Abstract
Il cuore dei mammiferi è un grande consumatore di ATP e richiede un costante rifornimento di substrati energetici per la contrazione. Non sorprendentemente, alterazioni del metabolismo miocardico sono stati collegati allo sviluppo della disfunzione contrattile e insufficienza cardiaca. Pertanto, svelare il legame tra il metabolismo e la contrazione dovrebbe far luce su alcuni dei meccanismi che regolano l'adattamento cardiaca o disadattamento negli stati di malattia. Il lavoro di preparazione cuore isolato di ratto può essere utilizzata per seguire, contemporaneamente ed in tempo reale, la funzione contrattile cardiaca e flusso di energia fornire substrati in vie metaboliche ossidative. Il presente protocollo intende fornire una descrizione dettagliata dei metodi utilizzati per la preparazione e l'utilizzo di tamponi per la misurazione quantitativa dei tassi di ossidazione per glucosio e gli acidi grassi, l'energia principale fornendo substrati del cuore. I metodi utilizzati per l'analisi dei campioni e l'interpretazione dei dati vengono anche discussi.In breve, la tecnica si basa sulla fornitura di 14 C-glucosio radiomarcato e un acido grasso a catena lunga radiomarcato 3 H- al cuore ex vivo battere via normotermica perfusione cristalloide. 14 CO 2 e 3 H 2 O, sottoprodotti finali di le reazioni enzimatiche coinvolte nella utilizzazione di questi substrati energetici fornendo, vengono poi quantitativamente recuperati dall'effluente coronarica. Con la conoscenza della specifica attività dei substrati radiomarcati utilizzati, è quindi possibile quantificare singolarmente il flusso di glucosio e acido grasso nei percorsi di ossidazione. funzione contrattile del cuore isolato può essere determinato in parallelo con l'apparecchio di controllo appropriate e direttamente correlato ai valori flusso metabolico. La tecnica è estremamente utile per studiare il rapporto metabolismo / contrazione in risposta a varie condizioni di stress, come alterazioni nella pre e dopo carico e ischemia, un farmaco o un circulafattore ting, o alla alterazione dell'espressione di un prodotto genico.
Introduction
rilevanza clinica
Nel cuore dei mammiferi, vi è una forte relazione positiva tra il flusso dei substrati attraverso vie metaboliche ossidative, la produzione di ATP e il lavoro cardiaco 1. Nel corso degli ultimi due decenni, l'indagine del legame intricato tra il metabolismo e la funzione cardiaca ha portato a riconoscere che le alterazioni nel metabolismo cardiaco sono una causa per la disfunzione contrattile e forse patologico rimodellamento strutturale nel contesto di diversi tipi di malattie cardiache 2-4. Pertanto, si prevede che la nostra comprensione dei meccanismi che regolano rimodellamento metabolica del cuore sottolineato porterà alla identificazione di bersagli terapeutici per la prevenzione o il trattamento di insufficienza cardiaca 5-7. La recente pubblicazione di una dichiarazione scientifica della American Heart Association su "Valutare Cardiac Metabolism", sottolinea il crescente interesse della comunità scientifica per tsuo campo di ricerca 8. Ma mentre i progressi tecnologici nel campo dell'imaging cardiaco permettono ora per una valutazione rapida e accurata della morfologia e funzione cardiaca, lo studio in vivo del metabolismo cardiaco rimane limitata e gravoso: Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) e tomografia ad emissione di positroni (PET) può essere utilizzati per seguire cardiaca metabolismo del fosfato ad alta energia e l'attività ciclo di Krebs, ma queste tecniche sono afflitti da costi di gestione elevati e dalla loro incapacità di determinare il contributo di vari substrati al metabolismo ossidativo in condizioni di stato stazionario 9 .Per questa data l'ex vivo lavoro di preparazione cuore rappresenta la sola e unica tecnica a disposizione per studiare, simultaneamente e in tempo reale, funzione contrattile e del flusso dei substrati nelle vie metaboliche ossidative 7,9. Il seguente protocollo prefigge di fornire orientamenti nella preparazione e utilizzo di reagenti utilizzati per determinare il rattoes di utilizzo substrati, nel cuore isolato di ratto di lavoro.
L'isolato Apparato Cuore di lavoro per roditori
Anche se la tecnica è quasi mezzo secolo di vita, il lavoro di preparazione isolato cuore di ratto rimane un metodo di scelta per la ricerca cardiovascolare. Come per la preparazione del cuore Langendorff, cuore roditore lavoro offre un modo relativamente semplice, affidabile e poco costoso per misurare una vasta gamma di parametri cardiaci indipendentemente dagli effetti confondenti di altri organi, neurormonali e altri fattori circolanti. Ma a differenza cuore Langendorff-perfuso, cuore lavorando continua a svolgere lavoro cardiaco quasi fisiologica, un prerequisito per la generazione di flusso metabolico ossidativo a livelli che sono rilevanti per le condizioni in vivo. Ciò si ottiene fornendo il buffer perfusione del ventricolo sinistro (LV) attraverso una cannula collegata all'atrio sinistro, e come riempie e contratti LV, latampone viene espulso attraverso la linea aortica contro un post-carico determinata pressione idrostatica. Il design dell'apparato perfusione originariamente descritto da Neely e colleghi 10 è stato successivamente migliorato da Taegtmeyer, orli e Krebs 11, ma è cambiato molto poco da allora. Come descritto nel l'apparato originale, funzione contrattile può essere valutata attraverso la determinazione della gittata cardiaca, utilizzando non più di cilindri graduati e un cronometro per misurare aortica e coronarica flussi 10,11. Diversi fornitori offrono ora sistemi completi di roditori di lavoro del cuore di perfusione. Queste apparecchiature disponibili in commercio possono essere acquisite con flowprobes, trasduttori di pressione, un catetere pressione-volume e tutta l'attrezzatura necessaria per l'acquisizione dati funzionali cardiaca e analisi. I produttori forniscono ampie sessioni di documentazione e formazione per familiarizzare il nuovo utente con le loro attrezzature. Diversi articoli di revisione anche i protocolli di dettaglio sul strum cuore di lavoroentazione e l'uso di cateteri per misurare la funzione cardiaca nei roditori 12-15. Per questo motivo, ci sarà solo brevemente menzionare il set-up dell'apparato perfusione e l'apparecchio di controllo. Il presente protocollo piuttosto mira a completare le informazioni già disponibili con una descrizione dei metodi che possono essere implementate per misurare simultaneamente i tassi di glucosio e di catena lunga ossidazione degli acidi grassi, i due principali substrati energetici fornendo nel cuore normale. Descriviamo qui tutti i passi necessari per l'uso di substrati energetici radiomarcati per la valutazione del metabolismo ossidativo miocardica, dalla preparazione dei reagenti e tamponi per il recupero e l'elaborazione dei campioni, l'analisi dei dati.
