニューレに左心房を接続します。
- 心房ラインを開き、同時に作業モードにランゲンドルフモードから大動脈ラインを切り替えます。バッファは、左心房から漏れ出す場合は、ランゲンドルフ灌流に大動脈の行を戻す、心房ラインを閉じ、カニューレに、より安全に左心房を結ぶために、別の3-0絹縫合糸を使用しています。
心機能及びサンプル収集の5.測定
注：代謝フラックスの決意は冠血流（CF）の知識が必要になります。以下に説明するように、冠状動脈流量値とすることができますストップウォッチの簡単な使用で得られました。さらに、同様の方法で大動脈流の測定（AF）を適用することによって、心機能の一般的な尺度として心臓パワー（CP）を計算するために使用することができる心拍出量（CO = CF + AF）の決意を可能にします式CP = CO（/ S M 3）*後負荷（PA）。心臓機能の評価のために利用できる別の方法は、圧力変換器（ 図3および4）のパルス圧力の実時間測定に依存しています。オプションが、左心室の収縮期および拡張期機能の決意を含む、心収縮機能および血行動態の最も正確で詳細な測定は、圧力 - 体積（PV）コンダクタンスカテーテルを使用して達成されます。本節では、単離された心臓のカテーテル法を説明します。統計ソフトウェアとPVカテーテルおよびデータ分析のキャリブレーションに関する追加情報は、することができます参考文献14,15で見つかりました。
注意：次の手順は、放射性物質の操作を伴います。適切なPPEを着用し、施設の放射線安全事務所によって設定された安全性と廃棄物処理条例に従ってください。
- 実験は、カテーテルとLV機能の直接測定が含まれている場合は、26 G針でLVの頂点を穿刺し、穿刺を介してカテーテルを導入します。
- 圧 - 容積カテーテルを使用する場合は、そのシャフトが遠位右大動脈弁下の電極と心内膜境界線に隣接し、ちょうど心室壁の内部近位電極と、LV縦軸と整列されるように、慎重にカテーテルを配置します。
- ウォータージャケット心室に心を密封し、データ収集ソフトウェアと心臓機能パラメータを監視します。ベースライン心臓パラメータは5分間以上安定している後に記録を開始します。
- MEAによって冠動脈の流れを決定します心腔の下添付20mLの注射筒に充填するのに必要な時間をジューリング。測定後、放射性廃液容器に冠状動脈流出液を空にするために三方活栓を開きます。
注：フロー測定は、流量計とflowprobesを用いて行うことができます。 - それは心を出るときに冠状動脈の流出〜2ミリリットルを回復するために、三方活栓のサイドアームに取り付けられた3ミリリットル注射器を使用してください。 2ミリリットルキャップレスマイクロ遠心チューブに冠状動脈流出物の0.5ミリリットルを移し、直ちにグルコース酸化（下記第6節）の速度の決意を進めます。
- 適切に標識されたマイクロチューブに冠動脈流出物サンプル（〜1.5ミリリットル）の残りの部分を転送し、氷上で保存します。
- 繰り返しは灌流実験終了まで（ 例えばごとに5または10分）、一定の間隔で5.4〜5.6を繰り返します。
- 圧 - 容積カテーテルを使用している場合は、高張食塩水の10μlのボーラスを注入（15％）心房ラインに、右の実験を締結する前に、心房カニューレの前に。心臓容積15の正確な決意のために重要である並列コンダクタンス（V pを ）、計算するためにこのボーラス注射を使用してください。
- 心室を開封し、1は実験に用いた場合、LVからカテーテルを除去します。次のいずれかのオプションを使用して、心を回復します：
- 下流の分析のための灌流装置は、ライン心房と大動脈の両方に近い、それを可能にし、直ちに凍結クランプの心をそのカニューレにWollenbergerトング液体窒素で予冷しを使用している場合は、心臓の特定の領域を分離する必要がない場合。
- また、カニューレから心をカットし、氷冷KHバッファにドロップします。迅速ペーパータオル上で心を乾燥し、その湿重量を測定します。心臓は、その後、解剖し、組織試料は、特定の測定のために収集することができます。 Wollenbergerトングを使って残りの組織を凍結Sは、液体窒素中であらかじめ冷却しました。
- （部8の計算を参照してください）乾燥重量の決意するまで-80ºCで凍結した心臓組織を保管してください。
心筋グルコース酸化料金の6決意