Principi del metodo
Cardiomyocytes generano la maggior parte della loro energia per la contrazione della fosforilazione ossidativa degli acidi grassi (acidi grassi a lunga catena principalmente) e carboidrati (glucosE e lattato). Il cuore è molto limitato riserve energetiche e si basa su un costante rifornimento di questi substrati energetici fornendo dalla circolazione. Il catabolismo del glucosio attraverso la via glicolitica produce piruvato che viene poi decarbossilata dal piruvato deidrogenasi della membrana mitocondriale interna. Gli acidi grassi a catena lunga, estratti da albumina o lipoproteine circolanti trigliceridi, vengono dapprima attivati in molecole acil-CoA nel citosol e successivamente trasportati all'interno della matrice mitocondriale attraverso la navetta carnitina per entrare nel pathway beta-ossidazione. Le molecole acetil-CoA prodotti dal catabolismo di glucosio e acidi grassi alimentano il ciclo di Krebs per generare gli equivalenti riducenti (NADH e FADH2) che sono usati dalla catena di trasporto degli elettroni per costruire la forza proton-motrice attraverso la membrana mitocondriale interna e generare ATP attraverso l'attività di ATP sintasi. Acqua e biossido di carbonio sono i sottoprodotti finali dile reazioni enzimatiche che avvengono all'interno del ciclo di Krebs. La fornitura di 14 C e 3 H- substrati radiomarcati (ad esempio 14 glucosio C-radiomarcato e acido oleico 3 H-radiomarcato) al cuore lavorare isolato sarà di conseguenza portare alla produzione di 14 CO 2 e 3 H 2 O che può essere quantitativamente recuperato dall'effluente coronarica. La raccolta di 14 CO 2 viene effettuata mantenendo cuore isolato e perfuso in una camera sigillata e immediatamente recuperare l'effluente coronarica quando esce cuore. Una colonna piccola scambiatrice di anioni viene utilizzato per separare e recuperare 3 H 2 O dall'effluente coronarica. La radioattività dei campioni trattati viene misurata con un contatore a scintillazione liquida, e con la consapevolezza della specifica attività dei substrati radiomarcati utilizzato, è quindi possibile quantificare singolarmente il flusso di glucosio e acido grasso nelossidazione Percorsi di 16,17.
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Protocol
NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità alla politica NIH Public Health Service sulla cura uso umano e degli animali e sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali della University of Mississippi Medical Center. Tutte le procedure che prevedono l'uso di radioisotopi sono stati approvati ed eseguiti secondo le linee guida stabilite dall'Ufficio sicurezza delle radiazioni della University of Mississippi Medical Center.
1. Preparazione di tampone archivio Soluzioni e reagenti
- Krebs-Henseleit (KH) Soluzioni tampone archivio
- Preparare 2 L di una soluzione concentrata 20x contenente sale stock (in mol / L) 2.37 NaCl, KCl 0,0948, 0,0236 KH 2 PO 4, e 0,0236 MgSO 4 * 7H 2 O. Filtro su una unità di dimensioni di filtrazione 0,45 micron pori e conservare a temperatura ambiente per un massimo di 1 mese.
- Preparare 2 L di una soluzione concentrata 20x (0,5 mol / L) di NaHCO 3. La soluzione può essereconservato a temperatura ambiente per un periodo di tempo indefinito.
- Preparare 250 ml di una / L di soluzione 1 mol di CaCl 2. Filtro su una unità di dimensioni di filtrazione 0,45 micron pori e conservare a temperatura ambiente per un massimo di 1 mese.
- Conversione di anioni resina di scambio dal cloruro Modulo per l'idrossido di modulo
- Lavare la resina a scambio anionico risospendendo in acqua ultrapura 1 L. Lasciare che la resina di stabilirsi e versare l'acqua in eccesso. Ripetere questa operazione altre 4 volte.
- Versare la resina in un portafiltro bicchiere vuoto microanalisi montato su un pallone filtrante.
- Convertire la resina alla forma di idrossido passando lentamente attraverso 22 volumi di 1 N NaOH. Mescolare la poltiglia intermittenza con una spatola in acciaio inox.
- Lavare la resina con acqua ultrapura finché il pH scende sotto 9,0. Controllare il pH regolarmente immergendo una striscia reattiva pH vicino alla superficie della poltiglia resina. Coprire e conservare la resina con acqua ultrapura in una bobottiglia di vetro rosilicate e riparo dalla luce. Non lasciare che la resina si asciughi prima dell'uso.
NOTA: Se conservato correttamente, la resina avrà una durata di almeno 3 mesi.
- Soluzione Acido oleico-albumina 8x concentrato della
- In un pallone a 4 L Erlenmeyer, mescolare 200 ml di 20x sale concentrato di soluzione e 200 ml di concentrato NaHCO 3 soluzione 20x con acqua ultrapura 3.6 L.
- Utilizzando un tubo di distribuzione del gas con un cilindro poroso, gas la soluzione per 15 minuti con una miscela di anidride carbonica 5% e ossigeno 95% per stabilizzare il pH.
- Versare 470 ml di tampone in un bicchiere di vetro 1 L. Aggiungere 8,75 ml di / L CaCl 2 soluzione stock 1 mol al buffer di 3530 ml resta nel pallone 4 L Erlenmeyer e mettere da parte.
- Aggiungere 40 g di acidi grassi liberi BSA per il bicchiere di vetro da 1 L e mescolate con un ancoretta fino alla dissoluzione.
- In un tubo da 15 ml, preparare 4 ml di 50% (v: v) di etanolo in acqua ultrapura. Aggiungere 487 mg sodium oleato e vortex fino a quando la polvere sia completamente dissolto.
NOTA: Alcuni ricercatori usano acido palmitico posto dell'acido oleico nel buffer di perfusione. Una soluzione madre di acido palmitico-albumina può essere preparato seguendo la stessa procedura. Tuttavia, si raccomanda di riscaldare la soluzione a 70 ° C per ottenere la completa solubilizzazione del palmitato di sodio. - Aggiungere la goccia a goccia soluzione oleato alla soluzione BSA libera acidi grassi sotto costante agitazione e attendere altri 10 min per il oleico complesso acido-BSA a formare.
NOTA: La soluzione deve avere un colore giallo chiaro ed essere priva di particelle visibili. Presenza di un precipitato o particelle insolubili può indicare coniugazione incompleta degli acidi grassi a BSA. In questo caso, la soluzione deve essere eliminata e il processo avviato di nuovo.
NOTA: palmitato precipiterà se è permesso di sedersi in una pipetta e non può essere aggiunto goccia a goccia. La soluzione agitata di BSA può essere riscaldata a 37 ° C per facilitare binding di acido palmitico. Non surriscaldare in quanto ciò potrebbe causare denaturazione e l'aggregazione di BSA.
ATTENZIONE: I prossimi passi di questo protocollo comporta la manipolazione di materiale radioattivo. Indossare adeguato DPI e le norme di sicurezza e di smaltimento dei rifiuti stabiliti dalla ufficio sicurezza di radiazione dell'istituzione. - Aggiungere 160 microlitri (0,8 mCi) [9,10- 3 H] acido oleico alla soluzione agitata di acido oleico-BSA e agitare per altri 10 min.
- Aggiungere 2,5 ml della / L CaCl 2 soluzione stock 1 mol alla soluzione agitata di acido oleico-BSA.
- Tagliare circa 1,2 m di dialisi tubi membrana e risciacquare sia all'interno che all'esterno con acqua di rubinetto. Scrub il tubo di dialisi vigorosamente sotto acqua corrente per 10 a 15 minuti per rimuovere il rivestimento glicerolo della membrana. In alternativa, rimuovere il rivestimento immergendo il tubo di dialisi in acqua calda per 1 ora prima dell'uso. Fine sciacquando il tubo di dialisi con ultrapura water.
- In modo sicuro legare un'estremità del tubo di dialisi. Riempire con la soluzione di acido oleico-BSA e legare l'altra estremità del tubo di dialisi.
- Posizionare il tubo di dialisi pieno nel pallone 4 L Erlenmeyer di tampone KH e consentire dialisi notte a 4 ° C sotto leggera agitazione con ancoretta.
- Il giorno successivo, rimuovere il 8x soluzione di acido oleico-BSA concentrato dal tubo di dialisi. Utilizzare la soluzione di acido oleico-BSA immediatamente per la perfusione o aliquotare e conservare a -20 ° C. aliquote congelate sono stabili per almeno 2 mesi. Evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo in quanto ciò potrebbe compromettere la solubilità del complesso oleico acido-BSA.
NOTA: Usare l'acqua ultrapura solo (resistività di 18,2 MΩ.cm a 25 ° C, carbonio organico totale <10 ppb, microrganismi ≤ 1 CFU / ml, particolato con calibro superiore a 0,22 micron ≤1 / ml) per preparare i reagenti e tamponi utilizzato per la perfusione cardiaca. Conversione della resina scambiatrice di anioni dal suo cloruro perm alla forma idrossido può essere evitato acquisto diretto della forma idrossido ad un costo supplementare (vedi Materiali Tabella). Oltre oleato o palmitato, qualsiasi altro tipo di acido grasso presente in natura può anche essere utilizzato, purché una versione triziata dell'acido grasso è disponibile per seguire la sua ossidazione.
2. Preparazione del Perfusion Buffer
- In un pallone a 4 L Erlenmeyer, mescolare 200 ml di 20x sale concentrato di soluzione e 200 ml di concentrato NaHCO 3 soluzione 20x con acqua ultrapura 3.6 L. GAS la soluzione per 15 minuti con una miscela di anidride carbonica 5% e ossigeno 95%, e quindi aggiungere 10 ml di / L CaCl 2 soluzione stock 1 mol per impostare la concentrazione del Ca 2+ a 2,5 mmol / L.
ATTENZIONE: Le seguenti operazioni comportano la manipolazione di materiale radioattivo. Indossare adeguato DPI e le norme di sicurezza e di smaltimento dei rifiuti stabiliti dalla ra dell'istituzioneUfficio Sicurezza diazione. - Trasferire 1.750 L KH buffer per una bottiglia di vetro borosilicato 2 L. Aggiungere 250 ml di 8x soluzione concentrata di acido oleico-BSA, 1.802 g D-glucosio, 400 ml di insulina a 0,4 U / ml, e 200 ml (0,2 MCI) [U- 14 C] glucosio. Capovolgere la bottiglia per mescolare. Questo darà 2 L di tampone perfusione completo contenente acido oleico (0,4 mmol / L), D-glucosio (5 mmol / L), e insulina (40 μU / ml).
NOTA: Un volume di 2 L è sufficiente a perfusione un adulto di cuore di ratto lavorare in condizioni non ricircolazione per almeno 60 min. - Utilizzare alcuni del buffer KH non radioattivo per riempire due piatti di dissezione e disporli sul ghiaccio per raffreddare.
3. Preparazione della perfusione
NOTA: L'investigatore può scegliere di utilizzare apparecchio perfusione fuoriserie come quello descritto da Taegtmeyer, bordi e Krebs 11, o uno dei sistemi disponibili in commercio. sistemi di perfusione sono in genere composti delelementi descritti nella figura 1 qui di seguito. Oltre il tubo e di vetro, il resto dell'apparecchio di controllo è opzionale e il suo utilizzo dipenderà esigenze del ricercatore di affrontare la questione sperimentale viene chiesto. Tuttavia, si consiglia l'utilizzo di microelettrodi ossigeno per determinare la concentrazione di O 2 in entrata e in uscita del buffer della circolazione coronarica (Figura 1). Questo aiuterà il controllo investigatore che il cuore è fornito con una quantità adeguata di ossigeno, e che l'apporto di ossigeno non varia tra esperimenti. Inoltre, la determinazione della differenza di ossigeno "artero" può essere utilizzato per calcolare il consumo di ossigeno del miocardio e l'efficienza cardiaca 16,18.
- Accendere il bagno di acqua circolante e impostare a 37 ° C per riscaldare l'apparato di perfusione.
- Accendere il computer e il sistema di acquisizione dati cheessere usato per misurare la funzione cardiaca.
- Collegare i dispositivi di registrazione (catetere di pressione, pressione-volume catetere, micro-elettrodi di ossigeno, misuratori di portata, ecc) per il sistema di acquisizione dati e di eseguire la calibrazione degli strumenti seguenti istruzioni del produttore.
- Riempire il serbatoio tampone con acqua ultrapura. Accendere la pompa peristaltica e scovare l'acqua attraverso tutti i tubi e cristalleria per sciacquare il sistema. Spegnere la pompa peristaltica e assicurarsi che non acqua rimane nel tubo e / o vetreria come questo può influenzare la concentrazione del buffer di perfusione e la preparazione del cuore.
- Collegare un nuovo filtro in fibra di vetro 1,0 micron al sistema. Collegare il serbatoio contenente una miscela di anidride carbonica 5% e ossigeno 95% alla camera ossigenante.
ATTENZIONE: Le seguenti operazioni comportano la manipolazione di materiale radioattivo. Indossare adeguato DPI e le norme di sicurezza e di smaltimento dei rifiuti fissati dall'istituzioneufficio sicurezza di radiazione 's. - Riempire il serbatoio tampone con tampone di perfusione. Accendere la pompa e garantire un riempimento di tutti i tubi e bicchieri con il buffer di perfusione. Eseguire il buffer di perfusione attraverso l'apparecchio perfusione in modalità ricircolo e ossigenato per almeno 30 minuti prima dell'uso.
- Strettamente fissare il tubo di una siringa da 20 ml sotto della camera cardiaca di recuperare l'effluente coronarica. Collegare la punta della siringa alla parte superiore di una valvola a tre vie. Collegare il braccio laterale ad una siringa da 3 ml. Collegare il braccio inferiore, tubi in un contenitore per rifiuti radioattivi liquidi.
NOTA: Quando si utilizza il complesso di acidi grassi-BSA, l'ossigenazione del buffer di perfusione non può essere effettuata mediante gorgogliamento diretto con un tubo di distribuzione del gas in quanto ciò causare un'eccessiva formazione di schiuma nella soluzione. Utilizzare un ossigenatore a membrana (Figura 1) o di una camera ossigenante flusso foglio a tale scopo. Si consiglia vivamente di verificare che un livello adeguato of ossigenazione viene raggiunto inserendo un microelettrodo ossigeno nel circuito di perfusione (Figura 1).
4. Rat Isolamento Cuore e Incannulamento
- Pesare ratto su una scala.
- Preparare una siringa con la dose di anestetico di 150 mg / kg thiobutabarbital idrato sale di sodio e una siringa tubercolina con 200 USP unità di eparina.
- Iniettare thiobutabarbital IP e attendere che l'animale a perdere conoscenza. Altri agenti di induzione possono essere utilizzati purché questo non interferisca con la finalità dell'esperimento (Vedere Scelta dell'anestetico nella sezione discussione sotto).
- Verificare la presenza di un adeguato livello di anestesia confermando la mancanza di punta pizzico reflex. Assicurarsi di mantenere la corretta profondità dell'anestesia per assicurare che l'animale non si sente dolore durante la procedura.
- Una volta che il ratto è completamente privo di sensi e non risponde a pizzico punta, posizionarlo sulla schiena sul tavolo operatorio e secarti ure con nastro adesivo o perni.
- Agganciare la libera dell'addome dei capelli e effettuare un'incisione mediana dell'addome. Non aprire la cavità toracica a questo punto ancora. Spostare lo stomaco e l'intestino da parte per rivelare la vena cava inferiore. Iniettare l'eparina direttamente nella vena cava inferiore e attendere da 5 a 10 secondi prima di procedere.