注：この方法は、ハイアミンの水酸化物の捕獲溶液と冠状動脈流出液からの14 CO 2の定量的回収で構成されています。 H 14 CO3-として溶解14 CO 2は、過塩素酸によるバッファの酸性化後に回収されます。空気と試料との間のガスの受動拡散は、時間をかけて14 CO 2の損失につながるようにサンプルがすぐに回復した後に処理されるべきです。シンチレーションバイアルをしっかりと過塩素酸を添加した後、14 CO 2の損失を防ぐために、ゴムスリーブ栓で密封されるべきです。必要に応じて、パラフィルムは、ゴムスリーブストッパを固定するために使用することができバイアル（ 図2）。
- ガラス製シンチレーションバイアルにハイアミンの10倍濃水酸化（サンプル当たり1つのバイアル+バックグラウンド活性の決意のための2つの余分なバイアル）の1ミリリットルを追加します。
注意：ハイアミンの水酸化物は非常に毒性があり、重度の火傷を引き起こします。適切な取り扱いと保管のため、製品のMSDSを参照してください。 - ピンセットを使用すると、微妙ハイアミンの水酸化物で予め充填されたバイアルに0.5ミリリットルを冠動脈流出物サンプルを含む2ミリリットルキャップレスマイクロチューブを移します。バックグラウンド活性の決意のために0.5ミリリットル灌流バッファを使用します。
- ゴムスリーブストッパーでバイアルをキャップ。パラフィルムは、バイアルのシールを確保するために使用することができます。 （：％ワット60％のワット）ゴムスリーブストッパーを通って直接2ミリリットルキャップレスチューブに1mlシリンジと23 G長い針を使用して、過塩素酸の200μLを注入します。
注：冠状動脈の流出が原因で、BSAの沈殿に白い有効にしてください。 - バイアル秒をしてみましょうそれを一晩。
注意：過塩素酸は腐食性が高く、酸化剤として作用し、および/または爆発の危険を引き起こす可能性があります。適切な取り扱いと保管のため、製品のMSDSを参照してください。 - 翌日、ゴムスリーブのストッパーを外します。慎重にピンセットで各2ミリリットルキャップレスチューブを取り出し、ハイアミンの水酸化物のすべてを取得するために、1ミリリットルのシンチレーションカクテルとオープンバイアルの上にチューブの底を洗います。適切に標識された放射性廃棄物容器にキャップレスチューブを捨てます。
- 1バイアルあたり追加の9ミリリットルのシンチレーションカクテルを追加します。比活性の決意10mlの液体シンチレーションカクテルを充填した2つのバイアルに直接0.5mLの潅流バッファーを加えます。勢いよく手でバイアルを振ると、気泡が適切にデュアルラベル実験のために設定し、液体シンチレーションカウンターで測定する前に消散させることができるように少なくとも6時間を待ちます。
注：NEを可視化するために透明なガラスバイアルを使用しますゴムスリーブ栓を貫通するときedle。この反応を台無しにするようハイアミンの水酸化物に過塩素酸を落とさないでください。過塩素酸を追加すると、空気中に冠動脈流出液からの14 CO 2を放出します。バイアルを密封しなければならないと14 CO 2の全てが水酸化物のハイアミンにトラップされるべきであるが、化学ヒュームフードの下で、このアッセイを実行することをお勧めします。
心筋オレイン酸酸化料金の7決意
注：この方法は、強力な陰イオン交換樹脂を用いて冠動脈流出物からの3 H 2 Oの定量的分離・回収に基づいています。 14 CO 2の回収とは異なり、サンプルの安定性の問題がないと冠動脈流出物は、アッセイを行う前に、氷上に保持または冷凍庫で保存することができます。
- 陰イオン交換樹脂カラムを準備します（サンプル+トンあたり1列グラスウールで3 mlシリンジチューブの先端を充填することによってバックグラウンド活性の決意）のための追加の列WO。樹脂は、注射筒に2ミリリットルマークに到達するまでトランスファーピペットを用いて樹脂/水スラリーを追加します。
- カラムを通して2ミリリットルの超純水を通過させることにより、樹脂を洗浄します。このステップをさらに2回繰り返します。
- 列の下でオープンシンチレーションバイアルを置き、0.5ミリリットルを列ごとに冠状動脈流出液をロードします。バックグラウンド活性の決意に対する負荷0.5mLの潅流緩衝液。
- 0.5、1、2mlの超純水で順次カラムを洗浄します。溶出が完了すると、適切に標識された放射性廃棄物容器内の列を捨てます。