- forbici Uso tagliare il diaframma ei lati della gabbia toracica per esporre il contenuto della cavità toracica.
- Delicatamente afferrare il cuore tra il pollice, l'indice e il medio e accise sia il cuore e polmoni insieme. Tagliare a livello dell'aorta discendente, facendo attenzione a non danneggiare l'arco aortico e dell'aorta ascendente nel processo. Trasferire immediatamente cuore e polmoni per uno dei piatti dissezione riempito con tampone KH ghiacciata.
- Dopo che il cuore smette di battere, il trasferimento nel secondo piatto dissezione e tagliare eventuali grossi pezzi di tessuto polmonare attaccato, mantenendo il cuore immerso in un tampone KH ghiacciata. Tagliare la discesaing dell'aorta proprio sopra l'arco aortico.
ATTENZIONE: Le seguenti operazioni comportano la manipolazione di materiale radioattivo. Indossare adeguato DPI e le norme di sicurezza e di smaltimento dei rifiuti stabiliti dalla ufficio sicurezza di radiazione dell'istituzione. - Lavare il catetere aortico dell'apparato perfusione per riempire la cannula aortica con tampone caldo e per eliminare l'acqua o l'aria che può essere ancora presente nel tubo. Lasciare il buffer di perfusione gocciolare dalla cannula aortica per minimizzare la possibilità di emboli di aria al momento il cuore è attaccato alla cannula.
- Utilizzando due pinze micro dissezione aprire con cautela l'aorta e far scorrere il cuore su sopra la cannula aortica. Fissare l'aorta sulla cannula con un micro fermaglio e avviare Langendorff perfusione del cuore. Osservare l'inizio del cuore battere di nuovo e di espellere tutto il sangue che rimane nel sistema vascolare coronarico nei secondi dopo l'inizio della perfusione.
NOTA: E 'molto importante eseguire i passaggi 4.6 a 4.10 il più velocemente possibile per evitare danno ischemico irreversibile al cuore. Con l'esperienza, l'intera procedura dovrebbe prendere tra 1 e 2 min. Quando si fa scorrere l'aorta fino sulla cannula, fare attenzione a non superare la radice aortica in quanto ciò potrebbe causare ipoperfusione miocardica e danni alla valvola aortica. - Tie l'aorta alla cannula aortica con una sutura di seta 3-0 e rimuovere il micro clip. Individuare la vena polmonare. Potrebbe essere necessario tagliare i tessuti non cardiache per trovarlo, ma non tagliare troppo dei tessuti non-cardiaci in quanto serviranno a legare l'atrio sinistro alla cannula.
- Lavare la linea atriale sinistra dell'apparecchiatura di perfusione per riempire la cannula atriale con tampone caldo e per eliminare l'acqua o l'aria che può essere ancora presente nel tubo. Fare particolare attenzione a rimuovere eventuali bolle d'aria dall'apparecchio per minimizzare la possibilità di emboli di aria al momento il cuore è attaccato alla cannula.
- Utilizzando due micro forc dissezioneeps delicatamente afferrare l'apertura della vena polmonare e scorrere cuore fino sulla cannula atriale. Può essere necessario riposizionare cuore ruotando delicatamente la cannula atriale e / o aortica per realizzare questo passaggio. In ogni caso, garantire che la procedura non impone eccessiva sollecitazione sul cuore e causare pieghe dell'aorta. Tie l'atrio sinistro alla cannula atriale con una sutura 3-0 seta.
- Aprire la linea atriale e commutare simultaneamente la linea aortica dalla modalità Langendorff alla modalità di funzionamento. Se tampone fuoriesce dall'atrio sinistro, chiudere la linea atriale, tornare la linea aortica per Langendorff perfusione, e utilizzare un altro sutura 3-0 di seta per legare l'atrio sinistro in modo più sicuro alla cannula.
5. Misurazione della funzione cardiaca e raccolta del campione
NOTA: La determinazione dei flussi metabolici richiede la conoscenza del flusso coronarico (CF). Come descritto di seguito, i valori di flusso coronarico può essereottenuto con il semplice uso di un cronometro. Inoltre, la misurazione del flusso aortico (AF) con lo stesso metodo consentirà la determinazione della portata cardiaca (CO = CF + AF), che possono poi essere utilizzati per calcolare la potenza cardiaca (CP) come misura generale della funzione cardiaca mediante la formula CP = CO (m 3 / s) * postcarico (Pa). Un altro metodo disponibile per la valutazione della funzione cardiaca si basa sulla misura in tempo reale della pressione differenziale con un trasduttore di pressione (figure 3 e 4). Anche se facoltativo, le misurazioni più accurate e dettagliate della funzione contrattile cardiaca e emodinamica, inclusa la determinazione di sistolica ventricolare sinistra e funzioni diastolica, saranno raggiunti con l'impiego di una pressione volume (PV) conduttanza catetere. Questa sezione descrive brevemente la cateterizzazione del cuore isolato. Informazioni aggiuntive per quanto riguarda la calibrazione dei cateteri fotovoltaici e l'analisi dei dati con il software statistico può esseresi trovano in riferimenti 14,15.
ATTENZIONE: Le seguenti operazioni comportano la manipolazione di materiale radioattivo. Indossare adeguato DPI e le norme di sicurezza e di smaltimento dei rifiuti stabiliti dalla ufficio sicurezza di radiazione dell'istituzione.
- Se l'esperimento comprende la misurazione diretta della funzione ventricolare sinistra con un catetere, forare l'apice LV con un ago G 26 e introdurre il catetere, attraverso la puntura.
- Quando si utilizza un catetere pressione-volume, posizionare accuratamente il catetere in modo che il suo asse è allineato con l'asse longitudinale LV, con l'elettrodo distale proprio sotto la valvola aortica e adiacente al confine endocardico, e l'elettrodo prossimale appena all'interno della parete ventricolare.
- Sigillare il cuore nella camera di cuore-rivestito acqua e monitorare i parametri funzionali cardiaci con il software di acquisizione dei dati. Avviare la registrazione dopo parametri cardiaci di base sono rimasti stabili per più di 5 minuti.
- Determinare il flusso coronarico da measuring il tempo necessario per riempire il tubo siringa da 20 ml, fissato sotto della camera cardiaca. Dopo la misurazione, aprire il rubinetto a tre vie per svuotare l'effluente coronarico nel contenitore rifiuti liquidi radioattivi.
NOTA: Le misurazioni di flusso possono essere eseguite anche utilizzando un misuratore di portata e flowprobes. - Utilizzare la siringa 3 ml attaccata al braccio laterale del rubinetto a tre vie per recuperare ~ 2 ml di effluente coronarica quando esce cuore. Trasferire 0,5 ml di effluente coronarica in un 2 ml provetta senza tappo microcentrifuga e procedere immediatamente con la determinazione dei tassi di ossidazione del glucosio (sezione 6).
- Trasferire il resto del campione dell'effluente coronarico (~ 1,5 ml) in una provetta senza anticoagulante e memorizzare sul ghiaccio.
- Ripetere i passaggi 5.4 al 5.6 Ma intervalli regolari (ad esempio ogni 5 o 10 min) fino alla fine dell'esperimento perfusione.
- Se si utilizza un catetere pressione-volume, iniettare un bolo di 10 ml di soluzione salina ipertonica (15%)nella linea atriale e destra prima la cannula atriale prima di concludere l'esperimento. Utilizzare questa iniezione in bolo per calcolare la conduttanza in parallelo (V p), che è critica per l'esatta determinazione del volume di 15 cardiaco.
- Rompere il sigillo della camera cardiaca e rimuovere il catetere dal LV se è stato utilizzato nell'esperimento. Recuperare il cuore utilizzando una delle seguenti opzioni:
- Se non vi è alcuna necessità di isolare aree specifiche del cuore per analisi a valle e se l'apparato perfusione consente, linee sia atriali e aortici stretti e immediatamente congelata morsetto cuore sulle cannule utilizzando pinze Wollenberger pre-raffreddato in azoto liquido.
- In alternativa, tagliare il cuore largo delle cannule e rilasciarlo in tampone KH ghiacciata. asciugare rapidamente cuore su un tovagliolo di carta e misurare il suo peso umido. Il cuore può essere sezionato e campioni di tessuto raccolti per misure specifiche. Congelare il tessuto rimanente utilizzando Wollenberger tongs pre-raffreddato in azoto liquido.
- Conservare il tessuto del cuore congelato a -80 ° C fino a quando la determinazione del peso secco (vedere la sezione 8. Calcoli).
6. Determinazione del miocardio glucosio ossidazione Tariffe
NOTA: Il metodo consiste nel recupero quantitativo di 14 CO 2 dall'effluente coronarico con una soluzione di idrossido di intrappolamento di hyamine. Il 14 CO 2 dissolta come H 14 CO3- è recuperato dopo l'acidificazione del buffer con l'acido perclorico. I campioni devono essere trattati subito dopo il loro recupero diffusione passiva di gas tra l'aria e il campione si tradurrà in una perdita di 14 CO 2 nel tempo. Le fiale di scintillazione devono essere accuratamente sigillate con i tappi manicotto di gomma per prevenire la perdita di 14 CO 2 dopo l'aggiunta di acido perclorico. Se necessario, parafilm può essere utilizzato per fissare i tappi manicotto di gomma alflaconi (Figura 2).
- Aggiungere 1 ml di idrossido di 10x concentrata di hyamine di fiale di scintillazione di vetro (un flaconcino per campione + due fiale in più per la determinazione dell'attività di fondo).
ATTENZIONE: idrossido di hyamine è altamente tossico e provoca gravi ustioni. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per la movimentazione e lo stoccaggio adeguato. - Con una pinzetta delicatamente trasferire il 2 ml provetta senza tappo microcentrifuga contenente il campione dell'effluente 0,5 ml coronarica ad una fiala pre-riempita con l'idrossido di hyamine. Utilizzare 0,5 ml di tampone di perfusione per la determinazione dell'attività di sfondo.
- Tappare la fiala con un tappo di manicotto di gomma. Parafilm può essere usata per fissare sigillatura del flacone. Usando una siringa da 1 ml e un ago lungo 23 G, iniettare 200 ml di acido perclorico (60% w: w%) attraverso il tappo manicotto in gomma e direttamente nel tubo senza cappuccio 2 ml.
NOTA: L'effluente coronarica dovrebbe diventare bianco a causa della precipitazione di BSA. - Lasciate che i fiale sdurante la notte.
ATTENZIONE: L'acido perclorico è altamente corrosivo, può agire come un ossidante e / o causare un pericolo di esplosione. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per la movimentazione e lo stoccaggio adeguato. - Il giorno successivo, rimuovere i tappi manicotto di gomma. recuperare accuratamente ogni 2 ml provetta senza tappo con le pinzette e lavare il fondo del tubo sulla parte superiore della fiala aperta con 1 ml scintillazione cocktail per recuperare tutti dell'idrossido di hyamine. Eliminare il tubo senza cappuccio in un contenitore di rifiuti radioattivi adeguatamente etichettati.
- Aggiungere un ulteriore scintillazione cocktail 9 ml per flaconcino. Aggiungere 0,5 ml di tampone di perfusione direttamente a due fiale riempiti con 10 ml di liquido di scintillazione cocktail per la determinazione dell'attività specifica. Agitare vigorosamente le fiale a mano e attendere almeno 6 ore per consentire le bolle d'aria per dissipare prima di misurare in un contatore a scintillazione liquida in modo appropriato istituire per esperimenti dual etichette.
NOTA: utilizzare flaconcini di vetro trasparente per visualizzare la NEedle quando penetrante i tappi manicotto di gomma. Non far cadere l'acido perclorico in idrossido di hyamine come questo rovinerà la reazione. Aggiungendo i rilasci di acido perclorico al 14 CO 2 dall'effluente coronarica in aria. Sebbene i flaconcini devono essere ermeticamente sigillati e tutte le 14 CO 2 devono essere intrappolati nella hyamine di idrossido, si raccomanda di eseguire questa analisi sotto la cappa.
7. Determinazione del miocardio Oleate ossidazione Tariffe
NOTA: Il metodo si basa sulla separazione quantitativa e recupero di 3 H 2 O dall'effluente coronarica utilizzando una forte resina scambiatrice di anioni. Diversamente il recupero di 14 CO 2, non vi è alcun problema di stabilità del campione e l'effluente coronarica può essere mantenuto su ghiaccio o conservato in freezer prima dell'esecuzione del test.
- Preparare anioni colonne resine a scambio (una colonna per campione + two colonne aggiuntive per la determinazione dell'attività sfondo) compilando la punta di tubi siringa da 3 ml con lana di vetro. Aggiungere il slurry resina / acqua con una pipetta di trasferimento fino resina raggiunge il contrassegno 2 ml sul tubo siringa.
- Lavare la resina facendo passare 2 ml di acqua ultrapura attraverso la colonna. Ripetere questa operazione altre due volte.
- Posizionare fiale di scintillazione aperte sotto le colonne e caricare 0,5 ml di effluente coronarico per colonna. Caricare 0,5 ml di tampone di perfusione per la determinazione dell'attività di sfondo.
- Lavare le colonne successivamente con 0,5, 1 e 2 ml di acqua ultrapura. Dopo l'eluizione avviene, eliminare le colonne in un contenitore per rifiuti radioattivi adeguatamente etichettati.
- Aggiungere scintillazione cocktail 13 ml di liquido per flaconcino scintillazione. Aggiungere 0,5 ml di tampone di perfusione direttamente a due fiale riempiti con 13 ml di liquido cocktail di scintillazione per la determinazione della specifica attività. Agitare le fiale con forza ed attendere almeno 6 ore prima di misurare in un liquido scicontatore ntillation opportunamente configurato per esperimenti dual etichette.
8. Calcoli
- Se non già fatto, determinare il peso umido di tutta perfuso cuore.
NOTA: Non permettere il tessuto congelato per scongelare se le analisi molecolari e biochimici devono essere successivamente eseguita sul tessuto rimanente. - Determinare il peso umido di un campione di tessuto da tutta nei profumi-cuore (utilizzare circa il 15 al 30% di tutto il cuore). Posizionare il campione di tessuto in forno a 50 ° C per una notte e misurare il suo peso a secco. Utilizzare il rapporto in peso peso umido / secco del campione di tessuto per determinare il peso secco del tutto il cuore in grammi (g peso secco.).
- Per ogni punto x volta esprimere il valore della coronaria CF flusso x in ml / min.
- Determinazione della velocità di ossidazione del glucosio
- Nella media i due disgregazione / min (DPM) i valori misurati per l'attività di fondo di 14 C per determiNe il fattore di correzione 14C dpm ba.