- シンチレーションバイアル当たり13ミリリットルの液体シンチレーションカクテルを追加します。具体的な活動の決意のために13ミリリットルの液体シンチレーションカクテルを充填した2つのバイアルに直接0.5ミリリットル灌流バッファを追加します。積極的にバイアルを振ると液体SCIで測定する前に少なくとも6時間を待ちますntillationカウンタが適切にデュアルラベル実験のために設定します。
8.計算
- まだ行っていない場合は、全体の灌流心臓の湿重量を決定します。
注：分子および生化学的解析は、その後残りの組織上で実行される場合、凍結組織を解凍しないようにしてください。 - 全体散らすハート（心臓全体の約15〜30％を使用）からの組織サンプルの湿重量を決定します。一晩50℃に設定したオーブンで組織試料を置き、その乾燥重量を測定します。グラムで心臓全体の乾燥重量を決定するために、組織サンプルの湿重量/乾燥重量比を使用してください（g乾燥重量）。
- 各時間点xのml /分で冠血流CF xの値を表します。
- グルコース酸化の速度の決意
- determiに14 Cのバックグラウンド活性のために測定された2つの崩壊/分（DPM）の値を平均化補正係数14Cの DPMのBAをネブラスカ。
- 14 Cは、比活性14Cの DPM SAの値を平均化決定。
- 式を適用することによって、DPM /マイクロモル（F のGlu）におけるグルコースの比放射能を決定
注：ここで、n のGlu（マイクロモル）= C のGlu（モル/ L）*サンプル体積（L）= 2.5 5ミリモル/ Lのグルコースを使用し、0.5ミリリットルのサンプル。 - 式を適用することによって、DPM /分（A）中の14 CO 2の生成速度X各時点について決定
注：ここで、巻のx（ミリリットル）= 0.5 - 14 CO 2の生産の正規化速度を得るために、乾燥心臓重量の決定された値で除算A（ ノーム
- GOはg乾燥重量当たりのグルコース/分のマイクロモルのグルコース酸化（GO）の速度を得るためにノーム / F のGluを =数式を適用します。
- オレイン酸酸化速度の決意
- 補正係数3Hの DPMのBAを決定するために、3 Hのバックグラウンド活性のために測定された2つの崩壊/分（DPM）の値を平均します。
- 3 Hは、比活性3Hの DPM SAの値を平均化決定。
- 式を適用することによって、DPM /マイクロモル（F オル電子 ）におけるオレイン酸の比放射能を決定
注：ここで、nは オレ （マイクロモル）= C オーレ （モル/ L）*サンプル体積（L）= 0.2〜0.4ミリモル/ Lでオレイン酸を使用し、0.5ミリリットルのサンプル。 - 各ティムのために決定式を適用することによって、DPM /分（B）中の3 H 2 Oの生成速度X E点
注：ここで、巻のx（ミリリットル）= 0.5 - g乾燥重量あたりのdpm /分で3 H 2 O（Bの規格 ）の生産の正規化速度を得るために、乾燥心臓重量の決定された値で除算B。
- g乾燥重量あたりのオレイン酸/分のマイクロモルでオレイン酸酸化（OO）の速度を得るために、式OO = B ノーム / F オレを適用します。
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Representative Results
2つの代表的実験は、以下の図に記載されています。どちらの場合も、16週齢の雄性Sprague Dawley系ラットの心臓を単離し、前述のプロトコルに従って調製KH緩衝液を用いて作業モードで灌流。各実験では、心臓は心臓の作業に影響を与えるためにストレス条件に供しました。心臓の収縮機能は、大動脈ラインの圧力変換器の挿入を通って心臓パワーの決意により脈圧を連続的に記録することにより評価しました。基板を提供するエネルギーの利用の各応力状態の影響を同時にグルコースおよびオレイン酸酸化の速度を測定することによって決定しました。
最初の実験では、作業負荷の急激な増加は、40％後負荷を増加させることにより、近生理ワークロードで20分間の灌流後にシミュレートした（手動によって達成大動脈溢流室を上げる）および潅流緩衝液（ 図3A）にエピネフリン（1モル/ L）を添加することによって。脈圧トレースのピーク収縮期血圧値との間の間隔を測定することによって決定することができる心拍数は、workjump誘導（ 図3B）の際に50％を超えてすぐに増加しました。グルコースとオレイン酸酸化（ 図3C）の両方の速度の増加を伴っていたworkjumpで40％以上増加した心臓電力、。結果は、ワークロード内の急激な増加のストレスの下で、心臓が急速にグルコースおよび脂肪酸酸化の両方から収縮のためのエネルギー生成を高めるために適応する、ことを示しています。しかし、酸化速度の相対的な増加は、オレイン酸（〜1.3倍）のためにあったよりグルコース（〜2.8倍）のためのより重要でした。余分なワークロードに対応する炭水化物の酸化に対する増加した信頼は、圧力過負荷の哺乳類の心臓18の典型的な特徴であります