- Determinare il 14 C in media valore dell'attività specifica 14C dpm sa.
- Determinare la radioattività specifica di glucosio in dpm / mmol (F Glu) applicando la formula
NOTA: Dove n Glu (mmol) = C Glu (mmol / L) * volume del campione (L) = 2.5 quando si utilizza il glucosio a 5 mmol / L e un campione da 0,5 ml. - Determinare per ogni punto x il tasso di produzione di 14 CO 2 in dpm / min (A) applicando la formula
NOTA: Dove Vol x (ml) = 0.5 - Dividere un dal valore determinato di peso del cuore a secco per ottenere il tasso normalizzato di produzione di 14 CO 2 (una norma
- Applicare la formula GO = A Norma / F Glu per ottenere il tasso di ossidazione del glucosio (GO) in micromol di glucosio / min per g peso secco.
- Determinazione del tasso di ossidazione Oleate
- La media dei valori di due disintegrazione / min (DPM) misurati per l'attività di fondo di 3 H per determinare il fattore di correzione 3H dpm ba.
- Determinare il 3 H media valore della specifica attività 3H dpm sa.
- Determinare la radioattività specifica di oleato in dpm / mmol (F Ol e) applicando la formula
NOTA: Dove n Ole (mmol) = C Ole (mmol / L) * volume del campione (L) = 0.2 quando si usa oleato a 0,4 mmol / L e un campione da 0,5 ml. - Determinare per ogni time punto x il tasso di produzione di 3 H 2 O in dpm / min (B) applicando la formula
NOTA: Dove Vol x (ml) = 0.5 - Dividere B dal valore determinato di peso del cuore a secco per ottenere normalizzato tasso di produzione di 3 H 2 O (B Norm) in dpm / min per g peso secco.
- Applicare la formula = OO B Norma / F Ole per ottenere il tasso di ossidazione oleato (OO) in micromol di oleato / min per g peso secco.
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Representative Results
Due esperimenti di rappresentanza sono descritte nelle figure seguenti. In entrambi i casi, il cuore di 16 settimane di età maschio Sprague Dawley di ratto è stato isolato e perfuso in posizione di lavoro con tampone KH preparato secondo il protocollo precedente. In ogni esperimento, il cuore è stato sottoposto ad una condizione di stress di influenzare lavoro cardiaco. funzione contrattile cardiaca è stata valutata mediante registrazione continua della pressione differenziale attraverso l'inserimento di un trasduttore di pressione nella linea aortica e determinazione della potenza cardiaca. Le conseguenze di ciascuna condizione di stress sulla utilizzazione di substrati energetici fornendo stati simultaneamente determinati misurando i tassi di glucosio e ossidazione oleato.
Nel primo esperimento, un aumento acuto del carico di lavoro è stato simulato dopo 20 min di perfusione a carico di lavoro vicino fisiologica aumentando la postcarico del 40% (ottiene manualmentesollevando la camera di deflusso aortica) e aggiungendo epinefrina (1 mmol / L) al buffer di perfusione (Figura 3A). Frequenza cardiaca, che può essere determinato misurando l'intervallo tra i valori di picco di pressione sistolica sulla traccia pressione del polso, immediatamente aumentato di oltre il 50% dopo induzione workjump (Figura 3B). Potere cardiaco aumentato di oltre il 40% a workjump, accompagnato da un aumento in entrambi i tassi di glucosio e ossidazione oleato (Figura 3C). I risultati mostrano che, sotto lo stress di un aumento acuto del carico di lavoro, il cuore si adatta rapidamente per aumentare la produzione di energia per la contrazione sia da glucosio e ossidazione degli acidi grassi. Tuttavia, l'aumento relativo tasso di ossidazione è più importante per il glucosio (~ 2,8 volte) rispetto era per oleato (~ 1,3 volte). Aumento della dipendenza da carboidrati ossidazione per far fronte al carico di lavoro supplementare è una caratteristica tipica del cuore dei mammiferi pressione sovraccarico 18
Nel secondo esperimento, il cuore è stato perfuso in condizioni basali per 20 minuti seguiti da 15 min totale, globale, ischemia normotermica (indotta chiudendo sia il atriale e linee aortica) e 30 min riperfusione (Figura 4A). In queste condizioni sperimentali, una pressione del polso quasi normale fu restaurata tra 2 e 3 minuti dopo l'inizio della riperfusione (Figura 4B). Potenza cardiaca rapidamente aumentata al di sopra dei valori pre-ischemia nei primi 10 min di riperfusione per poi scendere a valori quasi basali (Figura 4C). Rispetto al basale, il tasso di ossidazione oleato è aumentato durante la riperfusione, mentre l'ossidazione del glucosio rapidamente tornati ai valori pre-ischemici livelli. Per misurare simultaneamente funzione contrattile e entrambi i tassi di ossidazione del substrato si può chiaramente comprendere che, nelle attuali condizioni sperimentali, la variazione dei tassi di ossido acido grassozione è il principale determinante per i cambiamenti nella quantità di lavoro generata a riperfusione. L'interruttore più in alto verso l'utilizzo di acidi grassi dopo l'ischemia è una caratteristica ben estalished-del cuore riperfuso 19.
Figura 1:. Semplificata Schema del isolata Apparato Cuore Lavorare Rat Il buffer di Krebs-Henseleit integrato con la soluzione di acido grasso-BSA è ossigenato passando attraverso un ossigenatore a membrana. valori di precarico e postcarico cardiaco tipici per un cuore di ratto perfuso in condizioni simili a quelle fisiologiche sono indicati. Le impostazioni possono essere modificate regolando l'altezza del serbatoio atriale e la camera di troppo pieno aortica. I tubi di siringhe graduate sono stati posti sotto della camera cuore e la camera di deflusso aortica per misurare il flusso coronarico e flusso aortico, rispettivamente. Il flusso dibuffer può essere interrotto (quando si misurano i flussi aortica e coronariche) o reinstradata (passaggio dal Langendorff alla modalità di lavoro) attraverso l'uso di rubinetti a tre vie. Le frecce rosse indicano il posizionamento ottimale per in-line microlelectrodes ossigeno per determinare la differenza di ossigeno "artero-venosa". In linea sonde di flusso e trasduttori di pressione possono essere collocati nelle linee di precarico e postcarico per misurare sia i tassi e le pressioni (frecce verdi) di flusso atriale e aortica. pressioni ventricolare sinistra e volumi possono anche essere registrati con un catetere PV inserito attraverso l'apice del ventricolo sinistro. Non mostrato sulla figura è la camicia d'acqua che circonda tutti gli elementi in vetro e il tubo perfusione nel colore blu scuro. Questi elementi camicia d'acqua sono tutti collegati in serie tramite un tubo in un bagno d'acqua che circola a 37 ° C. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di tla sua figura.
Figura 2:. Rappresentazione delle diverse fasi coinvolte nel setup della trappola di CO 2 (A) Aggiungere 1 ml di idrossido di 10x concentrata di hyamine. (B) Aggiungere un campione da 0,5 ml contenuta in un tubo senza cappuccio. (C) Sigillare la fiala. (D) Iniettare 200 ml di acido perclorico (60% w: w%). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati Rappresentante di un esperimento Workjump (A) registrazione continua della pressione differenziale.. (B) Breve inregistrazione Terval raffigurante la variazione di pressione del polso, al momento dell'iniziazione workjump. (C) i tassi cardiache di ossidazione del glucosio (traccia rossa con cerchi) e l'ossidazione oleato (traccia blu con quadrati) sono stati determinati mediante analisi dell'effluente coronarica in un intervallo di 5 minuti. Potenza cardiaca (traccia nera con triangoli) è stata determinata dalla misurazione della gittata cardiaca, allo stesso tempo i campioni di effluenti coronarici sono stati recuperati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rappresentante dei risultati di un esperimento ischemia-riperfusione (A) registrazione continua della pressione di impulso.. (B) registrazione a intervalli brevi raffigurante il recupero della funzione contrattile dusuonare i primi 5 minuti di riperfusione. (C) tassi cardiache di ossidazione del glucosio (traccia rossa con cerchi) ed ossidazione oleato (traccia blu con piazze) sono stati determinati mediante analisi dell'effluente coronarica ad un intervallo di 5 min, tranne durante i primi 5 minuti di riperfusione cui analisi sono state eseguite a un intervallo di 1 min. Potenza cardiaca (traccia nera con triangoli) è stata determinata dalla misurazione della gittata cardiaca, allo stesso tempo i campioni di effluenti coronarici sono stati recuperati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Dettagli Il protocollo precedente i metodi per quantificare simultaneamente il flusso di substrato attraverso l'ossidazione del glucosio e ossidazione degli acidi grassi nel cuore isolato di ratto di lavoro. Le misurazioni possono essere sovrapposte ai parametri funzionali cardiaci registrati per determinare il rapporto tra substrati metabolismo e lavoro cardiaco in condizioni basali e di stress (variazione del carico di lavoro, ischemia-riperfusione, ecc ...). E 'anche possibile valutare come il rapporto metabolismo / contrazione è influenzata dalle condizioni preesistenti come l'insufficienza cardiaca e diabete. Inoltre, cuore di roditori geneticamente modificati può essere utilizzato per interrogare l'effetto di una proteina specifica sul metabolismo e la funzione cardiaca. Infine, l'effetto di farmaci e altri fattori che circolano su questi parametri può essere testato singolarmente. Poiché il flusso di glucosio attraverso la glicolisi non sempre correlata con la velocità di ossidazione del glucosio, può essere informativa di seguire i tassi di flusso del glucosio attraverso entrambe le vie in un unico ambiente sperimentale.
I tassi di glicolisi possono essere determinati aggiungendo [5- 3 H] glucosio al buffer di perfusione, perché il rilascio di 3 H 2 O è determinata dall'attività del passo enolasi della glicolisi 20. In alternativa [2- 3 H] glucosio, che porta alla produzione di 3 H 2 O nella fase fosfoglucosio isomerasi della glicolisi, può essere utilizzato per interrogare i tassi di assorbimento di glucosio da parte del muscolo cardiaco 16,17,21. La possibilità di scegliere tra più traccianti radioattivi per studiare il destino di glucosio a diversi livelli del suo catabolismo è un altro esempio della versatilità della tecnica. Tuttavia, poiché tutti gli misurazioni di flusso basano sul recupero quantitativo o 3 H 2 O o 14 CO 2 dall'effluente coronarica, solo due radiomarcatotraccianti ED (una 3 H-etichettato e l'altro marcato con 14 C) può essere utilizzato nel buffer di perfusione alla volta.
considerazioni metodologiche
Ci sono alcune limitazioni inerenti la misura del flusso metabolico cardiaco e funzione che utilizza questo protocollo. Sebbene l'uso di tampone KH permette un controllo totale sulla composizione del perfusato, la rilevanza fisiologica di questo apparato sperimentale può essere discutibile. In primo luogo, l'uso di una soluzione cristalloide su sangue è noto per avere un impatto negativo emodinamica cardiaca e resistenza all'ischemia 22,23. In secondo luogo, il buffer di perfusione descriviamo qui manca una varietà di ormoni e sostanze nutritive che possono modulare direttamente il metabolismo cardiaco e di conseguenza un impatto la risposta del cuore ad una condizione di stress simulato. In effetti, il cuore dei mammiferi è un onnivoro metabolico e può, oltre a glucosio e acidi grassi, utilizzare altri substrati a fulfill suo fabbisogno energetico (lattato, piruvato, corpi chetonici, a catena ramificata aminoacidi). Ci sono prove che alcuni di questi substrati svolgono un ruolo importante nel rimodellamento metabolico del cuore malato 24,25. E 'del tutto possibile che il ricercatore di aggiungere questi substrati al buffer di perfusione, di modulare la loro concentrazione in modo da imitare più da vicino diverse condizioni fisiologiche (ad esempio stomaco pieno rispetto digiuno) o malattia Uniti, e di seguire i loro tassi di ossidazione utilizzando il appropriati traccianti radioattivi 26,27. Il metabolismo dei trigliceridi può anche essere rintracciato, e in tal caso si raccomanda di evitare l'uso di eparina prima escissione del cuore come questo indurrà il rilascio di lipoproteina lipasi da endotelio e ridurre significativamente l'estrazione di trigliceridi dal buffer 28. Con un'attenta selezione dei traccianti radioattivi, l'incorporazione di radioattività varmetaboliti tessuto ious possono anche essere misurati dopo perfusione di determinare parametri quali de novo sintesi dei trigliceridi, fatturato glicogeno, oi tassi di sintesi proteica 18,29,30. In altre parole, il ricercatore può lavorare con una vasta gamma di combinazioni di substrati / ormoni e concentrazioni. La scelta della composizione buffer principalmente dipenderà dagli obiettivi dell'esperimento. Poiché queste condizioni di buffer controllate creare un modello fisiologico "semplificato", deriva dalla ex vivo di lavoro esperimenti di perfusione cardiaca devono essere interpretati con cautela e, se possibile, i dati dovrebbero essere ulteriormente validati in vivo.
Scelta dell'anestetico
L'anestetico utilizzato su ratti prima di escissione del cuore devono essere selezionati con cura basata su gli effetti accertati sulla funzione cardiopolmonare e il metabolismo per garantire che questo non interferisca con l'esperimento da eseguireed. Sia anestetici iniettabili e inalatori rapidamente inducono iperglicemia e gradi di intolleranza al glucosio che possono influenzare il metabolismo cardiaco durante la perfusione 31,32. Rispetto ad altri agenti, gli effetti a breve termine di barbiturici (pentobarbital e thiobutabarbital) sulla omeostasi del glucosio sono relativamente trascurabili 31. Tuttavia, intraperitoneale anestesia pentobarbital prima di escissione cuore è stato dimostrato di diminuire la gittata cardiaca, compromettere la funzione ventricolare sinistra, e aumentare il rilascio di lattato miocardico in un ex vivo protocollo di ischemia-riperfusione 33. L'effetto inotropo negativo che pentobarbital ha sul cuore isolato di ratto è suggerito per essere causato da accumulo di tessuto del farmaco 34. Al contrario l'uso di anestetici inalatori, che sono più rapidamente lavati fuori dal tessuto cardiaco, è associata con una migliore funzione contrattile ex vivo 33. anestetici volatili possono effettivamente fornire cardioprotection durante ischemia-riperfusione attraverso un meccanismo che coinvolge l'apertura dei canali mitocondriali K ATP e aumentato legame di esochinasi ai mitocondri 32. In sintesi, il tipo di anestetico usato in un isolato lavoro protocollo cuore perfusione è una variabile importante nella valutazione di parametri sia funzionali e metabolici che possono influenzare direttamente i risultati dell'esperimento. Pertanto, il tipo e la dose di anestetico usato devono sempre essere riportati nella sezione Metodi di un esperimento, e questi parametri non devono essere modificati tra esperimenti che sono destinate ad essere confrontati.