第2の実験では、心臓を15分間の合計、（心房および大動脈ラインの両方を閉じることによって誘導される）グローバル、正常体温虚血30分再灌流（ 図4A）、続いて20分間のベースライン条件下で灌流しました。これらの実験条件下では、近垂直脈圧は、再灌流の開始時（ 図4B）の後2および3分の間に回復しました。心臓パワーは急速に近いベースライン値（ 図4C）にフォールバックする前に、再灌流の最初の10分の間に虚血前値を超えて増加します。グルコース酸化が急速にレベル-虚血性を事前に返されたのに対し、ベースラインと比較して、オレイン酸酸化の速度は、再灌流の間に増加しました。同時に収縮機能、もう1つは明確にすることができ、基板の酸化の両方の速度を測定することで感謝し、その存在の実験条件で、脂肪酸OXIDの速度の変化ationが再灌流で発生する仕事量の変化のための主要な決定要因です。脂肪酸利用ポスト虚血に向けて、より高いスイッチは、再灌流心臓19のよくestalished機能です。
図1： 単離したラット心臓の作業装置の簡略化スキーム脂肪酸BSA溶液を補充したクレブス-ヘンゼライト緩衝液は、膜型人工肺を通過することによって酸素化されています。近い生理的条件で灌流ラットの心臓のための典型的な心臓前負荷と後負荷の値が示されています。設定は、心房リザーバと大動脈溢流室の高さを調整することによって変更することができます。目盛り付き注射器の管は、それぞれ、冠動脈流および大動脈流を測定するために、心室と大動脈の溢流室の下に配置されています。流れバッファは（大動脈と冠状動脈の流れを測定する場合）が停止又は三方ストップコックを使用することによって（動作モードにランゲンドルフの切り替え時）再ルーティングすることができます。赤い矢印は、「動静脈「酸素差を決定するためのインライン酸素microlelectrodesのための最適な位置を示しています。インラインフロープローブおよび圧力変換器は、心房と大動脈流速および圧力（緑の矢印）の両方を測定する予圧と後負荷ラインに配置することができます。左心室の圧力と容積はまた、左心室の頂部を通して挿入PVカテーテルを用いて記録することができます。図に示されていないすべてのガラス製品要素とダークブルー色の灌流チューブを取り巻く水ジャケットです。これらの水ジャケット付きの要素はすべて37ºCに設定した循環水浴にチューブを介して直列に接続されている。 トンの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。彼の姿。
図2：CO 2トラップのセットアップに関連した様々なステップの表現 （A）はハイアミンの10倍濃水酸化1ミリリットルを追加します。 （B）キャップレスチューブに含まれる0.5ミリリットルのサンプルを追加します。 （C）は、バイアルをシール。 （D）過塩素酸200μlの（60％のワット：重量％）を注入します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：Workjump 実験の代表的な結果 （A）脈圧の連続記録。 （B）でショートworkjump開始時の脈圧の変化を示すterval記録。 （C）グルコース酸化（円と赤のトレース）およびオレイン酸酸化（四角と青のトレース）の心臓レートが5分間隔で冠動脈流出液の分析によって決定しました。心臓パワー（三角形と黒のトレース）は冠状動脈流出物のサンプルを回収したと同時に、心拍出量を測定することによって決定した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 虚血再灌流実験の代表的な結果 （A）脈圧の連続記録。収縮機能デュの回復を示した（B）ショートインターバル記録再灌流の最初の5分を鳴らします。 （C）グルコース酸化（円と赤のトレース）の心臓レートとオレイン酸酸化（四角と青のトレース）は分析がで行われた再灌流の最初の5分間を除いて、5分間隔で冠動脈流出液の分析によって決定しました1分間隔。心臓パワー（三角形と黒のトレース）は冠状動脈流出物のサンプルを回収したと同時に、心拍出量を測定することによって決定した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