Radioisotopi nei perfusione cuore
Tutte le misurazioni di flusso eseguite con il protocollo precedente vengono eseguite in modalità senza ricircolo, il che significa che l'effluente coronarica viene scartato invece di essere restituito al serbatoio tampone (Figura 1). L'investigatore può piuttostoscegliere di utilizzare l'apparecchio perfusione in modalità ricircolo, che ha il vantaggio di richiedere un volume molto più piccolo di tampone e quindi la radioattività di operare. Tuttavia, riciclo dell'effluente coronarica compromette la composizione a regime del buffer di perfusione attraverso il recupero dei sottoprodotti derivanti da attività metabolica del cuore (compreso lattato, ma anche 3 H 2 O e H 14 CO3-), che complica la determinazione flussi metabolici e può anche alterare la funzione cardiaca nel corso del tempo 35. Questi problemi sono evitati in modalità non-ricircolo. A causa della quantità di radioattività e del grande volume di tampone perfusione utilizzato in un singolo esperimento, l'investigatore dovrebbe essere particolarmente prudenti quando si usa il cuore di ratto lavorare in flusso metabolico analisi. Quando si utilizza un apparato di perfusione per la prima volta, si raccomanda di effettuare diversi esperimenti finti con tampone non radioattivo per diventare conoscenza delladiverse fasi del protocollo e con le procedure di sicurezza. Il montaggio del cuore sulle cannule è un passo particolarmente sensibile perché richiede stabilire uno stretto contatto con l'attrezzo e perché tampone può perdere o sparare fuori da uno dei vasi sanguigni recisi del cuore. L'apparato perfusione descritto da Taegtmeyer e colleghi 11 ha il vantaggio di includere un serbatoio Langendorff che è del tutto indipendente dal resto dell'apparato perfusione, e può quindi essere riempito con tampone KH non radioattivo per evitare fuoriuscite di materiale radioattivo durante cannulazione del cuore . Indipendentemente dal sistema utilizzato, gli esperimenti devono essere eseguite in un'area dedicata ad accesso limitato. La stanza dovrebbe includere un lavandino e una fornitura di acqua ultrapura per effettuare la preparazione buffer e pulizia delle attrezzature contaminati nella stessa area. Gli investigatori dovrebbero lavorare a stretto contatto con l'ufficio di sicurezza di radiazione della loro istituzione per stabilire specifici contenimento, controllo e procedure di decontaminazione.
Pulizia dell'apparato perfusione
La pulizia dopo sperimentale dell'apparato perfusione è un passaggio fondamentale che viene troppo spesso trascurato e, se non eseguita con cura, responsabile della maggior parte dei problemi legati alla scarsa riproducibilità sperimentale. Il buffer di perfusione ricco di sostanze nutritive e l'alta temperatura del sistema di perfusione forniscono condizioni ideali per la crescita di batteri e funghi. L'utilizzo di proteine (insulina, BSA) e acidi grassi nel buffer di perfusione aggiunge un altro grado di complessità alla procedura di pulizia perché questi composti si attacchi alla superficie del tubo e bicchieri, rendendole difficili da stanare dell'apparecchiatura. L'uso di radioisotopi anche imporre vincoli aggiuntivi quali la creazione di una zona di contenimento dedicata in laboratorio per la manipolazione del materiale contaminato e smaltimento di un solidod rifiuti radioattivi liquidi. Pertanto, la procedura di pulizia adeguata sarà principalmente dipenderà sia la composizione del tampone di perfusione e del tipo di apparecchiatura utilizzata perfusione. Se si utilizza un apparato commerciale, visitare il sito web del produttore o contattare il servizio clienti per ottenere informazioni su come eseguire la pulizia senza danneggiare nessuno dei componenti dell'apparato. In generale, tutte le parti in vetro e plastica possono essere lavati con una vasta gamma di saponi. detersivi alimentati enzimi attivi sono particolarmente utili per eliminare acidi grassi-BSA residui. La maggior parte dei contaminanti saranno rimossi eseguendo 0,1 M HCl o 0,1 M HNO 3 attraverso l'apparecchio per diverse ore. Si ottiene risultati di pulizia soddisfacenti dal lavaggio dell'impianto prima con HCl 0,1 M, poi con una fresca 1% (w: v) soluzione di detergente alimentato enzima attivo preparato in acqua calda, ed infine risciacquando il sistema con acqua ultrapura. Quando si utilizza un apparato di perfusione fuoriserie di quelli originariamente described da Taegtmeyer e colleghi 11, può essere più facile e più efficace smontare completamente l'apparato alla fine di ogni giornata sperimentale. Il vetro viene pulito da un 15 min immersione in un bagno concentrata di un acido cromico e acido solforico in miscela. Le parti in plastica e il tubo in PVC possono essere lavati con un detergente senza residui. Abbiamo trovato è effettivamente più veloce e più affidabile per sostituire interamente il tubo in PVC ogni giorno, perché limita la manipolazione di materiali contaminati da radiochimici e perché impedisce lasciare residui di detergenti dietro. In ogni caso, lo sperimentatore deve applicare le seguenti regole: 1- Pulire l'apparato perfusione e tutte le attrezzature sporche subito dopo aver completato l'esperimento di perfusione. In attesa servirà solo a rendere la pulizia più difficile e richiede tempo. 2- Controllare il bagno di circolazione del sistema camicia d'acqua regolarmente per contaminazioni. L'uso di un condizionatore di acqua aumenterà l'intervallo tra cpendente del bagnomaria. 3- Dopo la pulizia, accuratamente risciacquati e tubi con acqua del rubinetto più volte e finire risciacquo con acqua ultrapura per rimuovere residui di detergenti. 4- Due preparati cardiaci consecutivamente avendo quando la dissezione è stato accuratamente eseguita e il buffer di perfusione curata sono suscettibili di indice di contaminazione del dispositivo (sia da batteri o da residui di solvente). Se questo accade, il lavaggio e risciacquo procedure devono essere interamente ripetuta.
Scaling fino al cuore del mouse
Anche se il protocollo precedente concentra sulla determinazione dei tassi metabolici nel cuore isolato di ratto di lavoro, le stesse procedure possono essere applicati al cuore del mouse con poche modifiche alla perfusione e acquisizione dati attrezzature 36. Grazie alla sua dimensione più piccola del cuore isolato del mouse di lavoro è tecnicamente più impegnativo, ma a causa del suo modo significativoportata minore ha il vantaggio di richiedere un volume molto più basso di tampone perfusione. Il gran numero di modelli murini geneticamente modificati che sono già disponibili rende anche il cuore isolato topo lavoro molto interessante per studiare la funzione di un singolo prodotto genico sul metabolismo cardiaca e rimodellamento funzionale. Tuttavia, i recenti progressi tecnologici nella modifica del genoma e un catalogo in rapida crescita di ratti transgenici e knockout stanno rapidamente colmando il divario tra le due specie di roditori. Inoltre, il ratto è stato a lungo elogiato come un modello animale superiore per studiare le malattie cardiovascolari, perché la sua fisiopatologia imita da vicino le condizioni umane 37. Per queste ragioni, riteniamo che l'isolato che lavora cuore di ratto continuano a detenere un posto importante in epoca moderna della ricerca cardiovascolare.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100 - 200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100 - 200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10x Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 ml Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 ml HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
References
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- Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms. Circulation. 105, 1861-1870 (2002).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).
- Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure. Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).
- Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation--a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart. Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).
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