前のプロトコルが同時に分離された作業用ラット心臓におけるグルコース酸化および脂肪酸酸化を介して基板のフラックスを定量化する方法を詳しく説明します。測定値は、その後、ベースラインとストレス条件（ワークロードの変化、虚血再灌流、 等 ...）の下での基質代謝と心仕事との関係を決定するために記録された心臓機能パラメータに重ね合わせることができます。代謝/収縮の関係は、例えば、心不全および糖尿病のような既存の条件に影響されるかを評価することも可能です。また、遺伝的に改変されたげっ歯類の心臓は、心臓代謝と機能上の特定のタンパク質の影響を調べるために使用することができます。最後に、これらのパラメータの薬物および他の循環要因の影響を個別に試験することができます。解糖を介してグルコースのフラックスは常にグルコース酸化の速度と相関しないので、それはかもしれフォーマ単一の実験設定で両方の経路を介してグルコースフラックスの速度に従うことを的。
3 H 2 Oの放出が糖20のエノラーゼ段階の活性によって決定されるため、解糖の速度は、灌流緩衝液に、[5- 3 H]グルコースを添加することによって決定することができます。解糖経路のホスホグルコースイソメラーゼステップで3 H 2 Oの産生をもたらす代わりに[2- 3 H]グルコース、心筋16,17,21によってグルコース取り込み速度を調べるために使用することができます。その異化のさまざまなレベルでのグルコースの運命を調査するために、複数の放射性標識トレーサーから選択する可能性は、技術の汎用性の別の例です。しかし、すべてのフラックスの測定値が、冠状動脈流出液から3 H 2 Oまたは14 CO 2、2つだけの放射性標識のいずれかの定量的な回復に依存しているため、EDトレーサー（一方の3 H標識および14 Cで標識された他のもの）が一度に灌流緩衝液中で使用することができます。
方法論的な考慮事項
このプロトコルを使用して、心臓の代謝フラックスと機能の測定にはいくつかの固有の制限があります。 KHバッファの使用は灌流液の組成を完全にコントロールを可能にしますが、この実験の生理学的関連性は疑わしいかもしれません。まず、血液上クリスタロイド溶液の使用は、負に虚血22,23に心臓血行力学および耐衝撃性が知られています。第二に、我々はここで説明する潅流緩衝液は、直接心臓の代謝を調節し、結果的にシミュレートされたストレス条件に対する心臓の応答に影響を与える可能性がホルモンや栄養素の様々なを欠いています。確かに、哺乳類の心臓は、代謝雑食であり、グルコースおよび脂肪酸のほか、Fに他の基板を利用することができますそのエネルギー要件（乳酸、ピルビン酸、ケトン体、分岐鎖アミノ酸）ulfill。これらの基板の一部を罹患心臓24,25の代謝リモデリングにおいて重要な役割を果たしている証拠があります。研究者は、より密接に異なる生理学的条件（絶食状態に対して、 例えば摂食状態）または疾患状態を模倣して、用いた酸化のそれらの速度を追跡するために、それらの濃度を調節するために、灌流緩衝液にこれらの基板を追加することが完全に可能です適切な放射性標識されたトレーサー26,27。トリグリセリドの代謝も追跡することができ、その場合には、内皮からリポタンパク質リパーゼの放出を誘導し、大幅にバッファからのトリグリセリドの抽出を減少させるように、心臓の切除の前にヘパリンの使用を避けることをお勧めします28。放射性標識されたトレーサーを慎重に選択する、VAR中の放射能の取り込みとIOUの組織の代謝産物はまた、 デノボトリグリセリド合成、グリコーゲン代謝回転、またはタンパク質合成18,29,30の速度などのパラメータを決定するために灌流後に測定することができます。言い換えれば、研究者は、基板/ホルモンの組み合わせおよび濃度の多種多様な作業することができます。緩衝液組成物の選択は、主に、実験の目的に依存するであろう。これらの制御された緩衝液条件は「簡略化された「生理学的モデルを作成しているため、ex vivoでの作業心臓灌流実験は慎重に解釈されるべきであり、可能な場合、データはさらに、in vivoで検証する必要があることに起因します。
麻酔薬の選択
前の心臓の切除にラットで使用される麻酔薬は慎重にこれを実行するための実験を妨害しないことを保証するために、心肺機能や代謝に対するその既知の効果に基づいて選択する必要がありますエド。両方の注射や吸入麻酔薬は急速に灌流31,32の間に心臓代謝に影響を与える可能性が高血糖および耐糖能異常の可変度を誘導します。他の薬剤と比較すると、グルコース恒常性にバルビツール酸塩（ペントバルビタール及びチオブタバルビタール）の短期的影響は、31比較的無視できます。しかし、従来の心臓切除に腹腔内ペントバルビタール麻酔は、心拍出量の減少、左心室機能を損なう、および虚血-再灌流33のex vivoプロトコルで心筋乳酸放出を増加させることが示されています。ペントバルビタールは、単離されたラットの心臓に持つ負の変力作用は、薬物34の組織蓄積によって引き起こされることが示唆されています。逆に、より迅速に心臓組織から洗い流される吸入麻酔薬の使用は、 エクスビボ 33良い収縮機能と関連しています。揮発性麻酔薬は、実際のCAを提供することができますミトコンドリアK ATPチャネルの開口部を含む機構を介して、虚血再灌流時のrdioprotectionとミトコンドリア32へのヘキソキナーゼの結合の増加。要約すると、単離された作動心臓灌流プロトコールで使用される麻酔薬の種類は、直接実験の結果に影響を与えることができる機能的および代謝の両方のパラメータの評価における重要な変数です。したがって、タイプおよび使用される麻酔薬の投与量は、常に、実験の方法の項に報告しなければならない、これらのパラメータを比較することを意味している実験の間で変更すべきではありません。
心臓灌流の放射性同位元素
前のプロトコルで実行されるすべてのフラックスの測定は、冠動脈流出物を廃棄する代わりにバッファリザーバ（ 図1）に戻されることを意味し、非循環モードで実行されています。研究者ではなくてもよいです動作するようにはるかに小さいバッファの量、したがって放射能を必要とするという利点を有する再循環モードで灌流装置を使用することを選択します。しかしながら、冠状動脈流出物の再循環は、心臓の代謝活性に由来する副生成物の回収を介して潅流バッファの定常状態組成を損なう（乳酸塩を含むだけでなく、3 H 2 OおよびH 14 CO3-）の決意を複雑、代謝フラックスとさえ時間35にわたって心機能を変更することができます。これらの問題は、非循環モードで防止されます。代謝フラックス分析で働くラットの心臓を使用した場合による放射能の量にし、1回の実験で使用される灌流バッファの大容量に、研究者は特に注意が必要です。初めての灌流装置を使用する場合は、に慣れるために、非放射性の緩衝液を用いて、いくつかのモック実験を行うことをお勧めしますプロトコルの安全手順と異なるステップ。バッファが漏れや心臓の切断血管の1から飛び出す可能性があるため、それは装置との密接な接触を確立する必要があり、ためカニューレ上の心の取付けは、特に敏感なステップです。 Taegtmeyerら11によって記載灌流装置は、潅流装置の残りの部分から完全に独立してランゲンドルフリザーバなどの利点を有し、したがって、心臓の挿管時に放射性物質の流出を防止するために、非放射性KH緩衝液を充填することができます。かかわらず、使用されるシステムの実験は、アクセスが制限された専用のエリアで行われるべきです。部屋にはシンク、同じ地区に汚染された機器のバッファの準備とクリーニングを実行するための超純水の供給を含める必要があります。調べでは、秒を確立するために、それらの機関の放射線安全事務所と密接に連携する必要があります封じ込め、制御及び除染手順pecific。
灌流装置の清掃
灌流装置のポスト実験クリーニングは慎重に、貧しい実験の再現性に関連する問題のほとんどを担当し実行されない場合は、あまりにも頻繁に、見落とされ、重要なステップです。栄養豊富な潅流緩衝液および灌流システムの高い温度は、細菌および真菌の成長のための理想的な条件を提供します。これらの化合物は、それらは、ハード装置のフラッシュアウトすること、チューブやガラス製品の表面に付着するため、潅流緩衝液中のタンパク質（インスリン、BSA）および脂肪酸の利用は、洗浄手順の複雑さの別の程度を追加します。放射性同位元素の使用はまた、このような固体ANの汚染された機器や廃棄の操作のための研究室で専用の収容エリアの作成などの追加の制約を課すことになりますD液体放射性廃棄物。したがって、適切な洗浄手順は、主に、灌流緩衝液の組成及び使用される潅流装置の種類の両方に依存します。市販装置を使用している場合は、製造元のWebサイトをチェックしたり、装置の構成要素のいずれかに損傷を与えることなくクリーニングを実行する方法についての情報を取得するために、顧客サービスにお問い合わせください。一般的に、全てのガラス製品、プラスチック部品は、石鹸の広い範囲で洗浄することができます。酵素活性のパワード洗剤は、脂肪酸BSAの残留物を除去するために特に有用です。ほとんどの汚染物質はまた、いくつかの時間のための装置を介して0.1 M HClまたは0.1 M HNO 3を実行することにより、削除されます。温水中で、最後に超純水を使用してシステムをすすぐことにより調製した酵素活性のパワード洗剤の溶液：我々は（V w）は、その後、新鮮な1％、0.1 M HClで最初にシステムをフラッシュすることによって満足のいく洗浄結果を得ます。もともとD 1として、特注の灌流装置を使用する場合Taegtmeyerや同僚11によって傍接した、完全に各実験日の終わりに装置を解体しやすく、より効果的であり得ます。ガラス製品は、クロム酸と硫酸の混合物の濃縮槽に15分間浸漬することによって洗浄されます。プラスチック部品及びPVCチューブは、残基を含まない洗剤で洗浄することができます。それは放射化学物質によって汚染物質の操作を制限するので、それは背後にある洗浄剤の残留物を残す防ぐので、我々は、それが完全に毎日PVCチューブを交換するために、実際に、より速く、より信頼性があるが見つかりました。いずれの場合においても、研究者は次の規則を適用する必要があります：1-直ちに灌流実験を完了した後、灌流装置およびすべてのダーティ機器を清掃してください。待機中は、クリーニングより困難で時間がかかるようになります。 2-汚染のために定期的に水ジャケットシステムの循環浴を確認してください。整水器の使用は、c間の間隔を長くします水浴の傾きました。徹底的に水道水で数回、すべてのガラス器具やチューブをすすぎ、洗浄剤からの残留物を除去するために超純水でリンス仕上げ、洗浄した後、3-。解剖は、慎重に実行し、慎重に準備灌流バッファは（細菌によってまたは溶媒残留物のいずれかによって）装置の汚染を示す可能性がある時に、4-二心の準備が連続して失敗しました。この問題が発生した場合、洗浄、すすぎの手順は完全に繰り返されるべきです。
マウスの心臓にスケールダウン
先行するプロトコルは、単離された作業ラット心臓における代謝率の決意に焦点を当てているが、同じ手順は、潅流装置とデータ収集装置36にいくつかの修正を加えてマウス心臓に適用することができます。より小型のため、孤立した作業マウスの心臓は、技術的にはより困難であるが、そのかなりのより低い流量は、灌流緩衝液の非常に低い量を必要とするという利点を有します。すでに利用可能である遺伝的に改変されたマウスモデルの多くは、心臓代謝と機能の再構築上の単一の遺伝子産物の機能を研究するために、単離された作業用マウスの心臓は非常に魅力的です。しかし、ゲノムの編集やトランスジェニックおよびノックアウトラットの急速に成長しているカタログの最近の技術の進歩は急速に2げっ歯動物種間の差を縮めています。また、ラットは長い間、その病態生理は密接に人間の条件37を模倣するため、心血管疾患を調査するための優れた動物モデルとして高く評価されています。これらの理由から、我々は孤立した作業ラットの心臓はまだ心血管研究の現代の時代に重要な位置を保持していることを信じています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100 - 200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100 - 200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10x Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 ml Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 ml HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
References
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